CC BY
38
УДК 579.66:547.94
Е. В. Комлева (асп.), В. В. Федорова (студ.), Н. И. Петухова (к.биол. н., доц.), В. В. Зорин (чл.-корр. АН РБ, д.х.н., проф., зав. каф.)
Исследование влияния источников углерода на рост и синтез серраветтина W1 бактериями Serratia sp. НС-Р1
Уфимский государственный нефтяной технический университет, кафедра биохимии и технологии микробиологических производств 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел. (347) 2431935, е-mail: bio@rusoil.net
E. V. Komleva, V. V. Fedorova , N. I. Petukhova, V. V. Zorin
The influence of carbon sources on the growth of bacteria Serratia sp. НС-Р1 and synthesis of serrawettin W1
Ufa State Petroleum Technological University 1, Kosmonavtov Str, 450062, Ufa, Russia; ph. (347) 2431935, e-mail: bio2@rusoil.net
Низкомолекулярный биосурфактант, продуцируемый бактериями Serratia sp. НС-Р1, идентифицирован по спектрам ЯМР как серраветтин W1. Изучено влияние различных источников углерода (оливкового и подсолнечного масел, кулинарного жира, нефти, тетрадекана, гекса-декана, глицерина и сахарозы) на синтез серраветтина W1 при глубинном культивировании бактерий на среде с гидролизатом рыбной муки. Показано, что наиболее высокий выход продукта достигается на среде с гидрофильными субстратами (глицерином и сахарозой).
Ключевые слова: антибактериальная активность; биосурфактанты; микроорганизмы.
The low molecular biosurfactant produced by Serratia sp. HC-P1 bacteria was identified by NMR spectrum as serrawettin W1. The influence of various carbon sources (olive and sunflower oil, culinary fat, petroleum, tetradecane, hexadecane, glycerol and sucrose) on the synthesis of serrawettin W1 during submerged cultivation of bacteria on the medium with hydrolyzate of fish meal was studied. It is shown that the maximum yield is achieved on the medium with hydrophilic substrates (glycerol and sucrose).
Key words: antibacterial activity; biosurfactant; microorganisms.
Бактерии рода Serratia могут синтезировать липопептидные сурфактанты — серравет-тины (W1, W2 и W3), содержание которых может достигать 15% от сухого веса клетки Недавно было показано, что серраветтин W1 индуцирует задержку клеточного цикла и апоптоз в раковых клеточных линиях лейкемии, лимфомы, миеломы, карценомы, мелано-
мы и саркомы и не проявляет цитотоксичес-кие свойства к нормальным клеткам. Известна также антимикробная активность этого соеди-Это позволяет рассматривать серра-
нения
3,4
веттин W1 как перспективный хемотерапевти-ческий агент для лечения раковых опухолей и инфекционных заболеваний и делает актуальной разработку методов его получения с помощью микроорганизмов.
22
17 19
21
35 OH
30
28
O 33
серраветтин W1
Дата поступления 29.10.10
15
3
32
10
26
Ранее нами были найдены нефтеокисляю-щие бактерии Serratia sp. НС-Р1 — продуценты продигиозина 5, которые наряду с этим соединением синтезировали низкомолекулярный биосурфактант, проявляющий смачивающие свойства 6. Показано, что выделенный биосурфактант в концентрации 9 мг/л проявляет высокую антибактериальную активность в отношении грамположительных бактерий Micrococcus sp., Bacillus sp., Staphylococcus aureus.
По спектрам ЯМР С13 (рис. 1) и ПМР низкомолекулярный биосурфактант, продуцируемый бактериями Serratia sp. НС-Р1, был идентифицирован как серраветтин W1 7.
С целью поиска оптимальной среды для получения серраветтина W1 с помощью бактерий Serratia sp. НС-Р1 было исследовано влияние различных источников углерода на рост культуры и синтез целевого метаболита.
