CC BY
69
УДК 579.66:547.94
Е. В. Комлева, Н. И. Петухова, О. А. Васина, А. Н. Скорняков, В. В. Зорин
Исследование пигментообразования у микроорганизмов, выделенных из нефтезагрязненных почв
Уфимский государственный нефтяной технический университет 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел.: (347) 243-19-35; e-mail: bio@rusoil.net
Исследована способность бактериальных культур, выделенных из почвенных нефтеокисляю-щих биоценозов, продуцировать красно-розовые пигменты. Показано, что наиболее эффективно пигментообразование осуществляется на среде с панкреатическим гидролизатом рыбной муки и глицерином (1%) или оливковым маслом (4%). Выявлено, что на среде с глицерином более 90% пигментов остаются связанными с клетками микроорганизмов, тогда как на среде с оливковым маслом около 30—40 % пигментированных продуктов выделяются в среду. Установлено, что добавление в среду твердого субстрата стимулирует пигментообразование у микроорганизмов.
Ключевые слова: пигменты, антибиотики, бактерии.
Большинство природных веществ, использующихся в медицине, представлены антибиотиками, в том числе микробного происхождения 1-4. Однако, поиск новых веществ с антибиотической активностью по-прежнему остается актуальным в связи с высокой изменчивостью патогенных микроорганизмов и раковых клеток и, как следствие, их быстрой адаптацией к лекарственным препаратам.
Вместе с тем биосинтез многих перспективных лекарственных веществ микробным синтезом зачастую протекает с невысокими выходами из-за низкой эффективности продуцента. Это обуславливает необходимость поиска новых продуцентов и осуществления их фе-нотипической и генотипической оптимизации.
Известно, что многие микробные пигменты, а также метаболиты, обладающие эмульгирующей способностью, проявляют антибиотическую и противораковую активность 5-7.
Ранее среди нефтеокисляющих микроорганизмов, выделенных из почв, загрязненных нефтью, были найдены бактериальные штаммы НС-3012, НС-1224, Н-45-1, НС-Р11, НУ-341, НС-Р1, способные продуцировать красные пигменты и выделять эффективные эмульгаторы, стабилизирующие эмульсии углеводородов в воде 8. При исследовании продолжительности хранения культуральных жидкостей этих микроорганизмов в нестерильных условиях при комнатной температуре была обнаружена их высокая стабильность в течение 1—1.5 мес. Это позволило предположить, что найденные бактериальные культуры продуцируют вещества с антибиотической активностью.
В настоящей работе было исследовано влияние состава среды на пигментообразова-ние найденных микроорганизмов.
По данным УФ-спектрометрии максимумы поглощения пигментированных культу-ральных жидкостей исследуемых штаммов близки к 535 нм, что соответствует максимуму поглощения биологически активных пигментов, относящихся к продигиозинам 9.
При фракционировании культуральных жидкостей центрифугированием было обнаружено, что только часть пигмента накапливается внеклеточно, тогда как другая часть связана с биомассой. Из супернатанта культуральной жидкости пигмент практически полностью может быть извлечен однократной экстракцией этилацетатом, а из биомассы — двукратной обработкой ацетоном (табл. 1).
Сравнение оптических плотностей водных растворов суммарных пигментных препаратов, полученных при культивировании всех
Таблица 1
Степень извлечения пигмента*, %
Экстрагент Кратность растворителя Количество обработок Супернатант Биомасса
Этилацетат 1.5:1 1 96 —
Этилацетат 1.5:1 2 98 —
Ацетон 1 мл/100 мг (сырой вес) 1 — 78.7
Ацетон 1 мл/100 мг (сырой вес) 2 - 96
* Данные представлены для изолята НС-Р1. Дата поступления 21.03.07 162 Башкирский химический журнал. 2007. Том 14. №1
исследуемых микроорганизмов на панкреатическом гидролизате рыбной муки с глицерином (1%) показало, что наиболее активно пигмент образуется изолятом НС-Р1 (рис. 1).
