CC BY
46
УДК 579.66:547.94
H. И. Петухова (к.биол.н., доц.), А. В. Хузина (асп.), О. В. Ландер. (студ),
В. В. Зорин (чл.-корр. АН РБ, д.х.н., проф., зав. каф.)
Исследование биоконверсии кукурузного масла в полиненасыщенные грибные липиды с помощью фикомицета Mortierella alpina ГР-1
Уфимский государственный нефтяной технический университет, кафедра биохимии и технологии микробиологических производств 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел. (347) 2431935, e-mail: bio@rusoil.net
N. I. Petukhova, A. V. Khuzina, O. V. Lander, V. V. Zorin
Research of bioconversion of corn oil to polyunsaturated mycelial lipids by fungi Mortierella alpina GR-1
Ufa State Petroleum Technical University
I, Kosmonavtov Str.,450062 Ufa, Russia;Phone: (3472) 431935; е-mail: bio@rusoil.net
Исследована способность 8-, 10- и 13-суточного мицелия гриба Mortierella alpina ГР-1 конвертировать кукурузное масло в грибные липиды. Установлено, что наиболее эффективно субстрат трансформируется 13-суточным мицелием. Повторное внесение растительного масла на 16-е сутки позволяет дополнительно увеличить выход грибных липидов.
Ключевые слова: биоконверсия растительных масел; Mortierella alpina; полиненасыщенные жирные кислоты.
The ability of 8-, 10- and 13-day Mortierella alpina rP-1 mycelium to converse corn oil into the mycelial lipids was studied. It is shown, that the 13-day mycelium transforms the substrate the most effectively. The repeated addition of substrate on 16th day allows to achieve the supplemental increase of mycelial lipids yield.
Key words: bioconversion of vegetable oils; Mortierella alpina; polyunsaturated fatty acids.
Растительные масла могут быть конвертированы с помощью фикомицетов Mortierella alpina в грибные липиды, содержащие ценные полиненасыщенные жирные кислоты 1-3. Так, при трансформации льняного масла с помощью штаммов Mortierella alpina 1S-4 1 и Mortierella alpina ХН-1 2 были получены эйкозопентаеновая кислота, а биоконверсия кунжутного масла с помощью штамма Mortierella alpina 1S-4 позволила синтезировать дигомо-у-линоленовую кислоту 3. Это обусловило интерес к дальнейшему исследованию способности разных штаммов грибов Mortierella alpina конвертировать различные, в том числе малоценные, растительные масла в полиненасыщенные грибные липиды.
В настоящей работе исследована трансформация кукурузного масла в полиненасыщенные грибные липиды с помощью глицери-нустойчивого гриба Mortierella alpina ГР-1. С целью выбора наиболее оптимального режима внесения растительных масел в культуру
была исследована трансформация растительных масел 8-, 10- и 13-суточными культурами гриба.
В результате исследования трансформации кукурузного масла было установлено, что внесение масла на 8-е или 13-е сутки культивирования увеличивает выход биомассы в 1.3— 1.7 раза по сравнению с контрольным вариантом без добавки масла (рис. 1). При этом более позднее внесение масла приводит к более значительному увеличению выхода биомассы.
g 100
I # BOis -
g g 60 - —
5 s 40
I S 40
°ю 20 +-
P
О 0 i 0
_. ..._без масла —□—масло на 13 сутки
10
15
20
25
- масло на В сутки масло на 1З и 1б сутки
Дата поступления 26.11.09
Рис. 1. Динамика выхода биомассы при культивировании гриба на среде без масла и с добавкой кукурузного масла
глицерин
I
ацетил-СоА ацетил-СоА-
карбоксилаза
СО2-
-о-
синтез de novo
синтез из экзогенного масла
малонил-СоА-
ацил-СоА С16-С20
грибные липиды
кукурузное масло
Еще более высокий выход биомассы удалось получить при двукратном внесении растительного масла на 13-е и 16-е сутки (рис. 1). Выход биомассы в этом случае увеличивался в 1.8 раза по сравнению с однократным внесением масла на 13-е сутки и более чем в 3 раза по сравнению с контрольным вариантом.
Известно, что синтез запасных липидов у грибов Mortierella alpina начинается в стационарной фазе роста после истощения в среде запасов источника азота 4. Внесение кукурузного масла в среду должно привести к выключению синтеза грибных липидов de novo вследствие ингибирования ацетил-СоА-кар-боксилазы 5. Очевидно, что при этом конечное содержание липидов в клетках гриба будет определяться эффективностью и продолжительностью процессов синтеза de novo и ассимиляции кукурузного масла.
