CC BY
73
УДК 579.66:547.94
Е. В. Комлева, Н. И. Петухова, А. Д. Бадретдинов, Л. М. Султанова, В. В. Зорин
Исследование антимикробной активности пигментных препаратов Serratia sp. НС-Р1
Уфимский государственный нефтяной технический университет 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел.: (347) 243-19-35; е-mail: bio@rusoil.net
Исследован фракционный состав пигментов, продуцируемых новым почвенным изолятом Serratia sp. НС-Р1, выделенным из нефтеокис-ляющего биоценоза. Выявлен пигмент, проявляющий в концентрации 6 мг/л высокую антибактериальную активность в отношении грамположительных бактерий Micrococcus sp., Bacillus sp., Staphylococcus aureus.
Ключевые слова: микроорганизмы, антибактериальная активность, пигменты
Известно, что бактерии рода Serratia (S. marcescens и S. plymutica) способны продуцировать продигиозины, обладающие антимикробной, противомалярийной и иммуносуп-рессивной активностями 1-7.
В последние годы использование современных методов исследования антибиотической активности веществ на клеточном и молекулярном уровне позволило выявить у ряда продигиозинов уникальную цитотоксическую активность в отношении раковых клеток 8. Так, описано, что гидрохлорид циклопродиги-озина индуцирует апоптоз в опухолевых клетках как in vitro, так и in vivo. Отмечается его высокая эффективность в отношении клеточных линий рака печени, груди, ободочной кишки 9-11 с отсутствием токсичности к нормальным клеткам 11. Продигиозин также индуцирует апоптоз раковых желудочно-кишечных
клеточных линии при незначительной токсичности в отношении незлокачественных клеточных линий 3 12 13. Высокая избирательность к раковым клеткам позволяет рассматривать продигиозины как потенциальные новые противораковые лекарства с уникальным меха-11
низмом действия .
Совместно с продигиозинами некоторые штаммы серратий могут синтезировать и другие практически важные биологически активные вещества, такие как ооцидины — ингибиторы роста оомицетов, возбудителей гнили растений 14, сер-раветтины (серратомолиды) — циклические пептидные антибиотики 15, карбопенем — антибактериальный ß-лактамный антибиотик широкого спектра действия 16.
При исследовании свойств пигментобразу-ющих почвенных бактерий НС-Р1, выделенных нами из нефтеокисляющего биоценоза, была установлена их принадлежность к бактериям рода Serratia.
В результате фракционирования на колонке с силикагелем суммарного пигментированного препарата, выделенного из культу-ральной жидкости экстракцией этилацетатом, были получены три окрашенные фракции (1—3), которые элюировались различными растворителями (рис. 1). Красно-оранжевая фракция 1 элюировалась смесью гексан-
0
100
200
300
400
500
Объем элюата, мл Рис. 1. Кривая элюирования пигментных препаратов
Дата поступления 21.03.07
этилацетат (2:1). Розово-малиновая фракция 2 была элюирована смесью хлороформ — этанол (95 : 5), а розово-коричневая фракция 3 — смесью равных количеств хлороформа и этанола.
По данным УФ-спектрометрии, максимумы поглощения пигментированных фракций в этаноле и в водном кислом растворе близки к 535 нм, что соответствует максимуму поглощения продигиозинов (табл. 1) 8' 17. В щелочных условиях максимум поглощения фракции 1 смещался в более коротковолновую область, что также характерно для продигиози-ноподобных пигментов 17.
Таблица 1
Максимумы поглощения пигментированных фракций
Растворитель Максимумы поглощения, нм
Фракция 1 Фракция 2 Фракция 3
этанол 539 538 542
вода, рН 2 535 — —
вода, рН 9 466 - -
W
О 20000 И
15000 10000 5000 0
1 фракция 2 фракция 3 фракция контроль
□ Micrococcus sp. □ Bacillus sp.
□ Staphylococcus aureus ^Pseudomonasputida ■ Escherichia coli
Рис. 2. Влияние пигментов исследуемых фракций (100 мг/л) на рост тест-культур
В то же время в случае грамположитель-ных бактерий все три фракции пигментов показали антибиотическую активность, однако, при данной концентрации антибиотиков только фракция 1 полностью подавляла рост микроорганизмов (рис. 2).
При исследовании действия фракции 1 на рост грамположительных бактерий в области более низких концентраций было обнаружено, что данный препарат оказывает высокое антибактериальное действие даже при 6 мг/л препарата (рис. 3).
8000
6000
W
о
« 4000
Была исследована антибактериальная активность полученных пигментных препаратов в отношении некоторых грамположительных (Micrococcus sp., Bacillus sp., Staphylococcus aureus) и грамотрицательных (Pseudomonas putida, Escherichia coli) бактерий.
Обнаружено, что полученные препараты, внесенные в ростовую среду для выращивания тест-культур в концентрации 100 мг/л, практически не оказывают антибиотического действия на грамотрицательные бактерии. Число колониеобразующих единиц этих микроорганизмов, полученных в присутствии пигментных препаратов, сопоставимо с КОЕ в контрольных вариантах без пигментов (рис. 2).
