Научная статья на тему 'Антибиотики штамма Photorhabdus luminescens Zmi - симбионта энтомопатогенных нематод'

Антибиотики штамма Photorhabdus luminescens Zmi - симбионта энтомопатогенных нематод Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

CC BY
283
47
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Журнал
Антибиотики и химиотерапия
WOS
Scopus
ВАК
Область наук
Ключевые слова
АНТИБИОТИКИ / ВЫДЕЛЕНИЕ / ИДЕНТИФИКАЦИЯ / ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА / АНТИБИОТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ / ТЕСТ-СИСТЕМА «ЭКОЛЮМ» / TEST-SYSTEM «ECOLUM» / PHOTORHABDUS LUMINESCENS / 3 / 5-DIHYDROXY-4-ISOPROPYLSTILBENE / ANTHRAQUINONE DERIVATIVES / IDENTIFICATION / PHYSICOCHEMICAL PROPERTIES / ANTIBIOTIC ACTIVITY

Аннотация научной статьи по биологическим наукам, автор научной работы — Катруха Г. С., Зарубина А. П., Юдина Т. П., Фёдорова Г. Б., Новоселова Л. А.

Бактерии нового штамма Photorhabdus luminescens ZMI, выделенные из личинок нематод Heterorhabditis sp., изолят Молдавия, синтезируют антибиотические комплексы с антибактериальной и фунгицидной активностью и различной локализацией как в клетках, так и в бесклеточной жидкости. Антибиотические комплексы разделены на индивидуальные компоненты и у четырёх основных компонентов исследованы биологические и физико-химические свойства. При их идентификации с использованием компьютерной базы данных природных биологически активных соединений (BNPD) установлено, что компонент А идентичен 3,5-дигидрокси-4-изопропилстильбену, компоненты В и Н аналогичны антибиотикам-антрахинонам; компонент С, по предварительным данным, является новым антибиотиком.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по биологическим наукам , автор научной работы — Катруха Г. С., Зарубина А. П., Юдина Т. П., Фёдорова Г. Б., Новоселова Л. А.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Antibiotics Produced by Photorhabdus luminescens ZMI, a Symbiont of Entomopathogenic Nematodes

A novel strain of Photorhabdus luminescens ZMI isolated from nematode larvae Heterorhabditis sp. was shown to produce antibiotic complexes with antibacterial and antifungal activities. The antibiotic complexes secreted extracellularly and intracellarly were separated into individual components. Comparison of their properties with the databases for biologically active compounds suggested that component A was identical to 3,5-dihydroxy-4-isopropylstilbene, components B and H belonged to anthraquinone derivatives, component C secreted only extracellularly was likely a novel antibiotic.

Текст научной работы на тему «Антибиотики штамма Photorhabdus luminescens Zmi - симбионта энтомопатогенных нематод»

Антибиотики штамма Photorhabdus luminescens ZMI — симбионта энтомопатогенных нематод

Г. С. КАТРУХА1, А. П. ЗАРУБИНА2, Т. П. ЮДИНА2, Г. Б. ФЁДОРОВА1, Л. А. НОВОСЕЛОВА2

' Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе РАМН, Москва 2 Биологический факультет Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова

Antibiotics Produced by Photorhabdus luminescens ZMI, a Symbiont of Entomopathogenic Nematodes

G. S. KATRUKHA, A. P. ZARUBINA, T. P. YUDINA, G. B. FEDOROVA, L. A. NOVOSELOVA

G. F. Gause Research Institute of New Antibiotics, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow M. V. Lomonosov Moscow State University, Biological Faculty, Moscow

Бактерии нового штамма Photorhabdus luminescens ZMI, выщеленныге из личинок нематод Heterorhabditis sp., изолят Молдавия, синтезируют антибиотические комплексы с антибактериальной и фунгицидной активностью и различной локализацией как в клетках, так и в бесклеточной жидкости. Антибиотические комплексы разделены на индивидуальные компоненты и у четырёх основных компонентов исследованы биологические и физико-химические свойства. При их идентификации с использованием компьютерной базы данных природных биологически активных соединений (BNPD) установлено, что компонент А идентичен 3,5-дигидрокси-4-изопропилстильбену, компоненты В и Н аналогичны антибиоти-кам-антрахинонам; компонент С, по предварительныш данным, является новыш антибиотиком.