Можно ожидать, что режим внесения растительных масел может оказывать существенное влияние на содержание липидов в клетках гриба, накапливающихся к концу трансформации. Если масло вводить в среду слишком рано, то потенциал основной среды для синтеза липидов будет использован не полностью. При внесении же экзогенных липидов слишком поздно высока вероятность того, что они не полностью усвоятся грибами.
Действительно, было обнаружено, что содержание в мицелии грибалипидов, накапливающихся при трансформации кукурузного масла, изменяется в зависимости от времени внесения масла (рис. 2). Наиболее активно накапливались липиды при внесении масла на 13-е сутки. В этом случае содержание липидов в мицелии было в 2.6 раза больше (режим 4) по сравнению с контрольным вариантом и в 1.5—1.9 раз по сравнению с вариантами с добавлением масла на 10-е или 8-е сутки (режимы 2, 3).
Оценка выхода грибных липидов, в расчете на 1 мл растительного масла, показала, что наиболее эффективно усваиваются экзогенные липиды, внесенные двукратно на 13-е и 16-е сутки (рис. 3).
70 60 50 40 30 20 10 0
ш
и
t
□ контроль (без масла)
□ с добавкой кукурузного масла
1 2 3 4 5 6 Рис. 2. Содержание липидов в мицелии гриба в конце трансформации при различных режимах внесения кукурузного масла: 1 — контроль; 2 — масло внесено на 8-е сутки; 3 — масло внесено на 10-е сутки; 4 — масло внесено на 13-е сутки; 5 — масло внесено на 13-е и 16-е сутки; 6 — масло внесено на 13-е, 16-е и 19-е сутки
s fe
С о
К и
g е .
и 5
о
к й
& Э
4 к
5 S
й Т5
А
и
0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0
1 2 3 4 5
Режим
Рис. 3. Выход грибных липидов в расчете на количество внесенного масла: 1 — масло внесено на 8-е сутки; 2 — масло внесено на 10-е сутки; 3 — масло внесено на 13-е сутки; 4 — масло внесено на 13-е и 16-е сутки; 5 — масло внесено на 13-е, 16-е и 19-е сутки
Трехкратное внесение масла оказалось нецелесообразным, поскольку его последняя
порция не успевает усвоиться микроорганизмом до окончания процесса трансформации. Не исключено, что увеличение продолжительности трансформации позволит конвертировать все кукурузное масло в грибные липиды в данном режиме.
Материалы и методы
Выращивание продуцента проводили методом поверхностного культивирования на плотной питательной среде ОГЦ (овсяные хлопья — 120 г/л, глицерин 10 г/л, сульфат цинка 0.01%) при температуре 25 оС.
Для засева использовали суспензию спор и фрагментов мицелия (2—3-106 фрагментов мицелия и спор/см3), полученную смывом культуры стерильной водопроводной водой, со скошенной в пробирках среды Чапека.
Трансформацию растительных масел осуществляли с помощью 8-, 10- и 13-суточных культур гриба. Масло вносили в ростовую среду и инкубировали при температуре 25 оС в течение 12, 10 и 7 сут, соответственно. Общее
время культивирования гриба во всех вариантах составило 20 сут.
После окончания трансформации биомассу гриба собирали с поверхности среды, промывали от остатков не поглощенного растительного масла гексаном и высушивали. Липиды выделяли из сухого мицелия экстракцией с помощью хлороформа.
Литература
1. Shimizu S., Kawashima H., Akimoto K., Shin-men Y., Yamada H. // Appl. Microbiol. Biotechnol.— 1989.- V. 32.- P. 1.
2. Петухова Н. И., Калимуллина Л. Я., Сюн-дюко-ва Ю. Р., Зорин В. В. // Баш. хим. ж.- 2008.Т. 15, № 1.- С. 19.
3. Shimizu S., Akimoto K., Kawashima H., Shin-men Y., Yamada, H. // J. Am. Chem. Soc.-1989.- V. 66.- P. 237.
4. Бутова С. Н., Типисева И. А., Эль-Регистан Г. И. Теоретические основы биотехнологии. Биохимические основы синтеза биологически активных веществ: Учебное пособ. для вузов / Под ред. проф. И. М. Грачевой.- М.: Эливар, 2003.- 554 с.
Работа выполнена при поддержке аналитической ведомственной целевой программы «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2010 годы), проект №2.1.2/5048 «Создание научных основ хемо-, регио- и энантионаправленной биотрансформации органических соединений и биоокисления сульфидов металлов»
