CC BY
45
УДК 579.66:547.94
Н. И. Петухова (к.биол. н., доц.)1, А. В. Хузина (студ.)1, Л. C. Файзрахманова (студ.)1, Р. Р. Муслухов (к.х.н., с.н.с.)2, Е. В. Комлева (инж.)1, В. В. Зорин (чл.-корр. АН РБ, д.х.н., проф., зав. каф.)1
Исследование влияния ультрафиолетового облучения на синтез продигиозина Serratia sp. НС-Р1
1 Уфимский государственный нефтяной технический университет, кафедра биохимии и технологии микробиологических производств 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1, тел. (347) 243-19-35, e-mail: Biol@rusoil.net 2 Институт органической химии Уфимского научного центра РАН, лаборатория физико-химических методов анализа 450054, г. Уфа, пр. Октября, 71, тел. (347) 235-55-60, e-mail: spector@anrb.ru
N. I. Petukhova, A. V. Khuzina, L. S. Faizrakhmanova, R. R. Musluhov, E. V. Komleva, V. V. Zorin
Research of the influence of ultraviolet radiation on the prodigiosine synthesis by Serratia sp. HC-P1
1 Ufa State Petroleum Technological University 1, ul. Kosmonavtov, 450062, Ufa, Russia; ph. (347)243-19-35, e-mail: Bio1@rusoil.net 2Institute of Organic Chemistry of Ufa Scientific Centre of Russian Academy of Sciences 71, Oktyabrya Pr., Ufa, 450054, Bashkortostan, Russia,, ph. (347) 235-55-60, e-mail: spector@anrb.ru
Исследовано влияние ультрафиолетового облучения на синтез продигиозина бактериями Serratia sp. НС-Р1. Получены мутанты с пониженным и повышенным выходом продигиозина. Показана задержка синтеза продигиозина популяцией клеток, предварительно подвергнутой УФ-облучению.
Ключевые слова: продигиозин; Serratia; УФ-облучение.
Известно, что бактерии рода Serratia (S. marcescens и S. plymutica) способны продуцировать продигиозины, обладающие антимикробной, противомалярийной и иммуносу-прессивной активностью 1-7. В последние годы обнаружена противораковая активность этого соединения в отношении клеточных линий рака печени, груди, ободочной кишки, что позволяет рассматривать его как перспективное терапевтическое средство с уникальным механизмом действия 8. Это возобновило интерес к разработке методов получения продигиозина с помощью микроорганизмов.
Важной задачей при получении продигио-зина в значительных количествах является создание эффективного продуцента.
Ранее из почвенных образцов, загрязненных нефтью, нами был выделен и идентифицирован штамм Serratia sp. НС-Р1, способный продуцировать красно-розовые пигменты,
Дата поступления 05.02.09
The influence of ultraviolet radiation on the prodigiosine synthesis by Serratia sp. HC-P1 was researched. Mutants with lower and higher yield of prodigiosine were created. The lag in the prodigiosine synthesis by cell population exposed under the ultraviolet rays was showed.
Key words: prodigiosine; Serratia; UV-radiation.
среди которых выявлена основная фракция, проявляющая высокую антибактериальную активность в отношении грамположительных бактерий (Micrococcus sp., Bacillus sp., Staphylococcus aureus) 9.
В настоящей работе было осуществлено исследование спектральных (ЯМР) характеристик основного пигмента Serratia sp. НС-Р1, сравнение которых с литературными данными 10, 11 позволило идентифицировать его как продигиозин.
1 г
С целью увеличения выхода продигиозина путем индуцированного мутагенеза было исследовано влияние ультрафиолетового облу-
чения на выживаемость и пигментообразова-ние клеток Serratia sp. НС-Р1.
Было обнаружено, что при облучении разбавленных суспензий клеток (103—104 клеток/мл) в течение 35—45 с большая часть популяции погибает. При инкубировании облученных суспензий (0.25 мл) на плотной среде в чашках Петри в течение трех суток вырастали только отдельные колонии (3—15 колоний на чашку). При этом были выявлены четыре колонии, отличающиеся интенсивностью окраски от исходного штамма. Две колонии были почти бесцветные (мутант 1 и 2), тогда как две другие колонии были окрашены более интенсивно (мутант 3 и 4), чем колонии исходного штамма.
Количественная оценка выхода пигментов показала, что мутант 1 синтезирует в 4 раза меньше продигиозина, а мутант 2 практически утратил способность к пигментообразованию. В тоже время мутанты 3 и 4 синтезировали в 1.5—2.5 раза больше пигмента, чем исходный штамм.
