CC BY
118
УДК 579.66:547.94
Н. И. Петухова (к.биол.н., доц.), А. А. Шараева (асп.), А. Н. Шакиров (инж.), В. В. Зорин (чл.-корр. АН РБ, д.х.н., проф., зав. каф.)
Исследование роста и липидообразования гриба Mortierella alpina ГР-1 - продуцента арахидоновой кислоты на отходах производства подсолнечного масла
Уфимский государственный нефтяной технический университет, кафедра биохимии и технологии микробиологических производств 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел. (347) 431935, е-mail: bio@rusoil.net
N. I. Petukhova, A. A. Sharaeva, A. N. Shakirov, V. V. Zorin
Research of growth and lipid formation of arachidonic acid producer Mortierella alpina ГР-1 fungus on sunflower
oil production wastes
Ufa State Petroleum Technological Univercity 1, Kosmonavtov Str., 450062, Ufa, Russia; ph. (347) 431935, e-mail: bio@rusoil.net
Исследована способность гриба Mortierella alpina ГР-1 расти и синтезировать липиды с высоким содержанием арахидоновой кислоты на средах, содержащих различные отходы производства подсолнечного масла (гидрофуз, шрот, лузгу, жирные кислоты). Показано, что наиболее активно гриб растет на овсяной среде с 1% гидрофуза, а также на глицеринсодержащей среде со смесью овсяной крупы и шрота (1:1), накапливая 25—27 % липидов, содержащих 63— 65 % арахидоновой кислоты (от суммы жирных кислот). Использование лузги для получения арахидоновой кислоты оказалось невозможным из-за отсутствия у гриба ферментов, необходимых для расщепления лигноцеллюлозы. Применение жирных кислот в качестве компонента ростового субстрата ограничивается их ингиби-рующим действием на рост продуцента.
Ключевые слова: арахидоновая кислота; микробиологический синтез липидов; Mortierella alpina; отходы переработки растительных масел.
Fungus Mortierella alpina TP-1 ability to grow and produce lipids with high arachidonic acid content on media containing various sunflower oil production wastes (husks, fatty acids, extraction solid wastes, protein-phosphatide concentrate) was searched. The most active growth of fungus is shown on the oat medium with 1% of proteinphosphatide concentrate and also on the glycerol-containing medium with solid wastes and oatmeal mixture (1:1) with 25—27 % accumulation of lipids containing 63—65 % arachidonic acid (of fatty acids). Husks cannot be used as arachidonic acid production substrate due to the absence of enzymes capable to decompose lignocelluloses. The usage of fatty acids as nutrient is restricted by its suppressive effect on producer growth.
Key words: vegetable oils refinery wastes; arachidonic acid; lipids microbiological synthesis; Mortierella alpina.
Одним из подходов к снижению стоимости биотехнологической продукции является использование в качестве сырья для биосинтеза отходов переработки растительной биомассы. В этом аспекте особый интерес представляет глицерин — отход производства биодизеля, а также лузга, шелуха, гидрофуз, жирные кислоты, жмых, шрот и соапсток, образующиеся при получении растительных масел. В настоящее время на их основе разрабатываются эффективные технологии получения широкого
спектра продуктов с добавленной стоимостью (биотоплив, химикалиев, лекарственных веществ, средств защиты растений, биосурфак-тантов, биопластиков, наноматериалов, биокатализаторов и др.) 1-3.
Ранее нами было показано, что гриб Mortierella alpina 18-1 и его глицеринустойчивый мутант ГР-1 синтезируют липиды с высоким содержанием практически значимой арахидоновой кислоты (65—67 % от суммы жирных кислот) на глицеринсодержащих средах 4-6.
