CC BY
43
УДК 579.66:547.94
Е. В. Комлева (асп.), А. А. Шараева (студ.), Н. И. Петухова (к.биол. н., доц.), В. В. Зорин (чл.-корр. АН РБ, д.х.н., проф., зав. каф.)
Выделение и исследование свойств низкомолекулярного сурфактанта бактерий Serratia sp. НС-Р1
Уфимский государственный нефтяной технический университет, кафедра биохимии и технологии микробиологических производств 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел. (347) 2431935, e-mail: bio2@rusoil.net
E. V. Komleva, A. A. Sharaeva, N. I. Petukhova, V. V. Zorin
Isolatе and investigatе behaviours low-molecular surfactant bacterium Serratia sp. НС-Р1
Ufa State Petroleum Technical University 1, Kosmonavtov Str., 450062 Ufa, Russia; рh. (347)2 431935; е-mail: bio@rusoil.net
Исследован фракционный состав пигментов, продуцируемых новым почвенным изолятом Serratia sp. НС-Р1. Выделено неокрашенное соединение С1, обладающее смачивающей активностью. Показано, что выделенный биосур-фактант в концентрации 9 мг/л проявляет высокую антибактериальную активность в отношении грамположительных бактерий Micrococcus sp., Bacillus sp., Staphylococcus aureus.
Ключевые слова: антибактериальная активность; биосурфактанты; микроорганизмы.
Fractional composition of pigments produced by new soil isolate Serratia sp. HC-P1 was researched. Uncoloured compound with wetting ability was extracted. Biosurfactant in concetration 9 mg/l shows high antimicrobial activity to gram-positive bacteria Micrococcus sp., Bacillus sp., Staphylococcus aureus.
Key words: antimicrobial activity; biosurfactants; microorganisms.
Известно, что бактерии рода Serratia способны продуцировать продигиозины, обладающие антимикробной, противомалярийной, иммуносупрессивной 1-3 и противораковой активностями 4 5. Совместно с продигиозинами некоторые штаммы серратий могут синтезировать и другие практически важные биологически активные вещества, такие как ооцидины — ингибиторы роста оомицетов, возбудителей гнили растений 6, серраветтины (серратомоли-ды) — циклические пептидные антибиотики, карбопенем — антибактериальный ß-лактам-ный антибиотик широкого спектра действия 7.
Особый интерес представляет серраветтин W1— биосурфактант, обладающей смачивающей активностью 8, для которого недавно была показана способность индуцировать задержку клеточного цикла и апоптоз в раковых клеточных линиях лейкемии, лимфомы, миеломы, карциномы, меланомы и саркомы 9 с отсутствием токсичности к нормальным клеткам.
Ранее из почвенных образцов, загрязненных нефтью, нами был выделен штамм Serratia sp. НС-Р1, продуцирующий красно-розовые пигменты, основной из которых был идентифицирован как продигиозин 10.
В настоящей работе методом ТСХ было обнаружено, что при обработке биомассы этих бактерий ацетоном наряду с пигментированными фракциями экстрагируется также неокрашенное соединение (условно обозначено как С1), характеризующееся коэффициентом хроматографической подвижности 0.83 близким к описанному в литературе значению Rf для серраветтина W111.
При фракционировании препарата экстракта биомассы штамма НС-Р1 методом колоночной хроматографии на силикагеле с использованием двух систем растворителей удалось отделить фракцию, содержащую соединение С1 от окрашенных фракций (рис. 1).
Дата поступления 03.12.09
5 4,5 4
s з,5
3
а
о
н 2,5 £
2 1,5 1
0,5 0
-- 1 п
1 '1 Л i >
1 \
i i
i ' * i \ __
\ ! *
\ i » \ i <
\ i \
J \__ ! \
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
При исследовании свойств соединения С1 было обнаружено, что оно также как и серра-
о
веттины , проявляет смачивающую активность, позволяя водной капле смачивать гидрофобную поверхность (рис. 2).
0 44 76 108 140 175 210 241 277 294 321 355 объем элюата, мл -пигмент----соединение С1
Носитель — силикагель 60 (0.063—0.2мм); колонка уравновешена гексаном; элюирование проводилось смесями растворителей: гексан-этилацетат (2:1), ацетонитрил-вода (80:20); Т 25 оС. Рис. 1. Фракционирование препарата экстракта биомассы Serratia sp. НС-Р1.
б
Рис. 2. Фотография капель воды (а) и суспензии клеток Serratia sp. НС-Р1 (б) на гидрофобной поверхности.
