CC BY
440
Biohimija, 2003, tom 68, vyp. 4, s. 529-536.
13. Ushakova T. A., Puchkova L.I., Gutorov V.V., Totmenina O.D., Repin V.E. Jendonukleaza restrikcii Asi256I, uznajushhaja i rasshhepljajushhaja posledovatel'nost' nukleotidov 5-GATC-3 // Prik-ladnaja biohimija i mikrobiologija, 2008, tom 44, № 1, s. 34-37.
14. Chernuhin V.A., Golikova L.N., Gonchar D.A., Abdurashitov M.A., Kashirina Ju. G., Netesova N.A., Degtjarev S. H. DNK-metiltransferazy M.BstF5I-2 i M.BstF5I-4 sistemy restrikcii-modifikacii Bst5I iz Bacillus stearothermophilus F 5 // Biohimija, 2003, tom 68, vyp. 9, s. 1183-1192.
15. Junusova A.K., Rogulin E.A., Artjuh R. I., Zheleznaja L.A., Matvienko N.I. Belok, kodiruemyj otkrytoj ramkoj schityvanija, raspolozhennoj rjadom s genom nikazy BspD6I, v komplekse s nikazoj ob-
razuet jendoukleazu restrikcii //Biohimija, 2006, tom 71, vyp. 7, s. 1002-1008.
16. Janulajtis A. A. Fermenty restrikcii i ih primenenie // Itogi nauki i tehniki. Biotehnologija. T.17.Mju 1989. 202 S.
17. Bertani G. Studtes on lysogenesis. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli. 1951. J. Bactertol. 62. 293-300.
18. Dryden, D.T.F. Cheng X., Blumenthal R.M. EdsIn S-adenosylmethioine-dependent methy-transferases: structures and function. // Wold Scentific, Singapure 1999 // pp. 283-340.
19. New England Biolabs. - Catalog, 1987/1988 New England Biolab.- Catalog 1986-1987. rp. 116-117.
20. Roberts R.J., Macelis D. //Restriction en-donucleases and their isolshizomes. // Nucleic Acids Res. 1993. v. 21. rr. 3125-3137.
Статья поступила в редакцию 10.12.2015 г.
УДК 579.222; 579.6
БАКТЕРИИ-НЕФТЕДЕСТРУКТОРЫ РОДА RHODOCOCCUS -ПОТЕНЦИАЛЬНЫЕ ПРОДУЦЕНТЫ БИОСУРФАКТАНТОВ
© Т.М. Льюнг1, И.А. Нечаева1, К.В. Петриков2, И.Ф. Пунтус2, О.Н. Понаморева1
Тульский государственный университет,
300012, Россия, г. Тула, пр. Ленина, 92, olgaponamoreva@mail.ru 2 Институт физиологии и биохимии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, 142290, Россия, Московская обл., г. Пущино, пр. Науки, д. 5, bioscience.kp@gmail.com
Исследована способность бактерий-нефтедеструкторов Rhodococcus sp. X5 и Rhodococcus sp. S67, входящих в состав биопрепарата «МикроБак», продуцировать гликолипидные биосурфак-танты при росте на н-гексадекане в жидкой минеральной среде при 26 оС. Установлено, что эти микроорганизмы являются эффективными продуцентами биосурфактантов: через 6 сут культивирования поверхностное натяжение среды уменьшалось с 72 мН/м до 27 мН/м. Качественный анализ липидных компонентов, продуцируемых обоими штаммами микроорганизмов, методом тонкослойной хроматографии позволил идентифицировать основные гликолипидные биосурфак-танты - как сукциноилтрегалолипиды, так и трегалозомиколаты. Содержание трегалолипидов увеличивалось по мере роста клеток, наибольшее значение достигалось на поздней фазе экспоненциального роста бактерий: 305 мг/л - для X5, 280 мг/л - для S67, при этом индекс эмульгирования составил 55% и 40% соответственно.
Ключевые слова: биосурфактанты; трегалолипиды; Rhodococcus; бактерии-нефтедеструкторы.
OIL-DEGRADING MICROORGANISMS OF GENUS RHODOCOCCUS -POTENTIAL PRODUCERS OF BIOSURFACTANTS
T.M. Luong1, I.A. Nechaeva1, K.V. Petrikov2, I.F. Puntus2, O.N. Ponamoreva1
1 1 Tula State University ,
92, Lenin Ave., Tula, 300012, Russia, olgaponamoreva@mail.ru 2 G.K. Skryabin Institute of biochemistry and physiology of microorganisms RAS, 5, Nauki Ave., Pushchino, 142290, Russia, bioscience.kp@gmail.com
The ability of oil-degrading bacteria Rhodococcus sp. X5 and Rhodococcus sp. S67, included to the bioprepa-ration "MicroBak" to produce glycolipid biosurfactant with growth of n-hexadecane in a liquid mineral medium at 26 oC was investigated. It was found that these microorganisms are effective producers of biosurfactant: after 6 days of cultivation the surface tension decreased from 72 mN/m to 27 mN/m. The qualitative analysis of the lipid components produced by both strains of microorganisms indicated glycolipid-type biosurfactant as well succinoyl trehalose lipids as trehalose mycolates. Trehalolipid content increased with growth of bacterium and the maximum value achieved in the late exponential growth phase of bacteria: 305mg/l for the X5 and 280 mg/l for the S67, the emulsification index was 55% and 40%, respectively. Keywords: biosurfactans; trehalolipids; Rhodococcus; oil-degrading microorganisms.
