CC BY
121
УДК 579.66:579.22
О. В. Ландер (асп.), Н. И. Петухова (к.биол.н., доц.), Е. И. Хадарина (студ.), В. В. Зорин (чл.-корр. АН РБ, д.х.н., проф., зав. каф.)
Исследование роста и липолитической активности дрожжей Pichia sp. 87-3 при культивировании на средах с растительными маслами
Уфимский государственный нефтяной технический университет, кафедра биохимии и химической технологии 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел. (3472) 431935, e-mail: bio@rusoil.net
O. V. Lander, N. I. Petukhova, E. I. Khadarina, V. V. Zorin
Research of growth and lipolytic activity of yeasts Pichia sp. 87-3 on media with vegetable oils
Ufa State Petrolium Technical Univercity 1, Kosmonavtov Str., 450062, Ufa, Russia; ph. (347) 2431935, e-mail: bio@rusoil.net
Осуществлен поиск микроорганизмов, способных продуцировать липолитические ферменты, для гидролиза липидов грибов Mortierella alpina с целью получения арахидоновой кислоты. Для наиболее активной культуры Pichia sp. 87-3 исследована динамика роста и изменение липолитической активности культуральной жидкости при культивировании дрожжей на жидких средах с различными источниками углерода (оливковым, подсолнечным, арахисовым, рапсовым, льняным и кунжутным маслом). Показано, что наиболее эффективным индуктором липазы является арахисовое масло.
Ключевые слова: биоконверсия растительных масел; дрожжи; липолитическая активность.
The screening of microorganisms able to produce lipolytic enzymes for the hydrolysis of Mortierella alpina fungal lipids with the production of arachidonic acid. Fprthe most active culture Pichia sp. 87-3 the growth dynamics and variety of lipolytic activity of culture fluid during the yeast cultivation on liquid media with different carbon sources (olive, sunflower, peanut, rapeseed, linseed and sesame oils). It has been shown that the peanut oil is the most effective lipase inductor
Key words: bioconversion of vegetable oils; yeasts; lipolytic activity.
Одним из наиболее перспективных способов получения свободных полиненасыщенных жирных кислот из триглицеридов является мягкий ферментативный гидролиз под действием липаз. При химическом гидролизе три-ацилглицеридов свободные ненасыщенные жирные кислоты образуются с низким выходом, поскольку требуется их очистка от побочных продуктов, образующихся в результате термической деградации триацилглицеридов, окисления ненасыщенных жирных кислот и образования их транс-изомеров1.
Особый интерес представляют липазы микроорганизмов, которые могут проявлять региоспецифичность в отношении положения ацильных групп в триацилглицеридах, а также длины жирнокислотного остатка, положения и количества в нем двойных связей 2-5. Избирательный гидролиз липидов с помощью таких
липаз может быть использован для получения свободных жирных кислоты с высоким содержанием целевой полиненасыщенной жирной кислоты. Важнейшим источником арахидоно-вой кислоты являются липиды микроорганизмов 6'7. Известны несколько примеров использования бактериальных липаз, для получения ее из масла грибов Mortierella alpina 5'8, однако, на сегодняшний день не найдены высокоселективные липазы, которые способны осуществлять региоселективный гидролиз липидов исключительно с элиминированием целевой кислоты. Как правило, образуется смесь жирных кислот с повышенным содержанием ара-хидоновой кислоты и остается проблема ее доочистки 4'5. Препараты арахидоновой кислоты высокой чистоты (97%) 5 удается получить сочетанием ферментативных процессов с кар-бамидной доочисткой целевого продукта от сопутствующих насыщенных жирных кислот.
Дата поступления 19.10.11 26 Башкирский химический журнал. 2011. Том 18. Жо 4
В настоящей работе с целью создания эффективного метода получения арахидоновой кислоты из липидов, синтезированных фико-мицетом Mortierella alpina 18-1 6 или его мутантами 9'10, был осуществлен скрининг продуцентов липаз для региоселективного гидролиза грибного масла.