2000 0
I
I
0
50
3 6 12,5 25
препарат 1, мг/л
■ Micrococcus sp. □ Bacillus sp. □ Staphylococcus aureus
Рис. 3. Рост грамположительнъх бактерий в присутствии различнъх концентраций пигментов фракции 1
ТСХ-анализ полученных препаратов в системе хлороформ — метанол (95:5) показал, что они не являются гомогенными. Наибольшее количество компонентов (шесть) выявляется во фракции 2. Во фракции 1 основным компонентом является красный пигмент (Rf = 0.54). Вероятно, именно это соединение обладает высокой антибактериальной активностью в отношении грамположительных бактерий.
Экспериментальная часть
Бактерии выращивали на питательной среде на основе панкреатического гидролизата рыбной муки (г. Махачкала), содержащей 1% глицерина, при температуре 23—25 оС в течение 3—5 суток.
Идентификацию бактерий осуществляли в соответствии с 18.
Выделение пигментов проводилось следующим образом: биомассу отделяли от культу-ральной жидкости центрифугированием, после чего пигмент, содержащийся в супернатан-те, экстрагировали этилацетатом, осадок биомассы экстрагировали ацетоном, органические экстракты объединяли, сушили сульфатом натрия и упаривали в вакууме.
Колоночную хроматографию проводили на колонке с силикагелем 60 (0.063—0.2 мм), уравновешенной гексаном. Для элюирования фракции 1 в качестве элюента использовали смесь гексан : этилацетат (2:1). Фракцию 2 элю-ировали смесью хлороформ : этанол (95:5), а фракцию 3 — системой хлороформ : этанол (50:50).
Состав пигментированных фракций исследовали методом тонкослойной хроматографии на пластинках марки «Sorbfil» АФ-Ф-УФ в системе хлороформ — метанол (95:5).
Исследование биологической активности препаратов выделенных фракций пигмента
в отношении бактерий и грибов осуществля-19
лось, как описано в .
Литература
1. Campas C., Dalmau M., Montaner B., Barragan M., Bellosillo B., Colomer D., Pons G., Perez-Tomas R., Gill J. // Leukemia.— 2003.— V. 17.- P. 746.
2. Diaz-Ruiz C., Montaner B., Perez-Tomas R. // Histol. Histopathol.-2001.- V. 16.- P. 415.
3. Gerber N. N. // CRC Crit. Rev. Microbiol.-1975.- V. 3.- P. 469.
4. Isaka M., Jaturapat A., Kramyi J., Tanticha-roen M., Thebtaranonth Y. // Antimicrob. Agents Chemother.- 2002.- V. 46.- P. 1112.
5. Montaner B., Perez-Tomas R. // Curr. Cancer Drug Targets.-2003.- V. 3.- P. 57.
6. Ramoneda B. M., Perez-Tomas R. // Biochem. Pharmacol.- 2002.- V. 63.- P. 463.
7. Soto-Cerrato V., Llagostera E., Montaner B., Scheffer G. L, Perez-Tomas R. // Biochem. Pharmacol.- 2004.- V. 68.- P. 1345.
8. Cang S., Sanada M., Johdo O., Ohta Sh., Nagamatsu Y., Yoshimoto A. // Biotechnol. lett.- 2000.- V. 22.- P. 1761.
9. Yamamoto C., Takemoto H., Kuno K., Yamamo-to D., Tsubura A., Kamata K., Hirata H., Yamamoto A., Kano H., Seki T., Inoue K. // Hepatology.- 1999.- V. 30.- P. 894.
10. Yamamoto C., Takemoto H., Kuno K., Yamamo-to D., Nakai K., Baden T., Kamata K., Hirata H., Watanabe T., Inoue K. // Oncol. Rep.- 2001.-V. 8.- P. 821.
11. Han S. B., Kim H. M., Kim Y. H., Lee C. W., Jang E. S., Son K. H., Kim S. U., Kim Y. K. // Int. J. Immunopharmacol.- 1998.- V. 20.- P. 1.
12. Montaner B., Navarro S., Pique M., Vilaseca M., Martinell M., Giralt E., Gil J., Perez-Tomas R. // Br. J. Pharmacol.- 2000.- V. 131.- P. 585.
13. Nakashima T., Tamura T., Kurachi M., Yamaguchi K., Oda T. // Biol. Pharm. Bull.-2005.- V. 28, № 12.- P. 2289.
14. Strobel G., Li J.-Y., Sugawara F., Koshino H., Harper J., Hess W. M. // Microbiology.-1999.- V. 145.- P. 3557.
15. Matsuyama T., Bhasin A., Harshey R. M. // J. Bacteriol.- 1995.- P. 987.
16. McGowan S. J., Holden M. T. G., Bycroft B. W., Salmond G. P. C. // Antonie van Leeuwenhoek.-1999.- V. 75.- P. 135.
17. Song M.-J., Bae J., Lee D.-S., Kim C.-H., Kim J.-S., Kim S.-W., Hong S.-I. // J. of Bioscience and Bioengineering.- 2006.-V. 101, № 2.- P. 157.
18. Хоулт Дж., Криг Н., Снит П., Стейли Дж., Уильяме С. Определитель бактерий Берджи. В 2-х томах. Т. 1.- М.: Мир.- 1997.- T. 2.432 с.
19. Nakashima T., Kurachi M., Kato Y., Yamagu-chi K., Oda T. // Microbiol. Immunol.- 2005.-V. 49, № 5.- P. 407.