Ключевые слова: Photorhabdus luminescens, антибиотики, выделение, идентификация, физико-химические свойства, антибиотическая активность, тест-система «Эколюм».

A novel strain of Photorhabdus luminescens ZMI isolated from nematode larvae Heterorhabditis sp. was shown to produce antibiotic complexes with antibacterial and antifUngal activities. The antibiotic complexes secreted extracellularly and intracellarly were separated into individual components. Comparison of their properties with the databases for biologically active compounds suggested that component A was identical to 3,5-dihydroxy-4-isopropylstilbene, components B and H belonged to anthraquinone derivatives, component C secreted only extracellularly was likely a novel antibiotic.

Key words: Photorhabdus luminescens, 3,5-dihydroxy-4-isopropylstilbene, anthraquinone derivatives, identification, physicochemical properties, antibiotic activity, test-system «Ecolum».

Введение

Люминесцентные бактерии составляют достаточно узкую группу с ограниченным числом видов, объединённый свойством излучать видимый свет, и представлены, в основном, морскими бактериями [1]. Единственным представителем светящихся почвенных бактерий являются люминесцентные бактерии рода Photorhabdus [2, 3]. Жизненный цикл энтомопатогенных бактерий вида Photorhabdus 1ит— nescens состоит из симбиотической и паразитической стадий. Их переносят в хозяина-насекомое личинки 3-й ювенильной стадии почвенных зоонематод семейства Heterorhabditidae, рода Heterorhabditis, в которыгх они находятся в качестве симбионтов. Бактерии выкодят в полость насекомого и обитают в нем в качестве паразита. Инфициро-

© Коллектив авторов, 2009

Адрес для корреспонденции: 119021, Москва, Большая Пироговская, д. 11. НИИНА

ванию подвержен широкий ряд насекомыгх и их личинок, при этом синтезируются люцифераза, про-теазы, фосфолипаза, пигменты, антибиотики и др. Трупы погибших насекомых окрашиваются бактериальным пигментом в красный цвет, светятся при функционировании бактериальной люминесцентной системы, а антибиотики этих бактерий предотвращают загрязнение другой микрофлорой [4]. Бактериальные метаболиты способствуют развитию стадий нематод в процессе паразитизма. Комплексы бактерии—нематоды убивают насекомое. Если нематоды не имеют бактериальных симбионтов, то инвазия редко ведет к гибели насекомого-хозяина и нарушается жизненный цикл нематод [5]. Патогенные комплексы «бактерии — зоонематоды» безопасны для теплокровных организмов, их на практике используют в качестве пестицидов от многих насекомых и их личинок [6].

Антибиотически активные вещества, синтезируемые различными штаммами энтомопато-

генных бактерий, представлены соединениями разной химической природы: 1) производные стильбена [4, 7—9]; 2) производные индола [7, 10]; 3) производные дитиолопирролона — ксе-норабдины [11, 10]; 4) производные бензопире-на — ксенокумацины [12]; 5) производные ант-рахинона [4, 8, 9]; 6) ксеноксиды [9]; 7) нематофин [13]; 8) генистеин [14]; 9) хитиназы [15]. Выявлены у этих бактерий бактериоцины, ксенорабдицины, белковые токсины [16, 17, 18]. Изучение метаболитов бактерий Ph.lumi-nescens, особенно в связи с возможностями их практического применения для медицинских целей, в фармацевтической промышленности, в сельском хозяйстве и лесной индустрии, открывает широкие перспективы [19, 12, 17].

Нами из личинок 3-й ювенильной стадии эн-томопатогенных нематод Heterorhabditis bacterio-phora, изолят Молдавия, выщелены и идентифицированы бактерии нового штамма Photorhabdus luminescens (ранее Xenorhabdus luminescens), обозначенного как Photorhabdus luminescens 2М1 [20]. Эти бактерии синтезируют антибиотики с широким спектром антимикробного действия [21—23]. В данной работе приведены некоторые свойства нового штамма Ph.luminescens 2М1 и отдельный соединений многокомпонентных антибиотических комплексов, накапливающихся как внутри клеток, так и выщеляемыгх в среду культивирования.

