CC BY
123
УДК 579.66:547.94
В. В. Федорова (студ.), Н. И. Петухова (к.биол.н., доц.), Л. Х. Халимова (к.тех.н., доц.), В. В. Зорин (чл.-корр. АН РБ, д.х.н., проф., зав. каф.)
Исследование условий синтеза биосурфактантов микроорганизмами
Уфимский государственный нефтяной технический университет, кафедра биохимии и технологии микробиологических производств 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел. (347) 2431935, е-mail: bio@rusoil.net
V. V. Fedorova, N. I. Petukhova, L. Kh. Khalimova, V. V. Zorin
Research of biosurfactant synthesis conditions by microorganisms
Ufa State Petroleum Technical Univercity 1, Kosmonavtov Str., 450062 Ufa, Russia; ph. (347) 431935, e-mail: bio@rusoil.net
С целью поиска перспективных продуцентов биосурфактантов гликолипидной природы с противораковой активностью осуществлен скрининг дрожжей и дрожжеподобных грибов, синтезирующих метаболиты с эмульгирующими и смачивающими свойствами. Показано, что ряд исследуемых культур микроорганизмов синтезируют соединения со свойствами, характерными для гликолипидов, при росте на агаризован-ной среде, содержащей сахарозу и оливковое масло. Наиболее эффективным продуцентом этих продуктов является дрожжевая культура 87-3.
Ключевые слова: биосинтез; биосурфактан-ты; гликолипиды; микроорганизмы.
Для эффективной химиотерапии раковых заболеваний необходимы доступные высокоактивные препараты, обладающие избирательным действием в отношении опухолевых клеток, не влияющие на развитие нормальных клеток организма. Соединения (таксол бету-линовая кислота , олеанановая и урсуловая кислоты 3 и др.), избирательно вызывающие аппоптоз (программируемую гибель) раковых клеток, обнаружены в некоторых растениях. Альтернативным источником природных противораковых средств являются микроорганизмы 4-9. В отличие от растений, с помощью микроорганизмов можно осуществлять направленный (контролируемый) синтез целевых метаболитов путем подбора условий культивирования продуцента или изменения его генетического аппарата. Это позволяет накапливать целевые соединения в количествах, значительно превышающих собственные потребности организма-продуцента.
Дата поступления 29.10.10
The screening of yeasts and yeast-like fungi producing metabolites with emulsifying and wetting properties was provided with the aim to find promising producers of biosurfactant of glycolipid nature with anticancer activity. It is shown, that some of the researched cultures can synthesize the compounds with properties, which are typical to glycolipids, during growth on agar medium containing sucrose and olive oil. The most effective producer of these products is the yeast culture 87—3.
Key words: biosynthesis; biosurfactants; gly-colipids; microorganisms.
Известно, что противораковую активность проявляют некоторые метаболиты микроорганизмов гликолипидной природы, обладающие поверхностно-активными свойствами (биосурфактанты) 8'9. В частности, некоторые дрожжевые штаммы при росте на среде с углеводами и растительными маслами 10,11 продуцируют в значительных количествах внеклеточные гликолипиды (софоролипиды или ман-нозилэритритоловые липиды) с эмульгирующими и смачивающими свойствами, которые ингибируют рост раковых клеток 8'9.
В настоящей работе осуществлен скрининг продуцентов гликолипидов среди дрожжей и дрожжеподобных грибов музея культур микроорганизмов УГНТУ (Candida sake 777, Candida sp. 81-12, C. guillermondii 87-8, Geotrichum spp. 85-1, D, P, Metschnikowia sp. 84-13, Pichia sp. 87-1, Rhodotorulla sp. 87-2, неидентифицированные дрожжи 87-3 и 87-7).
Нами была исследована способность микроорганизмов расти и синтезировать эмульгаторы или смачивающие агенты на агаризованной среде СР-1, содержащей сахарозу и оливковое масло.
При культивировании дрожжей при температуре 32 оС в течение 5 сут было обнаружено, что микроорганизмы хорошо растут на данной среде. Суспензии пятисуточной биомассы микроорганизмов в 0.05 М фосфатном буфере (50 мг/мл) проявили способность стабилизировать эмульсии хлороформа в воде (рис. 1). Наиболее высокие индексы эмульга-ции (60—70 %) были получены для суспензий клеток дрожжей 87-3 и 87-7, а также грибов Geotrichum sp. D.
При нанесении капель суспензий на гидрофобную поверхность было обнаружено, что они смачивают поверхность (растекаются) более значительно, чем вода (рис. 2). Установлено, что наибольшей смачивающей способностью обладают суспензии дрожжей 87-3, 87-7 и Candida guillermondii.