Основной функцией серраветтина W1 у бактерий считается обеспечение способности клеток осуществлять скользящее движение по поверхности твердой среды 8. Клетки мутантов, не способных синтезировать данный сур-фактант, образуют компактные колонии на поверхности агаризованной среды, тогда как клетки бактерий, продуцирующие серраветтин W1, распространяются по всей поверхности чашки Петри 9.
При исследовании влияния оливкового масла на рост культуры Serratia sp. НС-Р1, высеянной в центре чашки Петри на агаризо-ванную среду, содержащую панкреатический
гидролизат рыбной муки, было обнаружено, что в отсутствие липидов наблюдается рост, характерный для продуцентов серраветтина. В то же время, на среде с маслом распространение колонии ограничено, вероятно, из-за инги-бирования синтеза серраветтина W1 бактериями Serratia sp. НС-Р1 в этих условиях (рис. 1.).
Однако, при исследовании роста бактерий Serratia sp. НС-Р1 в жидких средах того же состава было обнаружено, что в присутствии оливкового масла образуется больше биомассы и серраветтина W1, чем на среде без масла (рис. 2). Аналогичные результаты были получены при внесении в среду подсолнечного масла и кулинарного жира.
Таким образом, введение в жидкую среду дополнительного источника углерода стимулирует синтез серраветтина W1 бактериями Serratia sp. НС-Р1.
С целью поиска более эффективных источников углерода был изучен рост бактерий и синтез исследуемого биосурфактанта на гидрофобных субстратах (нефти, тетрадекане, гек-садекане) и гидрофильных соединениях (глицерин и сахароза).
В экспериментах с глицерином и сахарозой было обнаружено, что культура накапливает меньше биомассы, чем на средах с липи-дами (рис. 3.). В то же время выход целевого продукта на гидрофильных субстратах значительно увеличивается.
Рис. 1. Спектр ЯМР С13 серраветтина W1, продуцируемого бактериями Serratia sp. НС-Р1
20
15
10
биомасса □ серраветтин W1
__С
100
75
50
25
1 2 3 4 5 6
варианты
Рис. 3. Рост бактерий Serratia sp. НС-Р1 и выход серраветтииа W1 на различных источниках углерода:
1 — гидролизам рыбной муки; 2 — кулинарный жир; 3 — оливковое масло; 4 — подсолнечное масло; 5 — глицерин; 6 — сахароза
5
0
0
CÖ
X
К
1= (U
и eö Л Л
(U
о
120 100 80 60 40 -20
варианты
Рис. 4. Сравнение выхода серраветтииа W1 в процессе культивирования бактерий Serratia sp. НС-Р1 на средах с углеводородами и глицерином: 1 — тетрадекан; 2 — гексадекан; 3 — нефть; 4 — глицерин.
0
В отличие от суспензионного роста бактерий Serratia sp. НС-Р1 на среде с глицерином или сахарозой, было обнаружено, что в присутствии углеводородовклетки микроорганизмов растут в основном на поверхности капель гидрофобных субстратов. Это указывает на высокую степень гидрофобности клеточной поверхности бактерий, растущих на углеводородах.
Сравнение эффективности синтеза серра-веттина Wim средах с углеводородами и среде с глицерином показывает, что его выход на гидрофобных субстратах в 12—30 раз ниже, чем на глицерине (рис. 4).
Возможно, благодаря глицерину, входящему в состав растительных масел и кулинарного жира, наблюдается суспензионный рост и повышенный выход серраветтина W1 при росте на этих липидах, по сравнению с углеводородами.
Таким образом, полученные результаты показывают, что наиболее перспективным субстратом для разработки методов получения серраветтина W1 с помощью культуры Serratia sp. НС-Р1 является глицерин, который, как известно, образуется в значительных количествах в качестве побочного продукта производства биодизеля 10. Можно предположить, что серраветтин W1, обладающий смачивающей способностью, синтезируется в условиях глубинного культивирования для снижения гидрофобности поверхности клеток с целью более эффективного использования водорастворимых субстратов.
Экспериментальная часть
Спектры ЯМР 1H и С записывали на спектрометре Bruker AM — 300 c рабочими частотами 300.13 (1H) и 75.47 (13С).