О
2,5 2 1,5 1
0,5 0
си
К
О 2,5
2
ш
СО
ш
О 1,5
н И
си
|0,5Н с о
1
а
о
0 ^
пептон □ биомасса
гидролизат ■ пигмент
Исследование пигментообразования культурой НС-Р1 на глицеринсодержащих средах с различным содержанием субстрата позволило выявить, что наиболее активно увеличивался выход пигмента при концентрации глицерина 1% (рис. 3). При более высоких концентрациях субстрата (4%) биосинтез пигмента подавляется.
Рис. 1. Оптическая плотность водных растворов суммарных пигментных препаратов
Установлено, что при выращивании штамма НС-Р1 на жидкой среде с глицерином (1%) панкреатический гидролизат рыбной муки является более эффективной, чем пептон с дрожжевым автолизатом, добавкой к среде, как для роста микроорганизма, так и для синтеза пигмента (рис. 2).
3 '
Рис. 2. Прирост биомассы и образование пигмента при выращивании штамма НС-Р1 на среде с панкреатическим гидролизатом рыбной муки и пептонно-дрожжевой среде
Выход биомассы и пигмента в 3-х-суточ-ной культуре при росте на гидролизате рыбной муки в 1.5 и 2.6 раза превышал количества биомассы и пигмента при росте на пептоне и дрожжевом автолизате.
глицерин1%глицерин 4% оливковое подсолнечное этанол масло масло
Рис. 3. Влияние различных источников углерода на пигментообразование штамма НС-Р1
Установлено, что этот микроорганизм может активно синтезировать пигменты при росте на растительных маслах (оливковом или подсолнечном), что указывает и на его способность продуцировать также липазу. При этом на среде с оливковым маслом в конце ферментации наблюдался более высокий выход пигмента (сопоставимый с выходом на среде с глицерином). Подсолнечное масло оказалось менее эффективным субстратом.
В то же время, использование в качестве субстрата этанола оказалось нецелесообразным, так как при росте микроорганизмов в присутствии этого соединения синтез пигментов не осуществлялся.
Выяснилось, что природа источника углерода, используемого для выращивания микроорганизма, влияет на соотношение уровней внеклеточного и связанного с клетками пигментов (рис. 4).
При росте культуры на глицерине основное количество пигмента (более 90%) ассоциировано с клетками, в то время как на среде с растительными маслами доля внеклеточного пигмента увеличивается до 30—40 %.
100% п
80% -
H К 60%-
<u
S 40%-
s
с 20%-
0%
я s
5
я s
5
о к
F <u К
ч о о ч о G
<ц
о
m §
m S
ч о
Г
□ внеклеточный пигмент □ пигмент, связанный с клетками
Рис. 4. Влияние источника углерода на соотношение уровня внеклеточного и связанного с клетками пигмента
В литературе описано значительное увеличение выхода антибиотиков в присутствии твердой фазы. Так, добавление небольшого количества твердого носителя (активированного угля) в культуральную жидкость Bacillus subtilis ATCC 21332 приводило к увеличению выхода сурфактина — известного эмульгатора с антибиотической активностью более чем в 36 раз 10. В случае продуцентов продигиозина также показано положительное влияние адсорбента (гидрофобной полиароматической смолы Diaion HP-20) на выход пигмента 11 12. Более того, описан штамм S. marcescens JCM 1239, который вообще не синтезировал пигмент при росте на жидкой среде, но активно накапливал его
13
на агаризованной среде 13.
В случае культуры НС-Р1 показано, что при культивировании микроорганизмов на агаризованной среде выход пигментов в расчете на единицу биомассы (ОД535/ОДб00) превышает аналогичный показатель на жидкой среде того же состава на 64% (рис. 5).