Дата поступления 30.08.13
Благодаря широкому спектру физиологической активности арахидоновая кислота представляет большой интерес для фармацевтической и пищевой промышленности 7. В частности, включение арахидоновой кислоты в диету стимулирует развитие детей 8'9 и умственную деятельность пожилых людей 7. Такие производные арахидоновой кислоты, как анандамид (арахидонилэтаноламид) и 2-арахидонилгли-церин, являются эндогенными лигандами для каннабиноидных рецепторов 10. Амиды ара-хидоновой кислоты с серотонином, дофамином ингибируют агрегацию тромбоцитов человека 11.
Кроме того, арахидоновая кислота и ее эфиры используются в современных технологиях выращивания сельскохозяйственных растений в качестве эффективного индуктора системной неспецифической устойчивости растений к различного рода деструктивным воздействиям (грибковым, бактериальным и вирусным
12
патогенам, водному и температурному стрессу 12, механическим поранениям 13,14), а также рос-
тостимулирующего и ростформирующего сред-
12 15 ства 12,15.
В настоящей работе исследована возможность использования отходов производства
подсолнечного масла для получения арахидоновой кислоты с помощью гриба Mortierella alpina ГР-1.
Исследовали возможность применения в качестве потенциальных ростовых субстратов и добавок к ним лузги, шрота, гидрофуза и жирных кислот, образующихся на различных стадиях производства подсолнечного масла (табл. 1).
В настоящее время эти отходы используются в основном как кормовые добавки или сырье для производства мыла и ПАВ. Только лузга применяется для культивирования грибов вешенок частными предпринимателями. Между тем, анализ состава гидрофуза и жирных кислот позволяет предполагать, что они могут быть использованы в качестве добавок к овсяной среде как непосредственные предшественники грибных липидов. Не исключено также, что шрот, содержащий значительное количество белка и других нелипидных компонентов растительной клетки, может заменить собою овсяную крупу, а лузга, состоящая из лигноцеллюлозы, будет являться хорошим источником углерода (глюкозы) для роста гриба и биосинтеза арахидоновой кислоты.
С целью изучения возможности использования гидрофуза, жирных кислот, шрота и лузги для получения арахидоновой кислоты с помощью Mortierella alpina ГР-1 исследовали рост, выход биомассы, содержание липидов и состав жирных кислот, образующихся в про-
Отход Стадии производства, на которых образуется отход Основные компоненты Традиционное использование Предполагаемое применение
гидрофуз аморфный осадок, образующийся при обработке нерафинированного масла водой фосфолипиды кормовая добавка, производство мыла и моющих средств добавка к овсяной среде (как предшественник грибных липидов)
жирные кислоты отгон, образующийся при дезодорации масла дистилляцией пальмитиновая, олеиновая, линолевая кислоты производство мыла и моющих средств добавка к овсяной среде (как предшественник грибных липидов)
шрот твердый остаток, образующийся при экстракции остаточных липидов из жмыха с помощью органического растворителя белок(35-38 %) лигноцеллюлоза (лузга) кормовая добавка полноценная ростовая среда (замена овсяной среды)
лузга твердый отход, образующийся при подготовке семян подсолнечника к отжиму масла лигноцеллюлоза малоценная кормовая добавка, субстрат для культивирования грибов вешенок основной источник углерода
Таблица 1
Характеристика отходов производства подсолнечного масла и их предполагаемое применение в биосинтезе арахидоновой кислоты
А Б В
Рис. 1. Рост гриба Mortierella alpinn ГР-1 на овсяной среде с фузой (А), глицерином (Б) и жирными кислотами (В): А) овсяная среда с 1% гидрофуза (20 сут); Б) овсяная среда с 1% глицерина (20 сут); В) овсяная среда с 1% жирных кислот (20 сут).
А
Б
Рис. 2. Рост гриба Mortierella alpinаГР-1 на глицеринсодержащих средах в присутствии шрота (А) и смеси шрота с овсяной крупой (Б): А) шрот с глицерином (20 сут); Б) овсяная крупа и шрот (1:1) с глицерином (20 сут).