При экстракции биомассы дрожжей этил-ацетатом были получены экстракты, отличающиеся способностью образовывать эмульсии хлороформа с водой (1:1).
В результате ТСХ-анализа экстрактов биомасс микроорганизмов в системе раствори-тел ей (хлороформ—этанол—аммиак, 65:15:2), рекомендованных для выявления гликолипидов, обнаружены соединения с Rf = 0.5 и Rf = 0.74 (табл.1), близкими по величине к описанным в литературе значениям Rf для софоролипидов и маннозилэритритоловых липидов 8'12.
Однако во всех случаях выявленные соединения давали лишь слабоокрашенные пятна по сравнению с пятнами масла и жирных кислот, что указывает на низкий уровень их содержания в биомассе.
Низкий выход эмульгаторов может быть обусловлен как отсутствием способности исследуемых микроорганизмов к сверхпродукции этих веществ, так и тем, что выбранные условия их синтеза далеки от оптимальных. Известно, что синтез гликолипидов дрожжами зависит от многих факторов: начальной кислотности среды, температуры, природы источников азота и углерода, а также их соотношения 13. Кроме того, возможно подавление процесса утилизации масла в присутствии углевода (катаболитная репрессия) 10. Синтез маннозил-эритритоловых эфиров с высоким выходом удалось осуществить с помощью дрожжей рода Pseudozyma alphidis при двухстадийном культивировании продуцентов. На первой стадии использовали среду с высоким содержанием углеводов, а на второй — среду с растительным маслом 14.
Подобный подход был использован нами для выявления гликолипидов у дрожжей 87-3 и повышения их продуктивности. Дрожжи культивировали в течение 2 сут на качалке на среде СР-2, содержащей 4% глюкозы, после чего клетки переносили в среду СР-3 с оливковым маслом (8%) и продолжали инкубировать еще в течение 7 сут.
Установлено, что в указанных условиях культура 87-3 растет суспензионно. Имеет ме-
80 70 -60 -50 -40 -30 -
I
S 20 -10 -0
s=
1н
Л
и
m и
, О0
1 SS
00 00
S ^ &
и |
1 о ЙС
Рис. 1. Эмульгирующая способность микроорганизмов
Таблица 1
Коэффициенты хроматографической подвижности соединений, полученных экстракцией биомассы микроорганизмов этилацетатом
Штаммы Соединения Штаммы Соединения
Candida sp. 81-12 Rf = 0.48 Pichia sp. Rf = 0.48
Metschnikowia sp. 84-13 Rf = 0.53 Rhodotoruiia sp. Rf = 0.5
Candida sake 111 Rf = 0.5 Geotrichum sp. P Rf = 0.5
Candida guiilermondii Rf = 0.5 Geotrichum sp. D Rf = 0.5
культура 81-3 Rf = 0.14 Rf = 0.48 Geotrichum sp. 85-1 Rf = 0.5 Rf = 0.1
культура 81-1 Rf = 0.51
К
2
4
К
К - вода;
3 - Candida sake 777; 6 - C. guiilermondii 87-8; 9 - Geotrichum sp. P;
9
10
11
1 - Candida sp. 81-12; 4 - Pichia sp. 87-1; 7 - культура 87-7; 10 - Geotrichum sp. 85-1;
2 - Metschnikowia sp. 84-13; 5 - культура 87-3; 8 - Rhodotorulla sp. 87-2; 11 - Geotrichum sp. D
Рис. 2. Смачивающая способность суспензий микроорганизмов
сто образование эмульсии, но клетки не включаются в эмульсию, что косвенно свидетельствует об образовании внеклеточных эмульгаторов. При длительном культивировании дрожжей 87-3 было обнаружено появление оранжевых гидрофобных капель на поверхности среды. Согласно литературным данным, при культивировании дрожжей Р$вийогута а1рНгйг$ в среде появлялись зеленовато-желтые капли маннозилэритритоловых липидов, когда их концентрация превышала 40 г/л 14.
ТСХ-анализ выделившейся на поверхности семисуточной культуральной жидкости дрожжей 87-3 окрашенной гидрофобной фазы позволил выявить наряду с исходным оливковым маслом и жирными кислотами, являющимися продуктами его гидролиза в условиях культивирования, два новых соединения (рис. 3). Характерно, что выявленные соединения проявляются антроновым проявителем, использующимся для селективного окрашивания угле-
15
водсодержащих липидов .
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют в пользу того, что штамм 87-3 является продуцентом гликолипидов и перс-
пективен для дальнейшего исследования образующихся продуктов, в том числе их биологической активности.