В результате тестирования роста 23 культур микроорганизмов на агаризованной среде с грибным маслом, содержащим около 58% арахидоновой кислоты, и родамином 6G, был найден штамм Pichia sp. 87-3, который наиболее активно гидролизовал субстрат с высвобождением жирных кислот, образующих окрашенные комплексы с красителем.
С целью поиска более доступного, чем грибные липиды, источника углерода для получения препарата липаз, были исследованы рост и липолитическая активность дрожжей Pichia sp. 87-3 на жидких средах с различными растительными маслами. Необходимость такого исследования обусловлена тем, что липазы являются индуцибельными ферментами 11, синтез которых индуцируется растительными маслами, трибутирином, твинами и рядом других источников углерода 12-14. При этом величина липолитической активности культуры
значительно зависит от вида индуктора, в том
11
числе от вида растительного масла .
В качестве индукторов липолитической активности дрожжей использовали оливковое, подсолнечное, арахисовое, рапсовое, льняное и кунжутное масла, которые вносили в среду в концентрации 4%. В качестве инокулята использовали двухсуточную культуру дрожжей, выращенную на среде с глюкозой (1%).
При исследовании роста дрожжей Pichia sp. 87-3 в периодических условиях при 30 оС при перемешивании на качалке (180 об/мин) было обнаружено, что в большинстве случаев, за исключением подсолнечного масла, микроорганизмы росли суспензионно. В то же время, при культивировании дрожжей на подсолнечном масле клетки включались в верхний слой, представляющий собой эмульсию типа «масло в воде», иммобилизуясь на поверхности гидрофобных капель.
Исследование динамики роста суспензионных культур показало, что перенос клеток с углеводной среды на среды с маслами сопровождается продолжительным лаг-периодом, в ходе которого, как известно, должен индуцироваться синтез ферментов, необходимых для использования нового субстрата (рис. 1). После адаптации дрожжи наиболее активно увеличивали биомассу на среде с оливковым мас-
лом, однако, после третьих суток рост дрожжей на данном субстрате прекращался, вероятно, из-за накопления в среде ингибиторов. В то же время на остальных растительных маслах дрожжи продолжали увеличивать биомассу даже на пятые сутки культивирования. Наибольший выход биомассы (почти в 2 раза превышающий выход биомассы на оливковом масле) был достигнут на кунжутном масле.
50
40 --
30
20 --
10
- оливковое
- кунжутное
- арахисовое -льняное
- рапсовое
0 1 2 3 4 5 Время, сут
Рис. 1. Динамика прироста биомассы дрожжей Р1еМа эр. 87-3 при культивировании на средах с растительными маслами
Исследование липолитической активности культуральной жидкости с использованием в качестве субстрата оливкового масла показало, что во всех вариантах она достигает максимального уровня на третьи сутки (рис. 2). Однако величина активности трехсуточных культур существенно зависит от вида масла, используемого для выращивания дрожжей. Наименьшую липолитическую активность показали культуры, растущие на оливковом, кунжутном и подсолнечном маслах, тогда как наибольшая активность была достигнута на среде с арахисовым маслом.
600
500
Е «Г 400 --
Й 300 -
s 200 --
100
- оливковое
- кунжутное
- подсолнечное
- арахисовое
- льняное рапсовое
Рис. 2. Динамика липолитической активности куль-туральной жидкости при росте дрожжей РкМа эр. 87-3 на средах с растительными маслами
0
0
Следует отметить отсутствие корреляции между величиной липолитической активности дрожжей и выходом биомассы при росте на исследуемых маслах. Наиболее эффективным ростовым субстратом для получения липаз, продуцируемых дрожжами Pichia sp. 87-3, является арахисовое масло (рис. 2), тогда как наибольший выход биомассы получен на кунжутном масле (рис. 1).