100
«
IS 80
60
40
20
твердофазное
глубинное
Рис. 5. Относительный выход пигмента, синтезируемого при росте культуры НС-Р1 на жидкой и ага-ризованной среде одинакового состава
Таким образом, выявлены некоторые условия культивирования бактериальных культур — продуцентов красных пигментов (предположительно продигиозинов), обеспечивающие активное пигментообразование.
Материалы и методы
Объектами исследования служили бактерии, образующие красные пигменты. Бактерии были выделены из нефтеокисляющих биоценозов, отобранных из нефтезагрязненных почв Республики Башкортостан и Западной Сибири.
Бактерии выращивали на питательной среде, содержащей 3.5% панкреатического гидролизата рыбной муки (г. Махачкала), или на среде с пептоном (0.3%) и дрожжевым авто-лизатом (0.3%). В качестве дополнительного источника углерода в среду вносили глицерин (1—4 %), оливковое или подсолнечное масло (4%) или этанол (1%).
Глубинное культивирование микроорганизмов проводили в качалочных колбах объемом 250 мл на термостатированной качалке УВМТ-12-205 при 115 об/мин и температуре 23—25 оС. По окончании культивирования биомассу микроорганизмов отделяли от куль-туральной жидкости центрифугированием. Пигмент, содержащийся в супернатанте, экстрагировали этилацетатом, а в осадке биомассы — ацетоном.
При поверхностном твердофазном культивировании в среду с глицерином (1%) вносили агар-агар (18 г/л). Культивирование проводилось в чашках Петри в термостате при температуре 23—25 оС. Пигмент выделяли из собранной биомассы экстракцией ацетоном (1 мл растворителя на 50 мг биомассы).
Уровень пигментов в экстрактах оценивали по величине их оптической плотности при длине волны 535 нм на приборе Specol 221.
Литература
1. Knight V., Sanglier J.-J., DiTullio D., Braccili S., Bonner P., Waters JHughes., D., Zhang L.// Appl. Microbiol. Biotechnol.- 2003.- V. 62.-P. 446.
2. Demain A. L. // Appl. Microbiol. Biotechnol.-1999.- V. 52.- P. 455.
3. Gupte M., Kulkarni P., Ganguli B. N. // Appl. Microbiol. Biotechnol.- 2002.- V. 58.- P. 46.
4. Pillai O., Dhanikula A. B., Panchagnula R.// Current Opinion in Chemical Biology.- 2001.-V. 5.- P. 439.
5. Liora Z. Ron, Rosenberg E. // Env. Microbiol.-2001.- V. 3.- P. 229.
0
6. Rozenberg E., Ron E. Z. // Appl. Microbiol Biotechnol.- 1999.- V. 52.- P. 154.
7. Li H., Tanikawa T., Sato Y., Nakagawa Y., Matsuyama T. // Microbiol. Immunol.- 2005.-V. 49.- P. 303.
8. Комлева Е. В., Булатова Р. И., Петухова Н. И., Зорин В. В. // Баш. хим. ж.- 2006.- № 1.- С. 84.
9. Cang S., Sanada M., Johdo O., Ohta S., Nagamatsu Y., Yoshimoto A. // Biotechnol. Lett.- 2000.- V. 22.- P. 1761.
10. Yeh M. S., Wei Y. H., Chang J. S. // Biotechnol. Prog.- 2005.- V. 21, № 4.- P. 1329.
11. Min-Jung Song, Jungdon Bae, Dae-Sil Lee, Chang-Ho Kim, Jun-Seok Kim, Seung-Wook Kim, Suk-In Hong // Bioscience and Bioengineering.- 2006.- V. 101, № 2.- P. 157.
12. Feng J. S., Webb J. W., and Tsang J. C. // App. Environ. Microbiol.- 1982.- V. 43.- P. 850.
13. Gott L., Robert H., Willams H. // Ampu. Micistology.- 1972.- V. 3.- P. 591.