Для получения серраветтина W1 с целью его идентификации бактерии выращивали на агаризованной питательной среде на основе панкреатического гидролизата рыбной муки (г. Махачкала), содержащей 1% глицерина, при температуре 25—27 0С в течение 3 сут. Биомассу собирали с поверхности агаризован-ной среды и экстрагировали ацетоном. Полученный экстракт сушили сульфатом натрия, концентрировали на роторно-пленочном испарителе и очищали от примесей хроматографи-рованием на колонке с силикагелем 60 (0.063— 0.2мм), уравновешенной гексаном. В качестве элюента последовательно использовали смешанные растворители гексан—этилацетат (2:1) и ацетонитрил—вода (80:20). Наличие серра-веттина W1 в элюате контролировали методом
ТСХ на пластинках марки «Sorbfil» АФ-Ф-УФ в системе хлороформ—этанол—5М водный раствор аммиака (80:25:4). Пластинки проявляли 50% серной кислотой при 200 0С в течение 20 мин.
Серраветтин W1. ЯМР- 13С (CDCl3, 75MHz, ppm, S / м. д.): 14.065 (С21, С32), 22.612 (С20, С31), 25.782 (С16, С27), 29.197 (С18, С29), 29.576 (С17, С28), 31.776 (С19, С30), 32.645 (С15, С26), 40.418 (С3, С10), 54.559 (С6, С13), 63.015 (С23, С34), 72.354 (С2, С9), 169.487 (С7, С14), 169.598 (С4, С11); ЯМР - 1H (CDCl3, 300 MHz, ppm): 0.8 т (6H, СН3), 1.2 м (20Н, СН2), 1.6 м (4Н, СН2СН), 2.3 д, 2.55 д (4Н, СН2СО), 3.7 м (2Н, СНО), 4.05 м (4Н, СН2ОН), 4.4 м (2Н, СНМН), 5.2 с. уш. (2Н, ОН), 7.2 (д, 2Н, NH).
Влияние источников углерода на синтез серраветтина W1 изучали в процессе культивирования бактерий на жидких средах (рН 7), содержащих 35 г/л панкреатического гидро-лизата рыбной муки и 1% растительного масла (оливкового или подсолнечного), кулинарного жира, нефти, нефтепродуктов (тетрадекана, гексадекана, циклогексана, бензола), сахарозы или глицерина. Прирост биомассы микроорганизмов в жидких культурах оценивали нефелометрически при À=600 нм на спектрофотометре «Specol 221». Выход серраветтина W1 определяли весовым методом.
Литература
1. Matsuyama T., Fujita M., Yano I. // FEMS Microbiol. Lett.- 1985.- V. 28.- P. 125.
2. Patent № 0239694 A1.- USA.- 2005.
3. Wasserman, H. H., J. J. Keggi, and J. E. McKeon. // J. Am. Chem. Soc.- 1961.- V. 83.-P. 4107.
4. Dwivedi D., Jansen R., Molinari G., Nimtz M., Johri B.N., Wray V. // J. Nat. Prod.- 2008.-V. 71.- P. 637.
5. Петухова H. И., Хузина А. В., Файзрахмано-ва Л. С., Муслухов Р. Р., Комлева Е. В., Зорин В. В. // Баш. хим. ж.- 2009.- Т.16, №1.-С. 106.
6. Комлева Е. В., Шараева А. А., Петухова H. И., Зорин В. В. // Баш. хим. ж.- 2009.- Т. 16, №4.- С. 65.
7. Patent № US 2003/0049230 A1.- USA.- 2003
8. Ron E.Z., Rosenberg E. // Environ. Microbiol.-2001.- V. 3.- P. 229.
9. Li H., Tanikawa T., Sato Y., Nakagawa Y., Matsuyama T. // Microbiol. Immunol.- 2005.-№49.- P. 303.
10. Плетнев М. Ю. // Биотехнология.- 2009.-№1.- C. 3.