цессе культивирования гриба на питательных средах с указанными отходами. Выращивание гриба осуществляли в течение 20 сут при 25 оС в чашках Петри на поверхности плотных сред, приготовленных на основе овсяной крупы или модифицированной агаризованной среды Чапека (состав использованных сред представлен в экспериментальной части). В качестве контроля использовали овсяную среду, содержащую 1% глицерина.
При исследовании роста Mоrtierella alpinа ГР-1 на овсяной среде с 1% гидрофуза было установлено, что гриб хорошо растет, формируя обильный воздушный мицелий (рис. 1А), так же, как на контрольной среде с глицерином (рис. 1Б).
В то же время на аналогичной среде с 1% жирных кислот наблюдалось активное развитие только субстратного мицелия (рис. 1В), тогда как воздушный мицелий формировался очень медленно (в двадцатисуточной культуре полноценный воздушный мицелий наблюдается только в центре чашки Петри).
При культивировании Mortierella alpinа ГР-1 на модифицированной среде Чапека, содержащей лузгу в качестве единственного источника углерода, наблюдали полное отсутствие роста микроорганизма. Введение в среду с лузгой глицерина не вызвало рост культуры, хотя, как было показано ранее, это соединение стимулирует развитие гриба Mortierella alpinа ГР-1 на овсяной среде 6. Это указывает на то, что неспособность гриба расти среде с лузгой связана с его потребностью в дополнительных ростовых факторах. Действительно, при использовании для культивирования Mortierella alpinа ГР-1 среды, приготовленной на основе глицерина и шрота, содержащего помимо лузги разнообразные органические соединения, которые остались после экстракции масла из семян подсолнечника, было обнаружено, что гриб хотя и медленно, но все же растет на такой среде (рис. 2А).
Исследование оксидазной и целлюлазной активности грибного мицелия в процессе культивирования гриба на среде со шротом показало
отсутствие у него ферментов, катализирующих расщепление лигнина и целлюлозы. Это свидетельствует в пользу того, что лузга не используется грибом, и его рост на этой среде поддерживается за счет глицерина и нелигноцеллю-лозных компонентов шрота.
Обнаружено, что частичная замена шрота на овсяную крупу существенно стимулирует рост гриба. На среде, содержащей смесь шрота и овсяной крупы в соотношении 1:1 и глицерин (1%), гриб хорошо растет, образуя обильный воздушный мицелий (рис. 2Б). Именно на этой среде через 20 сут культивирования гриба был достигнут наибольший выход биомассы среди других исследованных сред с отходами производства подсолнечного масла (гидрофу-зом и жирными кислотами), также поддерживающими рост гриба (рис. 3). При этом он был сопоставим с выходом биомассы гриба в контрольном варианте (на овсяной среде с глицерином).
40
30 --
□липиды □ биомасса
100
75
3 Варианты 4
Рис. 3. Относительный выход биомассы и содержание в ней липидов при культивировании гриба Mortierella а1рта ГР-1 на овсяной среде без добавок и с добавками глицерина и/или отходов производства подсолнечного масла: 1 — овсяная среда без добавок; 2 — овсяная среда с глицерином (1%); 3 — овсяная среда с гидрофузом (1%); 4 — овсяная среда с жирными кислотами (1%); 5 — шрот и овсяная крупа (1:1) с глицерином (1%).
При использовании овсяной среды, содержащей гидрофуз, выход биомассы составил около 70%, тогда как в случае роста гриба на аналогичной среде с жирными кислотами он не превысил 22% от контрольного варианта (рис. 3). Вероятно, жирные кислоты ингиби-руют рост гриба, поскольку выход биомассы в их присутствии оказался даже ниже, чем на овсяной среде без добавок.