Материал и методы

Объектом исследования служили почвенные люминесцентные бактерии Ph.luminescens штамм 2М1, выделенные из личинок нематод Heterorhabditis bacteriophora, изолят Молдавия (нематоды любезно предоставлены доктором биологических наук Спиридоновым С. Э. из Института паразитологии РАН). Бактерии идентифицированы известными методами и хранятся в коллекции кафедры микробиологии биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова. Микроорганизмы, используемые для оценки антибиотической активности, получены из коллекций кафедр микробиологии биологического факультета и биологии почв почвенного факультета МГУ им. М. В. Ломоносова. Биосенсоры бактериальной люминесцентной тест-системы «Эколюм» получены и хранятся на кафедре микробиологии биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова [24].

Глубинное культивирование Ph.luminescens 2М1 осуществляли в колбах ёмкостью 750 мл со 100 мл среды на качалке, имеющей 220 об/мин, при температуре 30°С в течение 24—72 ч на пяти питательных средах: среда № 1 — МПБ [25]; среда № 2 — 8^ГСЬ8 [7]; среда № 3 — ЬБ [25]; среда № 4 [12]; среда № 5 (состав, в г/л дистиллированной воды: бактопептон — 5, дрожжевой экстракт — 5,0, №С1 — 4,0, К2НР04 — 0,5, КН4Н2Р04 — 0,5, морская вода ASW без №С1 (состав, в г/л дистиллированной воды: КС1 — 0,77, СаС12х 2Н20 — 1,6, МвС12 х 6Н20 — 4,8, №НС03 — 0,11, MgS04 х 7Н20 — 3,5) — 90 мл. Для выращивания бактерий на чашках Петри добавляли 20 г/л агар-агара в среду № 3 — ЬБ и среду № 1 — МПБ [25]. Конечное значение рН всех питательных сред — 7,5. Во всех исследованиях использовали типичные светящиеся колонии бактерий, выросшие в течение 48 ч при 30°С на среде № 3 — ЬБ. Посевной материал готовили при посеве отдельных типичных колоний бактерий и выращивании их на соответствующих опытных средах в глубинных условиях в течение 20 ч. В опытные колбы

вносили бактерии до конечной концентрации клеток 2х106/мл. Рост бактерий оценивали нефелометрически при В670 и выражали числом клеток/мл или г/л по предварительно составленным калибровочным кривым, рН определяли потен-циометрически. Интенсивность биолюминесценции регистрировали при комнатной температуре (20°С) с помощью лю-минометра «Биотокс» (Россия) и выражали в относительных единицах (отн. ед.). Биолюминесценцию колоний бактерий определяли визуально в динамике роста на агаризованных средах, в темноте, адаптируя зрение в течение 5 мин. Клетки бактерий отделяли центрифугированием при 4000 g в течение 20 мин, используя в исследованиях клетки бактерий и надосадоч-ную среду культивирования.

Для выделения антибиотических веществ клетки разрушали с помощью ультразвукового дезинтегратора УДЗН-1 при частоте 44 кГц, общее время обработки 2 мин.

Антибиотики из клеток бактерий и бесклеточной среды при культивировании бактерий выделяли экстракционным методом. В качестве растворителей использовали: бутанол-1, хлороформ и этилацетат.

Антибиотические комплексы разделяли на компоненты методом колоночной хроматографии на силикагеле Кієбє^єі 60 (Мегск). Колонка: высота — 16 см, диаметр — 1,2см. Колонку загружали в гексане, антибиотический комплекс вносили в сухом виде в смеси с силикагелем . Элюцию компонентов проводили гексаном с постепенным увеличением процентного содержания хлороформа (от 10 до 100%), затем метанолом. Фракции анализировали методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) в сочетании с биоавтографией и анализом хроматограмм в УФ-свете. Однородные фракции объединяли, концентрировали в вакууме и исследовали некоторые их физико-химические (УФ-спектр) и биологические (антибактериальный спектр действия) свойства. Очистку фракций проводили методом препаративной ТСХ на пластинках Кієбє^єі 60 (Мегск) и пластинках 8ПиЫ (Чехия) с люминесцентным индикатором для ЦУ254 и без индикатора в системах растворителей: № 1 — хлороформ—гексан—уксусная кислота (5:5:0,5) и № 2 — хлороформ—бензол—метанол (30:20:7). Элюцию с пластины ТСХ проводили хлороформом. Кієбє^єі отделяли на фильтре, промывали хлороформом и концентрировали до небольшого объёма. Хлороформный концентрат дополнительно пропускали через колонку с Кієбє^єі (В=2,0см, И=1 см) для освобождения от следов Кієбє^єі с пластинок ТСХ. Колонку загружали в гексане, элюцию проводили хлороформом, затем концентрировали в вакууме. ВЭЖХ осуществляли на микроколоночном жидкостном хроматографе «Милихром-4» (ПО «Научприбор», г. Орел) на колонках из нержавеющей стали, размером 2х80 мм, упакованных сорбентом Сепарон 80Х КР-8 С18 Супер. В качестве элюен-та использовали смесь: ацетонитрил—фосфатный буфер (0,01 М, рН 3,0). Скорость элюции 0,1 мл/мин. Объём пробы 4 мкл. Регистрацию осуществляли с помощью УФ-детектора при 210 и 310 нм.

