CC BY
71
Том 150, кн. 2
Естественные науки
2008
УДК 579.842.21
ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ БАКТЕРИАЛЬНОГО ПИГМЕНТА ПРОДИГИОЗИНА
И.Д. Гурьянов, Д.В. Юсупова Аннотация
В тестах на токсичность по отношению к микроорганизмам и в экпресс-тестах на Paramecium caudatum показано, что продигиозин обладает значительным токсическим эффектом даже в невысоких концентрациях по сравнению с известными токсикантами. Тест на генетическую токсичность показал слабую мутагенную активность пигментного препарата продигиозина в ряду концентраций 0.5-0.1-0.05 мкг/мл. Установленные токсикологические эффекты продигиозина определяют некоторые свойства данного пигмента, имеющие большое значение при использовании его в различных отраслях медицины и биотехнологического производства.
Ключевые слова: Serratia marcescens, продигиозин, генетическая токсичность, токсикологические эффекты.
Введение
Поиски возможности использования пигментов микроорганизмов в инновационном биотехнологическом производстве приводят к необходимости исследования их токсических свойств. Актуальность исследований в этом направлении определяется также необходимостью выяснить значение этих соединений в жизни продуцента.
Энтеробактерии Serratia marcescens синтезируют ярко-красный пигмент продигиозин, представляющий собой пиррилдипиррилметен. Структурная формула продигиозина была установлена в результате частичного и общего синтеза его молекулы [1]. Пигмент нерастворим в воде, хорошо растворяется в этаноле, неполярных растворителях. Локализован в поверхностных структурах клетки.
Продигиозин может быть использован в промышленности и медицине. В промышленности продигиозин рекомендуется в качестве красителя [2] и маркера [3]. В медицине продигиозин и продигиозинподобные пигменты рассматриваются в качестве противоопухолевых препаратов [4], иммунодепрессантов [5] и противогрибковых соединений [6].
Данная работа была предпринята с целью установления токсических и гено-токсических свойств пигментного препарата, рекомендуемого в качестве маркера нефтепродуктов и основного красителя в красящих композициях.
1. Материалы и методы
1.1. Микроорганизмы, использованные в работе, и условия культивирования. В качестве продуцента пигмента в работе был использован штамм
A
5,00 4,50 4,00 3,50 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,08
700
I
Рис. 1. Оптический спектр продигиозина в подкисленном этаноле
Serratia marcescens АТСС 9986, в токсикологических тестах использовали штаммы Salmonella typhimurium TA 100, Paramecium caudatum. Все штаммы были получены из коллекции культур кафедры микробиологии Казанского государственного университета.
Для получения пигмента штамм-продуцент культивировали на глицерин-пептонной среде, содержащей 5 г пептона, 10 мл глицерина, 1000 мл дистиллированной воды. Посевным материалом служила 2-суточная культура, выращенная на скошенной агаризованной среде. Инокулят в виде клеточной суспензии в физиологическом растворе с плотностью 106 - 10' клеток, засевали по 0.400.45 мл в колбы объемом 250 мл с 50 мл питательной среды. Культуру выращивали на качалке Type 357 (Sanyo, Япония) при температуре 28 °С в течение 48 ч.
Биомассу осаждали центрифугированием при 12000 g. Клетки дважды отмывали физиологическим раствором.
Экстракцию пигмента из клеток проводили подкисленным 96%-ным этанолом (9 мл этанола + 1 мл 1 N HCl). Полученный экстракт высушивали на воздухе и повторно элюировали. Эту процедуру повторяли трижды.
Концентрацию продигиозина определяли спектрофотометрически [7]. Спектр поглощения полученного пигментного препарата продигиозина в подкисленном этаноле регистрировали на спектрофотометре Lambda 35 (Perkin Elmer instruments, USA) в ультрафиолетовой и видимой областях спектра. Полученные препараты продигиозина имели оптический спектр, характерный для про-дигиозина в подкисленном этаноле (рис. 1).
nm
1.2. Определение острой летальной токсичности. Определение острой летальной токсичности полученного пигментного препарата проводили в экспресс-тесте с использованием Paramecium caudatum [8]. Тест на Paramecium caudatum является одним из наиболее адекватных методов для определения токсичности, дающим хорошо читаемые результаты даже при исследовании очень низких концентраций токсикантов. Основным критерием для определения токсичности соединения является выживаемость тест-организмов в течение 1 ч в исследуемом растворе.
Препарат продигиозина исследовали в диапазоне концентраций от 0.01 до 50 мкг/мл. В качестве контроля экспонировали Paramecium caudatum в фосфатном буфере. Разведения пигментного препарата готовили в стерильной водопроводной дехлорированной воде. Достоверным считали результат, если гибель инфузорий в контрольном варианте не превышала 10%.
Тестируемая жидкость оценивается как оказывающая острое летальное действие, если в течение 1 ч в ней погибло 50 и более процентов инфузорий. При определении острой летальной токсичности разбавлений пробы устанавливали среднюю летальную концентрацию ЛКр50, вызывающую гибель 50% тест-объектов в течение 1 ч. На основании полученных данных рассчитывали LD50 исследуемых веществ для Paramecium caudatum, где LD50 - доза вещества, вызывающая гибель 50% особей тест-объекта.