100 80 60 40 20 0
100
60
40
_
10
о
НС-P1 мутант 1 мутант 2 мутант 3 мутант 4
а) облученный инокулят
б)необлученный инокулят
Рис. 1. Относительный выход пигмента, синтезируемого штаммом Serratia sp. НС-Р1 и его мутантами
При работе с более густой суспензией клеток Serratia sp. HC-P1 (107 клеток/мл) было обнаружено, что ее УФ-облучение в течение 35—45 с также приводит к гибели большей части популяции (в чашках Петри вырастает не более 25—50 колоний).
При меньшем времени облучения суспензии (15 с) выживаемость популяции значительно увеличивается. На чашках Петри вырастает сплошной слой микроорганизмов, так же, как и в контрольном необлученном варианте (рис. 2). Однако при инкубировании в течение суток предварительно облученного инокулята развивается непигментированная культура (рис. 2а), тогда как при культивировании необлученного инокулята за тот же период времени вырастает пигментированная культура (рис. 2б).
Рис. 2. Образование пигмента при росте на агаризо-ванной среде предварительно УФ-облученнъх в течение 15 с (а) и необлученных (б) клеток Serratia sp. НС-Р1
Согласно литературным данным, свет голубой части спектра способен разрушать продигиозин, в результате чего выращивание серратий при освещении голубыми лучами приводит к развитию неокрашенных или сла-боокрашенных колоний 12. Однако в данном случае экспозиция суспензии клеток в УФ-све-те осуществлялась кратковременно, до процесса выращивания микроорганизмов, и, следовательно, разрушение пигмента не могло быть причиной появления неокрашенных колоний.
Более вероятным объяснением отсутствия пигментообразования при росте предоблучен-ной популяции клеток является задержка синтеза продигиозина. Действительно, через 3 сут. культивирования такой культуры в чашках Петри наблюдается появление красной окраски, характерной для продигиозина.
Известно, что синтез продигиозина серра-тиями подчиняется кворум-чувствительной регуляции, благодаря которой синтез пигмента становится возможным только после достижения определенной плотности популяции (кворума). Два класса кворум-чувствительных систем обнаружены у серратий: N-ацилгомосе-ринлактон-зависимая система LuxIR-типа
и автоиндуктор-2-зависимая система LuxS-13
типа 13, использующие в качестве сигнальных молекул N-бутаноилгомосеринлактон (BHL) или N-гексаноилгомосеринлактон (HHL) и фуранозилборат диэфир (AI-2) 14. Наиболее изучена кворум-чувствительная система SmaIR из Serratia sp. ATCC39006, с помощью которой контролируется синтез антибиотиков продигиозина и карбапинема, а также экзо-ферментов пектатлиазы и целлюлазы 15. Молекулы BHL/HHL синтезируются каждой клеткой в бактериальной популяции и свободно диффундируют в среду. С возрастанием плотности бактериальной популяции концентрация этих молекул в среде также возрастает. При достаточно высокой плотности популяции,
сигнальные молекулы начинают взаимодействовать с рецепторным белком SmaR, выполняющим роль репрессора генов синтеза антибиотиков (Pig-оперона и Car-оперона), и инактивируют его. В результате инактивации репрессора гены антибиотиков могут экспрессироваться.
Поскольку даже при кратковременном УФ-облучении суспензии клеток Serratia sp. НС-Р1 должна происходить гибель части популяции, можно ожидать, что в процессе последующего культивирования выживших клеток достижение кворума, необходимого для экспрессии генов синтеза продигиозина, будет происходить медленнее, чем при инкубировании клеток необлученной суспензии. Это может приводить к некоторой задержке начала пигментообразования предоблученной культуры по сравнению с исходной.
Экспериментальная часть
Поверхностное культивирование осуществлялось при температуре 25—27 оС на среде следующего состава: питательный агар на основе панкреатического гидролизата рыбной муки — 42 г, вода дистиллированная — 1000 мл; рН 6.8-7.0.
Выделение и оценку выхода продигиози-на проводили, как описано в 9.
Идентификацию продигиозина осуществляли методом ЯМР-спектроскопии на приборе Bruker AM-300 c рабочими частотами 300 (1H) и 75 (13С). В качестве растворителя использовался дейтерированный хлороформ CDCL3.