УФ-спектры снимали на спектрофотометре «Весктап-5260». ИК-спектры получали на приборе 8Р-1100 «Руе-ипісап» (Великобритания) в таблетках КВг или в хлороформе. Масс-спектры снимали на приборе М8 50ТС фирмы «КШоб» (Великобритания) методом бомбардировки помещённых в глицериновую матрицу веществ пучками ускоренных атомов ксенона с энергией ионизации 8 кэВ. Идентификацию полученных антибиотиков проводили по компьютерной базе данных ВОТБ [26].

Антибиотическую активность бактерий в процессе их роста и веществ, выделяемых на этапах экстракции и очистки, определяли методом диффузии в агар с оценкой зоны подавления роста различных представителей микроорганизмов — грамположительных и грамотрицательных бактерий и грибов [27]. При определении антибиотической активности бактерий Ph.luminescens их предварительно выдерживали под хлороформом с целью предотвращения их роста на средах с тест-орга-

Таблица 1. Некоторые свойства клеток Photorhabdus luminescens ZM1 на различных средах при глубинном культивировании

Показатели Часы культиви- Среда культивирования, №

рования 1 2 3 4 5

Рост (биомасса, г/л) 24 7,2 2,9 4,1 7,4 2,8

48 6,8 4,1 4,9 8,1 4,1

72 6,4 4,2 5,8 9,8 4,2

Биолюминесценция, отн. ед. 24 1,3х105 1,1х105 0,5х105 1,5х105 1,9х105

48 0,9х104 0,2х104 0,4х104 0,9х104 1,1х104

72 0,1х104 0,1х104 0,1х104 0,1х104 0,1х104

Подавление роста Micrococcus luteus АТСС 9341 (зона ингибирования роста в мм) 24 13—14 11—12 17—18 15—16 15—17

48 12—13 14—16 14—15 17—18 14—15

72 11—12 11—12 11—13 17—18 13—14

Примечание. Антибиотическую активность и интенсивность биолюминесценции клеток определяли при одинаковой плотности клеток.

низмами. Спектр антибиотического действия бактерий Ph.luminescens определяли на специфических средах по ингибированию роста 34 тест-микроорганизмов при их подсеве штрихом к полоске предварительно выросших бактерий Ph.luminescens ZM1. Использовали по 10 тест-организмов грамположительных и грамотрицательных бактерий, 3 штамма стрептомицета, 3 — грибов дрожжей, 5 — грибов мицели-альных несовершенных и 2 — грибов мицелиальных базиди-диальных, 1 — протист. Устойчивость бактерий Ph.luminescens ZM1 к антибиотикам определяли стандартным методом наложения стандартных дисков с различными антибиотиками на свежезасеянную культуру на агаризованную LB-среду. Токсичность среды культивирования в процессе роста бактерий определяли, используя бактериальную люминесцентную тест-систему «Эколюм-08» на основе лиофильно высушенных бактерий генно-инженерного штамма Escherichia coli K12 TG1, с клонированным в них lux-опероном бактерий Ph.luminescens ZM1 [24]. Исследования проводили со свежеприготовленным водным раствором предварительно регидратирован-ных лиофильно высушенных бактерий биосенсора. Среду культивирования № 4, на которой росли бактерии Ph.luminescens ZM1, после ее центрифугирования при 4000 g в течение 20 мин, использовали в качестве исследуемых образцов (рН 8,0). Во все кюветы от люминометра «Биотокс» (Россия) объёмом 1,5 мл наливали по 0,1 мл суспензии биосенсора системы «Эколюм» (1,0х107 клеток/мл) и добавляли 0,9 мл раствора контрольных и исследуемых образцов. В кювету к контрольному образцу биосенсора добавляли 0,9 мл стерильной среды культивирования, рН 8,0. Общий объём растворов в кювете равен 1 мл. Ставили в кюветное отделение люминометра контрольные и опытные образцы. Для получения достоверных данных одновременно регистрировали биолюминесценцию контрольных и опытных образцов (в трёх повторностях). Индекс токсичности (Т) исследуемых образцов вычисляли по формуле (Io-I)/Io, где Io и Iсоответственно интенсивность свечения в контроле и опыте определялся автоматически по программе люминометра. Исследуемые образцы оценивали по значению индекса токсичности: Т<20 — образец не токсичен, Т=20 — «пороговая» токсичность, Т~50 — острая токсичность, Т>50 — очень высокая токсичность [28].