1.3. Токсикологические эффекты по отношению к микроорганизмам.
Проверке на мутагенность предшествовала проверка токсичности препарата по отношению к тестерным штаммам для исключения возможности получения лож-ноотрицательных результатов на мутагенность. При определении общей токсичности препаратов безусловный интерес представляет оценка их генотоксического потенциала. Как правило, для этой цели на первых этапах исследования применяются тесты на мутагенность с использованием бактерий. Тест на индукцию мутаций у бактерий, который представляет собой основу всех скрининговых программ, был разработан Эймсом и его коллегами [9, 10]. Наиболее широко используется метод, основанный на индукции обратных мутаций у специально сконструированных штаммов Salmonella typhimurium. Тест Эймса проводили согласно методическим указаниям [11] и издания ВОЗ «Руководство по краткосрочным тестам для выявления мутагенных и канцерогенных химических веществ» (Женева, 1989).
В работе использовали тестерный штамм Salmonella typhimurium TA 100, ауксотрофный по гистидину, ревертирующий к прототрофности по типу замены пар оснований. В каждый опыт включали отрицательный контроль для проверки спонтанного уровня мутирования и положительный контроль - для исследования стандартных мутагенов. В работе в качестве последнего использовали нитрозогуанидин. Этот контроль необходим для проверки корректности проводимого опыта. Увеличение в 2.5 раза и более частоты мутаций по сравнению с фоновым уровнем в сочетании с дозовой зависимостью эффекта указывает на положительный результат испытаний [11].
1.4. Статистическая обработка результатов. Математическую обработку данных проводили в стандартной компьютерной программе. Достоверность отличия опытных вариантов от контрольных оценивали с помощью критерия Стью-дента. Результаты считали достоверными при критерии вероятностир < 0.05.
2. Результаты и их обсуждение
2.1. Определение острой летальной токсичности на тест-объекте Paramecium caudatum. Оценка острой летальной токсичности в тесте показала, что пигментный препарат, LD50 которого установлена для концентрации 0.021 мкг/мл обладает, значительным токсическим эффектом (табл. 1).
Табл. 1
Токсичность пигментного препарата в тесте с использованием Paramecium caudatum
Концентрация пигментного препарата, мкг/мл Смертность, %
0 0
0.021 50
0.05 80
0.1 100
Повышение концентрации более чем в два раза не приводит к увеличению смертности до 100%. В условиях опыта абсолютно летальная концентрация составила величину 0.1 мкг/мл.
2.2. Индукция генных мутаций пигментным препаратом в тесте Эймса без метаболической активации. Исследование мутагенной активности пигментного препарата на тестерном штамме ^ typhimurium ТА 100 проводили в диапазоне концентраций 0.005-0.5 мкг/мл. Диапазон концентраций был определен результатами предварительных исследований, в которых было выявлено значительное подавление роста штамма при концентрации 1 мкг/мл и выше. Пигментный препарат в тесте Эймса вызывает повышение числа колоний-ре-вертантов над спонтанным фоном мутирования тестерного штамма до 5.6 раз при наивысшей из исследуемых концентраций. Обнаруженный эффект носит дозозависимый характер (табл. 2).
Табл. 2
Мутагенная активность препарата продигиозина на штамме S. typhimurium TA 100
Концентрация пигментного препарата, мкг/мл Число колоний-ревертантов Превышение над спонтанным фоном мутирования, раз
0.00 26 ± 3.4 -
0.05 83 ± 5.2 3.1
0.10 124 ± 8.6 4.7
0.50 145 ± 8.3 5.6
НГ 249 ± 12.1 9.6
Результаты исследований в тесте Эймса без метаболической активации показывают, что соединение в исследуемом диапазоне концентраций индуцирует генные мутации у S. typhimurium TA 100: среднее число Ы8+-ревертантов превышает спонтанный фон мутирования от 3 до 5.6 раз, что свидетельствует о слабой мутагенной активности соединения [11].
Согласно литературным данным [12, 13], продигиозин обладает антимикробной, противомалярийной активностью, что согласуется с полученными данными по токсичности пигмента в отношении инфузорий и бактерий. Для продигиозина показаны иммуносупрессивная и цитотоксическая активности [5, 14]. Цитотоксическая активность продигиозина проявляется в отношении различных линий злокачественных клеток человека in vitro и in vivo [4]. Однако не-
изученным остается вопрос, что является мишенью для продигиозина. Геноток-сическая активность продигиозина до настоящего времени не исследовалась.
Заключение
Препарат бактериального пигмента продигиозина, рекомендуемый в качестве красителя и маркера, обладает значительным токсическим эффектом в отношении тест-объекта Paramecium caudatum. Исследуемый пигментный препарат индуцирует генные мутации типа замены пар оснований в клетках S. typhimurium TA 100, вызывая дозозависимое превышение над спонтанным фоном мутирования.