Установлено, что на средах с отходами производства подсолнечного масла не подавля-
ется процесс накопления липидов в мицелии гриба. Содержание липидов в двадцатисуточ-ных биомассах, полученных на средах с гидрофузом, жирными кислотами или шротом, даже немного (на 3—5 %) превышает значение, достигнутое в контрольном варианте на овсяной среде с 1% глицерина (рис. 3). При этом следует отметить, что по сравнению с овсяной средой без добавок содержание липидов во всех вариантах было выше в 1.8—2.2 раза.
Анализ жирнокислотного состава грибных липидов (рис. 4), полученных на овсяных средах с отходами и/или глицерином, позволил выявить, что во всех вариантах основной является арахидоновая кислота (С20:4п6). В качестве сопутствующих кислот в липидах гриба присутствуют пальмитиновая (С16:0), стеариновая (С18:0), олеиновая (С18:1п9), линолевая (С18:2п6), у-линоленовая (С18:3п6) и дигомо-у-линоленовая (С20:3п6) кислоты. Наибольшее содержание целевой арахидоновой кислоты в грибных липидах было получено на глицерин-содержащих средах с овсяной крупой или ее смесью со шротом (63—65 %). Замена глицерина в овсяной среде на жирнокислотные отходы или гидрофуз несколько снижала долю арахидоновой кислоты в липидах гриба. Однако, и в этом случае содержание арахидоновой кислоты оставалось на высоком уровне (52—58 %, соответственно).
i 60 н
iS 50 н
0 К
1 40
I 30
ц
g 20 ä
!10
о
Варианты: □ 1
□ 2 □ 3 ■ 4
0Ш нтьТТ
1Ж
1ТгЯ г. .
С18:2п6 С18:3п6 С20:3п6
Рис. 4. Жирнокислотный состав липидов гриба Mortierella alpina ГР-1, полученных на овсяной среде с добавками глицерина и/или отходов производства подсолнечного масла: 1 — овсяная среда с глицерином (1%); 2 — овсяная среда с гидрофузом (1%); 3 — овсяная среда с жирными кислотами (1%); 4 — шрот и овсяная крупа (1:1) с глицерином (1%).
Таким образом, полученные результаты показывают, что перспективным сырьем для получения арахидоновой кислоты с помощью гриба Mortierella alpim ГР-1 являются гидрофуз и шрот. Использование лузги в этом про-
20
50
ÎP 10
25
0
0
0
5
С16:0
С18:0
С18:1
цессе невозможно из-за отсутствия у гриба ферментов, необходимых для расщепления лигноцеллюлозы, а для применения жирных кислот в качестве компонента ростового субстрата требуется повысить устойчивость продуцента к их ингибирующему действию.
Экспериментальная часть
Выращивание гриба проводили методом поверхностного культивирования на плотных питательных средах следующего состава:
1) овсяная крупа — 120 г, глицерин — 10 г, ZnS04-7H20 - 0.1 г, вода - 1л;
2) овсяная крупа — 120 г, гидрофуз — 10 г, ZnS04-7H20 — 0.1 г, вода — 1л;
3) овсяная крупа — 120 г, жирные кислоты — 10 г, ZnS04-7H20 — 0.1 г, вода — 1л;
4) лузга — 120 г, агар-агар — 12 г, минеральный фон среды Чапека — 1л;
5) лузга — 120 г, глицерин — 10 г, агар-агар — 12 г, минеральный фон среды Чапека — 1л;
6) шрот — 120 г, глицерин — 10 г, ZnS04-7H20 — 0.1 г, агар-агар — 15 г, вода — 1л;
7) шрот — 60 г, овсяная крупа — 60 г, глицерин — 10 г, ZnS04-7H20 — 0.1 г, вода — 1л;
8) овсяная крупа — 120 г, ZnS04-7H20 — 0.1 г, вода — 1л.