Исследование антибактериальной активности полученного соединения С1 в отношении некоторых грамположительных (Micrococcus sp., Bacillus sp., Staphylococcus aureus) и грамотрицательных (Pseudomonas putida,
а
w о
w о и
35000 30000 25000 20000 15000 10000 5000 0
5000000 4000000 3000000 2000000 1000000 0
A
25 50 100 соединение С1, мг/л
Pseudomonas putida i Escherichia coli
Б
□ Micrococcus sp.
□ Bacillus sp.
□ Stuphylococcus aureus
0
6 9 12 25 50 соединение С1, мг/л
Рис. 3. Влияние соединения С1 на рост грамотрицАтельнъж (А) и грамположительных (Б) бактерий.
0
Escherichia coli) бактерий показало, что это соединение, не оказывает значительного инги-бирующего эффекта на рост грамотрицатель-ных бактерий (рис. 3 А). Наибольший ингиби-рующий эффект проявлялся только при высоких концентрациях препарата (около 50 мг/л) в отношении E. coli.
Однако, в случае грамположительных бактерий было обнаружено, что данный препарат оказывает высокое антибактериальное действие. Минимальная ингибирующая концентрация препарата составила не более 9 мг/л (рис. 3 Б).
Полученные данные позволяют рассматривать исследованный препарат как потенциальное терапевтическое средство, что актуализирует дальнейшее его исследование с целью разработки эффективного метода получения с помощью бактерий Serratia sp. НС-Р1.
Экспериментальная часть
Бактерии выращивали на агаризованной питательной среде на основе панкреатического гидролизата рыбной муки (г. Махачкала), содержащей 1% глицерина, при температуре 2527 оС в течение 3 сут.
Для выделения соединения С1 биомассу собирали с поверхности агаризованной среды и экстрагировали ацетоном. Полученный экстракт сушили сульфатом натрия, концентрировали на роторно-пленочном испарителе и очищали колоночной хроматографией. Колоночную хроматографию проводили на колонке уравновешенной гексаном с использованием силикагеля 60 (0.063—0.2 мм). Количество используемого силикагеля составляло 40:1 по отношению к количеству препарата. В качестве элюента использовали смешанные растворители гексан-этилацетат (2:1) и ацетонитрил-вода (80:20).
Окрашенные фракции по 10 мл исследовали на определение максимума поглощения в
диапазоне 300—600 нм. Неокрашенные фракции, вымываемые ацетонитрилом, исследовали на содержание серраветтина методом ТСХ. Количество серраветтина определяли методом ТСХ на пластинках марки «Sorbfil» АФ-Ф-УФ в системе хлороформ: этанол: 5М NH4OH 80:25:4. Пластинки проявляли 50% серной кислотой и выдерживали при 200 оС в течение 20 минут.
Исследование биологической активности препаратов выделенных фракций пигмента в отношении бактерий и грибов осуществляли как описано в работе 3.
Литература
1. Gerber N.N. // CRC Crit. Rev. Microbiol.-1975.- V. 3.- P. 469
2. A. Khanafary, M. Mazaher Assadi, F. Ahmadi Fakhr // Online J. of Biol. Sciences.-2006.-1.
3. Комлева Е. В., Петухова Н. И., Бадретди-нов А. Д., Султанова Л. М., Зорин В.В. // БХЖ.- 2007.- Т. 14, № 1.- С. 159
4. Liora Z. Ron, Rosenberg E. // Env. Microbiol.-2001.- V. 3.- P. 229.
5. Rozenberg E., Ron E.Z. // Appl. Microbiol Biotechnol.- 1999.- V. 52.- P. 154.
6. Isaka M., Jaturapat A., Kramyi J., Tanticharoen M., Thebtaranonth Y. // Antimicrob. Agents Chemother.- 2002.- V. 46.- P. 1112.
7. Li H., Tanikawa T., Sato Y., Nakagawa Y., Matsuyama T.// Microbiol. Immunol.- 2005.-№ 49.- P. 303.
8. Wei Y-H., Chen W.-C.// J. of Bioscience and Bioengineering.- 2005.- Vol. 99.- № 6.-P. 616.
9. Cyclic depsipeptid as chemotherapeutic anticancer agent // US 2005/0239694 Al.-Pub. Date Oct. 27, 2005.
10. Петухова Н.И., Хузина А.В., Файзрахманова Л.С., Муслухов Р.Р., Комлева Е.В., Зорин В.В. // Баш. хим. ж.- 2009.- Т.16, №1.- С. 106.
11. Li H., Tanikawa T., Sato Y., Nakagawa Y., Matsuyama T. // Microbiol. Immunol.- 2005.-№ 49.- P. 303.