Результаты и обсуждение

С целью селекции клеток 1-й фазы естественной изменчивости и изучения природной чувствительности к химически различным известным антибиотикам было показано, что бактерии Ph.luminescens ZM1 устойчивы к ампициллину,

пенициллину, оксациллину к рифампицину. Минимальные подавляющие концентрации (МПК) в-лактамных антибиотиков, рифампицина — более 150 мкг/мл, тетрациклина, олеандомицина, ристомицина, хлорамфеникола, аминогликозид-ных антибиотиков — 5 мкг/мл, пептидных антибиотиков — 20 мкг/мл, брунеомицина, митоми-цина С — 2 мкг/мл. ДНК-тропные антибиотики индуцируют функционирование люминесцентной системы и наряду с некоторыми другими методами могут быть использованы для отбора антибиотически активных биолюминесцентных вариантов. Было установлено, что бактерии Ph.luminescens 2М1 проявляют антагонизм по отношению к широкому ряду микроорганизмов. Они обладают высокой антибактериальной активностью в отношении грамположительных бактерий, меньшей — в отношении грамотрицательных бактерий, значительной фунгицидной и слабой противопротозойной активностями. Для отбора среды, на которой бактерии синтезируют максимальное количество антибиотических веществ и хорошо растут, их выращивали на разных питательных средах в глубинныгх условиях (табл. 1). На среде № 4 бактерии синтезируют до 255 мг/л антибиотически активных веществ, на средах № 1 и № 3 — менее 100 мг/л. Бактерии уже к 24 ч выращивания защелачивают (рН до 8,5 и выше) все среды культивирования. Наибольшую антибиотическую активность к грамотрицательным бактериям наблюдали к середине логарифмической фазы роста бактерий Ph.luminescens 2М1, а к грам-положительным бактериям и грибам — и на более поздних фазах, к 48—72 ч выращивания.

Известно, что биолюминесцентная система светящихся бактерий чувствительна к действию различных химических соединений, что позволяет использовать её для оценки токсичности самых различных субстратов [24, 28]. В наших исследованиях мы использовали экспресс-метод на основе бактериальной биолюминесцентной тест-системы «Эколюм» для выявления времени

Таблица 2. Выявление времени накопления антибиотиков у бактерий Photorhabdus luminescens ZM1 в процессе глубинного культивирования на среде № 4 с использованием экспресс-метода на основе бактериальной биолюминесцентной тест-системы «Эколюм»

Исследуемые образцы Часы культивирования бактерий Photorhabdus luminescens ZM1

6 16 24 48

Контроль (интенсивность свєчєния, отн.єд) Исслєдуємьіє образцы срєдьі культивирования бактерий Bывoд о токсичности исслєдуємого образца Зб10 -57* He токсичен 3б9б 4010 4089 29 85 99 ^ксинен Очєнь токсичєн Очєнь токсичєн

Примечание. * - стимуляция свечения. Принято считать, что исследуемый образец не токсичен [24, 28]. Индекс токсичности (Т) среды культивирования при экспозиции с биотестом в течение 30 мин.

Таблица 3. Свойства компонентов антибиотического комплекса Photorhabdus luminescens ZM1

Свойства Компонент А Компонент С Компонент В Компонент Н

UV-VIS- спектр, lmax (EtOH), нм 211; 314 214; 271 210; 280; 425 210; 278, 428

Мол. масса (метод FAB-MS) 254 300 298 25б

ИК-спектр (KBr), vmax, см-1 3б00; 3340; 3400—3300;

2940; 1720; 3100—2850;

1б20; 1580; 2б00; 2350;

1430; 1340; 1б70; 1б40;

12б0; 1200; 1480; 1420;

11б0 1300—1180;