Состав минерального фона среды Чапека (г/л): NaN03 — 2; K2HP04 — 1; MgS04 • 7Н2О —
0.5. KCl — 0.5; FeS04-7H20 — 0.1; CaC03 — 3. Питательные среды стерилизовали в автоклаве в течение 30 мин при температуре 120 оС. Инокулят наносили на поверхность среды в центре чашки Петри. Выращенную биомассу собирали, трижды промывали дистиллирован-
Литература
1. Зорин В. В., Петухова Н. И., Шахмаев Р. Н. // Российский химический журнал.— 2011. — Т. LV, №1.— С. 77.
2. Makkar R. S., Cameotra S. S., Banat I. M. // AMB Express.— 2011.— 1:5.— Р.1.
3. Javers J., Gibbons W. R., Karunanithy C. // Advances in Microbiology.— 2012.— V.2.— P.241.
4. Петухова Н. И., Ландер О.В., Рахматулли-на Ю. Р. Зорин В. В. // Баш. хим. ж.— 2013.— Т.20, №1.— C.94.
5. Петухова Н. И., Рахматуллина Ю. Р., Яхутова Я. Р., Спирихин Л. В., Зорин В. В. // Баш. хим. ж.— 2006.— Т.13, №1.— С.95.
6. Петухова Н. И., Митягина А. В., Зорин В. В. // Баш. хим. ж.— 2010.— Т.17, №5.— С.50.
7. Петухова Н. И., Рахматуллина Ю. Р., Пантелеева С. Н., Зорин В. В. // Баш. хим. ж.— 2007.— Т.14, №1.— С.141.
ной водой и высушивали в сушильном шкафу до постоянного веса при температуре 65 оС. Липиды экстрагировали из сухого мицелия трехкратной обработкой гексаном. Для определения жирнокислотного состава грибных липидов получали метиловые эфиры жирных кислот, как описано в работе 16.
Идентификацию метиловых эфиров жирных кислот проводили на хроматомасс-спект-рометре НР-5896 с масс-селективным детектором НР-5972А, стеклянной капиллярной колонкой длиной 50 м, 5% фенилметилсилико-на на НР-5, температура ионного источника 120 оС, ускоряющее напряжение 3 кВ, энергия ионизации 70 еВ. Режим изменения температуры колонки программировали со скоростью 10 град/мин от 50 до 250 оС.
Количественный анализ состава полученных препаратов метиловых эфиров жирных кислот осуществляли на хроматографе Хрома-тэк Кристалл с пламенно-ионизационным детектором на капиллярной колонке 60м х 0.32мм ГО Solgel-Wax х 0.5цш. Режим анализа: температура термостата колонки — 250 оС, температура детектора — 320 оС, температура испарителя — 320 оС, скорость газа-носителя (азот) — 27.5 мл/мин.
Оксидазную активность гриба оценивали спектрофотометрически при 410 нм с использованием пирокатехина (10-2 М) в качестве субстрата в 0.1 М цитратно-фосфатном буфере (рН 4.5), как описано в работе 17.
Целлюлазную активность гриба оценивали по скорости гидролиза карбоксиметилцел-люлозы, как описано в работе 17.
References
1. Zorin V. V., Petukhova N. I., Shakhmaev R. N. Rossiiskii khimicheskii zhurnal.— 2011.— V.55, no.1. — P.77.
2. Makkar R. S., Cameotra S. S., Banat I. M. AMB Express.- 2011.- 1:5.- P.1.
3. Javers J., Gibbons W. R., Karunanithy C. Advances in Microbiology.- 2012.- V.2.-P.241.
4. Petukhova N. I., Lander O. V., Rahmatullina Ju. R., Zorin V. V. Bash. khim. zh.- 2013.- V.20, no.1.- P.94.
5. Petukhova N. I., Rakhmatullina Yu. R., Yakhu-tova Ya. R., Spirikhin L. V., Zorin V. V. Bash. khim. zh.- 2006.- V.13, no.1.- P.95.