Таким образом, в результате исследования выявлен новый продуцент липолитичес-ких ферментов (дрожжи Pichia sp. 87-3) и подобран источник углерода для синтеза липаз, представляющих интерес для создания методов получения арахидоновой кислоты из липи-дов грибов Mortierella alpina.
Экспериментальная часть
Экспресс-тестирование липолитической активности микроорганизмов осуществляли на агаризованной среде СР-1 (NaNO3 — 0.3%, MgSÜ4-7H20 - 0.03%, KH2PO4 - 0.03%, дрожжевой автолизат — 0.1%, агар-агар — 2%), содержащей масло гриба Mortierella alpina 18-1 — 2%, и родамин 6G — 0.003%, способный образовывать окрашенный комплекс со свободными жирными кислотами.
Рост и липолитическую активность Pichia sp. 87-3 исследовали при культивировании дрожжей на жидкой питательной среде СР-1 с 4% растительного масла (оливкового, подсолнечного, льняного, кунжутного, рапсового, арахисового) в колбах на 250 мл на качалке (180 об/мин) при температуре 30 оС в течение 5 сут. В качестве инокулята использовали двухсуточную культуру дрожжей, полученную на жидкой среде СР-1 с 2% глюкозы.
Рост дрожжей контролировали по изменению оптической плотности суспензии на спектрофотометре «Specol-10» при длине волны
520 нм. Липолитическую активность дрожжевой культуры определяли по модифицированному методу Отто-Ямада15 и выражали в мкмолях олеиновой кислоты, высвобождаемой из 40%-й эмульсии оливкового масла при рН 7.0 и температуре 37 °С в течение часа в присутствии 1мл культуральной жидкости.
Литература
1. Майдина // Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук.— Москва.— 2008.— 20 с.
2. Matori M., Asahara T., Ota Y. // J. Ferment. Bioeng.- 1991.- V.72.— P.397.
3. Bottino N. R., Vanderburg G. A., Reiser R. // Lipids.— 1967.— V.2.— P.489.
4. Kojima Y., Sakuraduni E., Shimizu S. // J. Bioscience Bioengin.— 2006.— V.101.— P.496.
5. Yamauchi A., Nagao T., Watanabe Y., Sumida M., Kobayashi T., Shimada Y. // J. Am. Oil Chem. Soc.— 2005.— V.82.— P.833.
6. Петухова Н. И., Рахматуллина Ю. Р., Яхуто-ва Я. Р., Спирихин Л. В., Зорин В. В. // Баш. хим. ж.— 2006.— Т.13, №1.— С.95.
7. Дедюхина Э. Г., Чистякова Т. И., Вайнштейн М. Б. // Прикладная биохимия и микробиология.— 2011, Т.47, №2.— С.125.
8. Shimada Y., Sugihara A., Minamigawa Y., Higashiyama K., Akimoto K., Fujikawa S., Komemushi S., Tominaga Y. // J. Am. Oil Chem. Soc.— 1998.— V.75.— P.1213.
9. Петухова Н. И., Зорин В. В., Рахматуллина Ю. Р., Пантелеева С. Н. // Баш. хим. ж.— 2007.— Т.14, №1.— С.141.
10. Петухова Н. И., Митягина А. В., Зорин В. В. // Баш. хим. ж.— 2010.— Т.17, №4.— С.50.
11. Treichel H., de Oliveira D., Mazutti M. A., Luccio M. D., Oliveira J. V. // Food Bioprocess Technol.— 2010.— V.3.— P.182.
12. Gupta R., Gupta N., Rathi P. // Appl. Microbiol. Biotechnol.— 2004.— V.64.— P.763.
13. Sharma R., Chisti Y., Banerjee U.C. // Biotechnol. Advances.— 2001.— V.19.— P.627.
14. Takac S., Marul B. // J. Ind. Microbiol. Biotechnol.— 2008.— V.35.— P.1019.
15. Гамаюрова В. С., Зиновьева М. Е. Ферменты. Лабораторный практикум: учебное пособие.-СПб.: Проспект науки, 2011.— 256 с.