1150

ТСХ, Rf

Kiesegel 60 F254 (Merck) 0,б5—0,70**; 0,55—0,б0**; 0,77—0,80** 0,47—0,50**

0,45—0,50*; 0,58—0,б2*;

Silufol UV254 0,45—0,50** 0,40—0,45**

Спектр биологической активности (тест- организмы):

Грамположительные бактерии:

Bacillus mycoides R-573 + + + +

Bacillus subtilis АТСС 6630 + + + +

Micrococcus luteus АТСС 9341 + + + +

Staphylococcus aureus 209-P + + — —

Грамотрицательные бактерии:

Escherichia coli K-13 + + — —

Pseudomonas fluorescens 109 + + — —

Comamonas terrigena АТСС-8461 + + — —

Photorhabdus luminescens ZM1 + + — —

Грибы:

Candida albicans M9 + — + +

Aspergillus niger sp. + — — —

Примечание. * - система № 1: СНС13 - гексан - СН3СООН (5:5:0,5); ** - система № 2: СНС13 - бензол-метанол (30:20:7); «+» - наличие и «-» - отсутствие антибиотической активности.

максимального накопления антибиотиков на среде № 4 (табл. 2). Отмечено, что к 6 ч культивирования бактерии практически не выделяют в среду заметных количеств антибиотиков или других токсических соединений. Биосинтез этих соединений бактериями и выделение их в среду культивирования отмечается к 16—18 ч выращивания, увеличивается к 24 ч (индекс токсичности около 80) и далее в процессе их развития. К 48 и 72 ч выращивания среда культивирования бактерий уже очень токсична (индекс токсичности 100). Это свидетельствует о наличии в ней большого количества биологически активных веществ, а этот метод позволяет регистрировать удобное время их выделения для дальнейших исследований. Многочисленными исследованиями показано, что тест-система на основе бактериаль-

ной биолюминесценции является высокочувствительной к различным воздействиям, обладает простотой измерения, быстродействием (время анализа образца 5 минут), точностью, воспроизводимостью (ошибка эксперимента 10%), тестированием в микрообъёмах (от 0,1 до 1мл), а также корреляцией с ответной реакцией, регистрируемой в других общепринятых тест-системах: ЕС50 (эффективная концентрация или объём исследуемого образца при Т=50) у биолюминесцентного биотеста коррелирует с ЬБ50 у животных [29]. Используемый и созданный нами бактериальный биолюминесцентный тест системы «Эколюм» может быть рекомендован для экспресс-оценки времени максимального образования антибиотиков или токсинов у различных микроорганизмов в динамике их культивирования, что позволяет до-

Выделение и очистка антибиотического комплекса Photorhabdus luminescens ZM1.

статочно просто, быстро и экономически выгодно выбрать для исследований удобные сроки выделения таких биологически активных соединений.

Для выделения антибиотических комплексов из клеток и бесклеточной жидкости в качестве экстрагента был выбран этилацетат, наиболее полно извлекающий антибиотики при конечном значении рН 8,5—9,0 (рисунок). Методом колоночной хроматографии и последующей очисткой активных фракций с помощью препаративной ТСХ получены индивидуальные биологически активные компоненты А, С, В и Н (табл. 3). Основным компонентом исследуемых антибиотических комплексов является компонент А, характеризующийся широким спектром биологического действия, включая грамположительные, грамотрицательные бактерии и грибы (дрожжевые и мицелиальные).

Компонент С, выделенный нами из бесклеточной жидкости, активен в отношении грамположи-тельных и грамотрицательных бактерий и не подавляет рост грибов. Пигментированные желтые компоненты В и Н, накапливающиеся как в клетках, так и в среде культивирования, подавляют рост только грамположительных бактерий и дрожжевых грибов, не активны в отношении грамотрицательных бактерий и мицелиальных грибов.

Cрaвнeниe вcex свойств выделенньш антибиотически активніш компонентов Ph.luminescens ZM1 с таковыми друж природніш биологически активніш соединений по компьютерной базе данньш (BNPD), разработанной Я. Берди (BeHT-рия) [2б], позволяет идентифицировать ж с известными антибиотиками, синтезируемыми энто-мопатогенными бактериями. Компонент А относится к антибиотикам группы стильбенов и идентичен З,5-дигидроки-4-изопропилстильбену [4, 8], Компоненты B и Н по физикo-xимичecким свойствам (электронные спектры поглощения, масс-спектральный анализ и др.) были отнесены к группе aнтрaxинoнoв и наиболее близки к антибиотикам, выделенным ранее из Photorhabdus luminescens [8, 9, 14]. Для компонента C мы не обнаружили аналога в компьютерной базе данньш BNPD и можно предположить, что он является новым антибиотиком.