6. Petukhova N. I., Mityagina A. V., Zorin V. V. Bash. khim. zh.- 2010.- V.17, no.5.- P.50.
7. Petukhova N. I., Rakhmatullina Yu. R., Pante-leeva S. N., Zorin V. V. Bash. khim. zh.- 2007.-V.14, no.1.- P.141.
8. Hou C. T. // J. Ind. Microbiol. Biotechnol.—
2008.— V.35.— P.501.
9. Ceron Garcэa M. C., Fernandez Sevilla J. M., Acien Fernandez F. G., Molina Grima E., Garcэa Camacho F. // J. Appl. Phycol.— 2000.— V.12.— P.239.
10. Chi Z., Pyle D., Wen Z., Frear C., Chen S. // Process Biochemistry.— 2007.— V.42.— P.1537.
11. Athalye S. K., Garcia R. A., Wen Z. // J. Agric. Food Chem.— 2009.— V.57.— P.2739.
12. Кудрявцева Л. П., Кудрявцев H. А. // ^учно-практич. ж. «Агро XXI».— 2009.— №4-6.— С.6.
13. Озерецковская О. Л., Васюкова H. И., Чален-ко Г. И., Герасимова H. Г., Ревина Т. А., Валуева Т. А. // Докл.А^— 2008.— Т.423, №1.— С.129.
14. Озерецковская О. Л., Васюкова H. И., Чален-ко Г. И., Герасимова H. Г., Ревина Т. А., Валуева Т. А. // Прикл. биохим. и микробиол.—
2009.— Т.45, №2.— С.220.
15. Кульнев А. И., Соколова Е. А. Многоцелевые стимуляторы защитных реакций роста и развития растений (на примере препарата иммуно-цитофит).— Пущино: ОЭТИ ПHЦ РА^ 1997.— С.100.
16. А. c. 968072 СССР / Султанович Ю. А., ^чаев А. П., Барсукова И. А. // Б.И.— 1982.— №39.— С.223.
17. Халимова Л. Х., Петухова H. И., Шгина Т. С., Султанова Л. М., Зорин В. В. // Баш. хим. ж.— 2009.— Т.16, №4.— С.68.
8. Hou C. T. J. Ind. Microbiol. Biotechnol.—
2008.- V.35.- P.501.
9. Ceron Garcэa M. C., Fernandez Sevilla J. M., Acien Fernandez F. G., Molina Grima E., Garcia Camacho F. J. Appl. Phycol.- 2000.- V.12.-P.239.
10. Chi Z., Pyle D., Wen Z., Frear C., Chen S. Process Biochemistry.- 2007.- V.42.- P.1537.
11. Athalye S. K., Garcia R. A., Wen Z. J. Agric. Food Chem.- 2009.- V.57.- P.2739.
12. Kudryavtseva L. P., Kudryavtsev N. A. Nauchno-praktich. zh. «Agro XXI».- 2009.-no.4-6.- P.6.
13. Ozeretskovskaya O. L., Vasyukova N. I., Chalenko G. I., Gerasimova N. G., Revina T. A., Valueva T. A. Doklady akademii nauk.- 2008.-V.423, no.1.— P.129.
14. Ozeretskovskaya O. L., Vasyukova N. I., Chalenko G. I., Gerasimova N. G., Revina T. A., Valueva T. A. Prikl. Biokhim. i Mikrobiol.-
2009.- V.45, no.2.- P.220.
15. Kul'nev A. I., Sokolova E. A. Mnogotselevye stimulyatory zashchitnykh reaktsiy rosta i razvitiya rasteniy (na primere preparata immunotsitofit).- Pushchino: USTP PSC RAS, 1997.- 100 p.
16. A. s. 968072 SSSR Sultanovich Yu. A., Nechaev A. P., Barsukova I. A. Bulleten izobretenii.-1982.- no.39.- P.223.
17. Halimova L. H., Petukhova N. I., Nogina T. S., Sultanova L. M., Zorin V. V. Bash. khim. zh.-2009.- V.16, no.4.- P.68.