оливковое масло
соединение 1 соединение 2
жирные кислоты линия старта
Рис. 3. ТСХ этилацетатной фракции биомассы дрожжей 87-3
1
3
5
6
7
8
Экспериментальная часть
Объектом исследований служили дрожжи и дрожжеподобные грибы из коллекции культур микроорганизмов кафедры биохимии и технологии микробиологических производств УГНТУ.
В зависимости от условий эксперимента микроорганизмы выращивали на твердой среде СР-1 или на жидких средах СР-2, СР-3 и СР-4 при температуре 32 оС в течение 3—12 сут.
Состав среды СР-1: глюкоза — 3%, оливковое масло — 2%, дрожжевой автолизат — 0.5%, ^Н4)^04 - 0.1%, КН2Р04 - 0.1%, ШН2Р04 -0.1%, MgS04•7Н20 - 0.03 %, агар-агар - 2%.
Состав среды СР-2: глюкоза - 4%, №N0-5 - 0.3%, MgS04•7Н20 - 0.03%, КН2Р04 -0.03%, дрожжевой автолизат - 0.1%.
Состав среды СР-3: оливковое масло -8%, NaN03 - 0.3%, MgS04•7Н20 - 0.03%, КН2Р04 - 0.03%, дрожжевой автолизат - 0.1%.
Для определения индекса эмульгации биомассу собирали с поверхности агаризованной среды СР-1. 50 мг собранной биомассы суспендировали в 1 мл 0.05 М фосфатного буфера рН 7. В пробирку с полученной суспензией добавляли 1 мл хлороформа и резкими движениями встряхивали для образования эмульсии. Индекс эмульгации Е24 оценивали через 24 ч как отношение высоты эмульсионного слоя к общей высоте жидкости в пробирке.
Для исследования смачивающих свойств биомассы каплю суспензии микроорганизмов, выросших на среде СР-1, наносили на стеклянную пластину, натертую парафином. В качестве контроля на пластину наносили каплю воды.
Продукты биосинтеза трижды экстрагировали из биомассы и культуральной жидкости этилацетатом и анализировали методом ТСХ на пластинах Soгbfil. ТСХ-анализ осуществляли в системе хлороформ:этанол:амми-
ак (65:15:2), рекомендованной для выявления гликолипидов 12'15. В качестве проявителя использовали раствор: ледяная уксусная кислота 50 мл, серная кислота 1 мл, анисовый альдегид 0.5 мл. Для избирательного проявления гликоли-пидов использовали антроновый проявитель
15
Литература
1. Wani M. C., Taylor H. L., Wall M. E., et al. // J. Am. Chem. Soc.- 1971.- V. 93.- P. 2325.
2. Pisha E., Chai H., Lee I., Chagwedera T. E., et al. // J. Nat. Med.- 1995.- №1.- P. 1046.
3. Feria-Romero I., Lazo E., Ponce-Noyola T., Cerda-Garcia-Rojas C.M., Ramos-Valdivia A.C. // Biotechnology Letters (2005) 27: 839-843
4. Reichenbach H. // J. Ind. Microbiol. Bio-technol.- 2001.- V. 27.- P. 149.
5. Frykman S., Tsuruta H., Lau J., Regentin R., Ou S., Reeves C., Carney J., Santi D., Licari P. // J. Ind. Microbiol. Biotechnol.- 2002.- V. 28.-P. 17.
6. Khanafari A., Assadi M. M., Fakhr F.A. // Online Journal of Biological Sciences.- 2006.-V 6.- P. 1.
7. Patent № 0239694 A1.- USA.- 2005.
8. Jing C., Xin S., Hui Z., Yinbo Q. // Enzym. Microbial. Technol.- 2006.- V. 39.- P. 501.
9. Arutchelvi J.I., Bhaduri S., Uppara P.V., Doble M. // J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 2008.- V. 35.- P. 1559.
10. Morita T., Konishi M., Fukuoka T., Imura T., Kitamoto D. // Appl. Microbiol. Biotechnol.-2007.- V. 74.- P. 307.
11. Kitamoto D., Isoda H., Nakamura T. // J. Biosience and Bioengineering.- 2002.- V. 94, №3.- P. 187.
12. Fukuoka T., Morita T., Konishi M., Imura T., Kitamoto D. // Biotechnol. Lett.- 2007.-V. 29.- P. 1111.
13. Hewald S., Josephs K., Bolker M. // Appl. Environ. Microbiol.- 2005.- P. 3033.
14. Rau U., Nguyen L.A., Roeper H., Koch H., Lang S. // Appl. Microbiol. Biotechnol.- 2005.- V. 68.-P. 607.
15. Kitamoto D., Akiba S., Hioki C., Tabuchi T. // Agric. Biol. Chem.- 1990.- V. 4.- P. 31.