Выводы

1. Из личинок нематотод Heterorhabditis sp., изолят Молдавия, выделены бактерии нового штамма Photorhabdus luminescens ZMI. Исследованы некоторые его свойства и методы культивирования.

2. Из клеток первичной формы при глубинном культивировании Ph.luminescens ZMI выделены антибиотические комплексы с антибактериальной и фунгицидной активностью.

3. Антибиотические комплексы разделены на индивидуальные компоненты, исследованы hx биологические и физикo-xимичecкнe свойства и установлена xимичecкaя природа чeтырex основ-

ЛИТЕРАТУРА

1. Гителъзон И. И., Родичева Э. K., Медведев С. Е. и др. Cвeтящиecя бактерии. Под ред. E. Н. Кондратьевой. Новосибирск. 1984; 280.

2. Boemare N., Akhurst R. J., Mourant R. G. DNA relatedness between Xenorhabdus spp. (Enterobacteriaceae), symbiotic bacteria of ento-mopathogenic nematodes, and a proposal to transfer Xenorhabdus lumi-nescens of a new genus. Photorhabdus gen. nov. Int J Syst Bacteriol 1993; 43: 1: 249-255.

3. Fischer-Le S. M., Viallard V., Brunel B. et al. Polyphasic classification of the genus Photorhabdus and proposal of new taxa: P.luminescens subsp. luminescens subsp. nov., P.luminescens subsp. akhurstii subsp. nov., P.luminescens subsp. laumondii subsp. nov., P.temperata sp. nov., P.tem-perata subsp. temperata subsp. nov. and P.asymbiotica sp. nov. Int J Syst Bacteriol 1999; 49: 4: 1б45-1б5б.

4. Richardson W. H., Schmidt T. M., Nealson K. H. Identification of an anthraquinone pigment and a hydroxystilbene antibiotic from Xenorhabdus luminescens. Appl Environ Microbiol 1988; 54: б: 1б02—1б05.

5. Hosseini P. K., Nealson K. H. Symbiotic luminous soil bacteria: unusual regulation for an unusual niche. Photochem Photobiol 1995; б2: 2: б33—б40.

6. Boemare N., Laumond C., Mauleon H. The entomopathogenic nema-tode-bacterium complex: biology, life cycle and vertebrate safety. Biocontr Sci Tech 1996; 6: 3: 333-345.

7. Paul V. J., Frautschy S., Fenical W., Nealson K. H. Antibiotics in microbial ecology: isolation and structure assignment of several new antibacterial compounds from the insect-symbiotic bacteria Xenorhabdus sp. Chem Ecol 1981; 7: 2: 589-597.

8. Li J., Chen G., Wu H., Webster J. M. Identification of two pigments and hydroxystilbene antibiotic from Photorhabdus luminescens. Appl Environ Microbiol 1995; б1: 4329—4333.

9. Hu K., Li J., Wang W., Wu H. et al. Comparison of metabolites in vitro and in vivo from Photorhabdus luminescens, a bacterial symbiont of the entomopathogenic nematode Heterorhabditis megdis. Can J Microbiol 1998; 44: 1072-1077.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

10. Li J., Chen G., Webster J. M. Czyzewska E. Antimicrobiol metabolites from a bacteral symbiont. J Nat Prod 1995; 58: 7: 1081—108б.

11. Mclnerney B. V., Gregson R. P., Lacey M. J. et al. Biologically active metabolites from Xenorhabdus spp. Part 1. Dithiolopyrrolone derivatives with antibiotic activity. Ibid 1991; 54: 3: 774—784.

12. Mclnerney B. V., Taylor W. C., Lacey M. J. et al. Biologically active metabolites from Xenorhabdus spp. Part 2. Benzopyran-1-one derivatives with gastroprotective activity. Ibid 1991; 54: 3: 785—795.

13. Li J., Chen G., Webster J. M. Nematophin, a novel antimicrobial substance produced by X.nematophilus (Enterobacteriaceae). Can J Microbiol 1997; 43: 8: 770—773.

14. Sztaricskai F., Dinya Z., Batta G. Y. et al. Anthraquinones produced by enterobacters and nematodes. Acta Chemica Hungarica-Models in Chemistry. 1992; 129: 3: б97—707.