Выражаем искреннюю благодарность Ирине Евгеньевне Черепневой за ценные замечания и полезные советы, данные при написании статьи.
Summary
I.D. Gurianov, D.V. Yusupova. Toxicological Effects of Bacterial Pigment Prodigiosin. Antimicrobial tests and the express-test with Paramecium caudatum show prodigiosin to possess toxic effect even when used in low concentrations (if compared with known toxicants). In a series of concentrations of 0.5-0.1-0.05 ^g/ml the test for genetic toxicity expressed weak mutagenic activity of the pigment. The determined toxicological effects of pro-digiosin indicate some properties of the pigment important for its use in various branches of medicine and biotechnological industry.
Key words: Serratia marcescens, toxicological effects, prodigiosin, genetic toxicity.
Литература
1. ФеофиловаЕ.П. Пигменты микроорганизмов. - М.: Наука, 1974. - 218 с.
2. Патент 2129136 Российская Федерация, С1, 6C09B61/00, C08L23/04. Полимерная красящая композиция-концентрат / Габутдинов М.С., Рязанцева И.Н., Черевин И.Ф., Медведева Ч.Б., Валеева Н.Н., Куликова О.В., Андреева И.Н., Огородникова Т.И. -№ 97106747, 1999, Бюл. № 11; приоритет от 23.04.97.
3. Патент 2218381 Российская Федерация, С1, C10L1/00, C10M159/02, C10N30:20. Композиция, включающая нефтепродукт и маркер, способ и раствор для маркирования нефтепродукта, способ идентификации нефтепродукта и способ получения маркера / Гарейшина А.З., Петухова Е.В., Юсупова Д.В., Лебедев Н.А., Чертилина Т.Н., Пономарева А.З. - 2003, Бюл. № 34; приоритет от 22.07.02.
4. Perez-Tomas R., Montaner B., Llagostera E., Soto-Cerrato V. The prodigiosin, proapo-ptotic drugs with anticancer properties // Biochem. Pharmacol. - 2003. - V. 66, No 8. -P. 1447-1452.
5. Han S.B., Kim H.M., Kim Y.H., Lee C.W., Jang E.S., Son K.H., Kim S. U, Kim Y.K. T-cell specific immunosupression by prodigiosin isolated from Serratia marcescens // Int. J. immunopharmacol. - 1998. - V. 20, No 1-3. - P. 1-13
6. Someya N., Nakajima M., Hirayae K., Hibi T., Akutsu K. Synergistic antifungal activity of chitinolytic enzymes and prodigiosin produced by the biocontrol bacterium Serratia marcescens strain B2 against the gray mold pathogen, Botrytis cinerea // J. Gen. Plant. Pathol. - 2001. - V. 67, No 4. - P. 312-317.
7. Williams R.P., Gott C.L., Qadri S.M. Influence of temperature of incubation and type of growth medium on pigmentation in Serratia marcescens // J. Bacteriol. - 1971. - V. 106, No 2. - P. 438-443.
8. Наумова Р.П., Селивановская С.Ю., Черепнёва И.Е., Зарипова С.К., Гарусов А.В., Зарипов С.А. Экологическая биотехнология: Экспресс-тест на основе Рaramecium caudatum в экологическом мониторинге. - Казань: Науч.-образ. центр «Материалы и технологии XXI века», 2000. - 16 с.
9. Ames B.N., Lee F.D., Durston W.E. An improved bacterial test system for detection and classification of mutagens and carcinogens // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1973. -V. 70, No 3. - P. 782-786.
10. Maron D.M., Ames B.N. Revised methods for the Salmonella mutagenicity test // Mutat. Res. - 1983. - V. 113, No 3-4. - P. 174-210.
11. Фонштейн Л.М., Абилев С.К., Бобринев Е.В., Методы первичного выявления генетической активности загрязнителей среды с помощью бактериальных тест-систем. Метод. указания. - М., 1985. - 34 с.
12. Castro A.J. Antimalarial activity of prodigiosin // Nature. - 1967. - V. 213, No 5079. -P. 903-904.
13. Nakashima T., Kato Y., Yamaguchi K., Oda T. Evaluation of the anti-Trichophyton activity of prodigiosin analogue produced by y-proteobacterium, using stratum corneum epidermis of Yucatan micropig // J. Infect. Chemother. - 2005. - V. 11, No 3. - P. 123128.
14. Azuma T., Watanabe N., Yagisawa H., Hirata H., Iwamura M., Kobayashi J. Induction of apoptosis of activated murine splenic T-cells by cycloprodigiosin hydrochloride, a novel immunosuppressant // Immunopharmacology. - 2000. - V. 46, No 1. - P. 29-37.
Поступила в редакцию 19.10.07
Гурьянов Иван Дмитриевич - аспирант кафедры микробиологии Казанского государственного университета. E-mail: igurjano.27@mail.ru
Юсупова Дельбэр Вафовна - кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник кафедры микробиологии Казанского государственного университета. E-mail: Delber.Yusupova@ksu.ru