Продигиозин. ЯМР-13С (CDCl3, 75MHz, ppm, 5/м. д.): 12.69 (C6"), 14.03 (C11"), 22.5 (C10"), 25.31 (C7"), 29.81 (C8"), 31.42 (C9"), 58.95 (O-CH3), 92.84 (C34), 111.69 (C3), 115.99 (C6'), 117.04 (C4), 121.0 (C5'), 122.26 (C5), 125.17 (C2"), 126.90 (C2'), 128.36 (C3"), 128.0 (C4"), 146.8 (C5"), 147.5 (C2'), 165.78 (C4').
ЯМР-^ (CDCl3, 300 MHz, ppm): 0.92 (т, 3Н, С11"), 1.2-1.4 (м, 4Н, С9", С10"), 1.5 (м, 2Н, С8"), 2.20-2.5 (м, 5Н, С7", С6"), 4.0 (с, 3Н, ОСН3), 6.05 (с, 1Н, С3'), 6.25 (м, 1Н, С3), 6.55 (ушир. с, 1Н, С3"), 6.83 (м, 1Н, С4), 6.9 ( с. 1Н, С6'), 7.26 (м, 1Н, С2). Полученные спектральные характеристики продигио-
10 11
зина совпадают с описанными в литературе 10' .
Мутантные штаммы получали УФ-обра-боткой суспензии клеток бактерий Serratia sp. НС-Р1 плотностью 103-104 клеток/мл в течение 35-45 с. Облученную суспензию (0.25 мл) высевали на агаризованную среду в чашки
Петри для получения отдельных колоний. После инкубации при 25—27 оС в течение 72 ч колонии, отличные по цвету и интенсивности окраски от исходных колоний, отбирали для анализа выхода пигмента.
При УФ-облучении густой суспензии клеток Serratia sp. НС-Р1 действию ультрафиолета в течение 15, 35 и 45 с подвергалась суспензия плотностью 107 клеток/мл.
Литература
1. Campas C., Dalmau M., Montaner B., Barragan M., Bellosillo B., Colomer D., Pons G., Perez-Tomas R., Gill J. // Leukemia.- 2003.- V. 17.-P. 746.
2. Diaz-Ruiz C., Montaner B., Perez-Tomas R.// Histol. Histopathol.- 2001.- V. 16.- P. 415.
3. Gerber N.N. // CRC Crit. Rev. Microbiol.-1975.- V. 3.- P. 469.
4. Isaka M., Jaturapat A., Kramyi J., Tanticharoen M., Thebtaranonth Y. // Antimicrob. Agents Chemother.- 2002.- V. 46.- P. 1112.
5. Montaner B., Perez-Tomas R. // Curr. Cancer Drug Targets.- 2003.- V. 3.- P. 57.
6. Ramoneda B.M., Perez-Tomas R. // Biochem. Pharmacol.- 2002.- V. 63.- P. 463.
7. Soto-Cerrato V., Llagostera E., Montaner B., Scheffer G.L, Perez-Tomas R. // Biochem. Pharmacol.- 2004.- V. 68.- P. 1345.
8. Han S. B., Kim H. M., Kim Y. H, Lee C. W., Jang E. S., Son K. H., Kim S. U., Kim Y. K. // Int. J. Immunopharmacol.- 1998.- V. 20.- P. 1.
9. Комлева Е. В., Петухова Н. И., Бадретдинов А. Д., Султанова Л. М., Зорин В. В. // Баш. хим. ж.- 2007.- Т. 14, № 1.- С. 159.
10. Cang S., Sanada M., Johdo O., Ohta S., Nagamatsu Y., Yoshimoto A. // Biotechnology Letters.- 2000.- Vol. 22.- P. 1761.
11. Song M.-J., Bae J., Lee D.-S., Kim C.-H., Kim J.-S., Hong S.-1. // Bioscience and Bioengineering.- 2006.- V. 101, № 2.- P. 157.
12. Someya N., Nakajima M., Hamamoto H., Yamaguchi I., Akutsu K. // J. Gen. Plant Pathol.- 2004.- V. 70.- Р. 367.
13. Wei S.-R., Lai H.-C.// Int. J. Medic. Microbiol.- 2006.- V. 129.- P.117.
14. Zhu H., Shen Y.L., Wei D. Z, Zhu J.W. // Curr. Microbiol.- 2008.- V. 56.- P. 645.
15. Cristensen A. B., Riedel K., Eberl L., Flodgaard L. R., Molin S., Gram L., Givskov M. // Microbiol.- 2003.- V. 149.- P. 471.