15. Chen G., Zhang Y., Li J., Dunphy G. B. et al. Chitinase activity of Xenorhabdus and Photorhabdus species, bacterial associates of ento-mopathogenic nematodes. J Invertebr Path 199б; б8: 2: 101—108.

Hiix компонентов. Основным компонентом ан-тибиoтичecкиx комплексов является компонент А, идентичный З,5-дигидроки-4-изопропил-стильбену, компоненты B и Н отнесены к группе aнтрaxинoнoв, а компонент C, содержащийся только в антибиотическом комплексе, выделенном из бесклеточной жидкости, является новым, ранее не описанным антибиотиком.

16. Baghdiguian S., Boyer-Giglio M.-H., Thaler J.-O. et al. Bacteriocinogenesis in cells of Xenorhabdus nematophilus and Photorhabdus luminescens: Enterobacteriaceae associated with ento-mopathogenic nematodes. Biol Cell (Paris) 1993; 79: 2: 177—185.

17. Webster J. The role and potential of secondary metabolites of the bacterial symbionts. Virulence factors and secondary metabolites from symbiotic bacteria of entomopathogenic nematodes. 22—2б March 1999, Vienna, 1999; 67-74.

18. Юдина Т. Г., Зарубина А. П., Егоров Н. С. и др. ^к^чность cryHA-белка и нового уникального белка из параспоральнье кристаллов Bacillus thuringiensis subsp. Israilensis для Escherichia coli. Te-зисы докл. II Международная конференции «Микробное разнообразие: состояние, стратегия coxрaнeния, биoтexнoлoгичe-ский потенциал». Пермь — Казань — Пермь, 20—25 сентября 200 г. ICOMID. 2005; 110-111.

19. Li J., Hu K., Webster J. M. Antibiotics from Xenorhabdus spp. and Photorhabdus spp. (Enterobacteriaceae) (Review). Chem. Heterocycl. Compounds 1998; 34: 11: 1331—1339.

20. Зарубина А. П. Новый штамм Xenorhabdus luminescens — продуцент люциферазы. Teзиcы конференции РАН и Российского микробиологического общества «Биосинтез ферментов микроорганизмов». М.: 1993; 9б.

21. Zarubina A. P., Yudina T. P., Danilov V. S., Spiridonov S. F. Photorhabdus luminescens strain Zm1, the bacterial symbiont of Heterorhabditis sp. Russ. J Nematodologia 1996; 4: 1: 10.

22. Zarubina A.P., Fedorova G. B., Yudina T.P. et al. Isolation and investigation of the antibiotics from Photorhabdus luminescens strain ZM1, the bacterial symbiont of Heterorhabditis sp. Abstracts. Second English Language International Nematology Symposium of the Russian Society of Nematologists. Moscow. Russia. 1997; 98.

23. Федорова Г. Б., Юдина Т. П., Зарубина А. П., Катруха Г. С. Изучение антибиотиков, продуцируемые Photorhabdus luminescens штамм Zm1 — бактериальные симбионтов Heterorhabditis sp. Teзи-сы докладов международного симпозиума по круглым червям. Tруды зоологического института РАН. «Проблемы нематологии». Caнкт-Пeтeрбург. 1999; 280: 122.

24. Данилов В. С., Зарубина А. П., Ерошников Г. Е. и др. Ceнcoрныe би-олюминесцентные системы на основе lux-оперонов разные видов люминесцентные бактерий. Becтник Московского Университета. Ceр. 16. Биология. 2002; 3: 20—24.

25. Практикум по микробиологии. Учебное пособие для студентов выс-ttthx учебные заведений. Под ред. Нетрусова А. И., М.: 2005; 608.

26. Berdy J. BNPD, data base for microbial metabolite research. Intern. Conf. Microbial. Secondary Metabolism. Interlaken. Suisse 1994; Abstr 2.

27. Егоров H. С. Микробы антагонисты и биологические методы определения антибиотической активности. М.: 1965; 211.

28. Зарубина А. П., Мажулъ М. М., Новоселова Л. А., Гапочка М. Г. Бактериальный люминесцентный биотест. Ceнcoр 2005; 3: 14—23.

29. Kaiser K. L. Correlation of Vibrio fischeri bacteria test data with bioassay data for other organisms. Environ Health Perspective 1998; 10б: 2: 583—591.

О

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.