ВВЕДЕНИЕ
Биосурфактанты (биоПАВ) - поверхностно-активные вещества, продуцируемые микроорганизмами. По химическому строению биосурфактанты представляют собой амфифиль-ные молекулы, состоящие из гидрофильной и гидрофобной частей, снижающие поверхностное и межфазное натяжение, что обусловливает взаимосвязь с поверхностями различных полярностей [28]. В последние годы исследования биосурфактантов вызывают большой интерес у микробиологов, биохимиков и биотехнологов, так как биоПАВ по своим поверхностно-активным свойствам не уступают синтетическим аналогам, в то же время для них характерны биодеградируемость, низкая токсичность, стабильная активность в экстремальных условиях (температура, pH, присутствие солей) [26]. Несмотря на то, что биосурфактанты являются относительно новым продуктом биотехнологии, они нашли применение в разных областях промышленности (химической, фармацевтической, пищевой), в экологии для очистки нефтезагрязненных территорий, в технологиях по добыче нефти, в сельском хозяйстве.
По молекулярной массе биосурфактанты делят на две группы. К первой группе относятся низкомолекулярные биосурфактанты (глико-липиды, жирные кислоты, фосфолипиды, ли-попептиды), обладающие высокой поверхностной и межфазной активностью, низкой критической концентрацией мицеллообразования, способностью к образованию стабильной эмульсии. Во вторую группу входят высокомолекулярные полимерные сурфактанты (полисахариды, протеины, липопротеины, липосахариды), которые способны эффективно адсорбироваться на различных поверхностях при низкой коцен-трации, т.е. обладают высокой эмульгирующей активностью, но при этом не снижают поверхностное натяжение [28, 30]. Большой интерес для изучения представляет один из наиболее
распространённых типов биоПАВ - гликоли-пидные биосурфактанты, к которым относятся рамнолипиды, софоролипиды, маннозилэри-тритоллипиды, трегалолипиды. Продуцентами трегалолипидов являются микроорганизмы семейства актинобактерий родов Mycobacterium, Rhodococcus, Norcadia, Gordonia, Anthrobacter [4].
Трегалолипиды представляют собой вещества, которые эффективно снижают поверхностное натяжение среды и имеют высокую эмульгирующую активность. Они нашли применение в технологиях добычи нефти для повышения нефтеотдачи и в биотехнологиях защиты окружающей среды [15, 19]. Трегалоли-пиды проявляют биологическую активность при взаимодействии с фосфолипидными мембранами и белками, гемолитическую активность [17, 18, 38, 39], воздействуют на дифференциацию опухолевых клеток человека [32], т.е. имеют значительный потенциал в области медицины.
Известно, что родококки выделяют трега-лолипидные биосурфактанты в культуральную среду (внеклеточные биосурфактанты, биосурфактанты экзотипа) и синтезируют клеточно-связанные биосурфактанты (биосурфактанты эндотипа) [14, 37]. Причем в зависимости от вида бактерий, субстратов, условий культивирования микроорганизмы выделяют трегалоли-пиды различного строения: неиногенные ацил-производные трегалозы, среди которых наиболее изучены моно- и димиколаты [13, 16, 23, 31, 36] и анионные трегалолипиды, содержащие остаток янтарной кислоты [9, 33-35]. В некоторых случаях в культуральной среде родококков были обнаружены свободные жирные кислоты и глю-козсодержащие липиды [20], липопептиды [21] и полисахариды [12]. В большинстве случаев родококки продуцируют биосурфактанты при культивировании на гидрофобных субстратах. Известно, что бактерии рода Rhodococcus являются эффективными деструкторами различных гидрофобных субстратов [4]. Их часто
включают в состав биопрепаратов для очистки нефтезагрязненных территорий [3].
Целью настоящей работы является выяснение способности бактерий Rhodococcus sp. S67 и Rhodococcus sp. X5 продуцировать гли-колипидные биосурфактанты при росте на гидрофобных субстратах на примере н-гексаде-кана.
ЭКПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Штаммы микроорганизмов-продуцентов биоПАВ. Штаммы бактерий Rhodococcus sp. S67, Rhodococcus sp. X5 получены из лаборатории плазмид Института биохимии и физиологии микроорганизмов имени Г.К. Скрябина РАН (г. Пущино). Бактерии входят в состав биопрепарата «МикроБак», который используют для биоремедиации нефтезагрязненных территорий [1].
Питательные среды и условия культивирования. Микроорганизмы культивировали в жидкой минеральной среде Эванса [10] и полноценной среде Лурия-Бертани [6]. Готовые среды стерилизовали автоклавированием в течение 30 мин при 120 оС. Бактерии выращивали в жидкой питательной среде ЛБ в течение 24 ч для получения инокулята. Культивирование микроорганизмов проводили в колбах Эрленмейера объёмом 750 мл на орбитальной качалке (при 26 оС, n = 180 об/мин) в течение 6 сут в присутствии н-гексадекана (2%, v/v) как единственного источника углерода и энергии.
Динамика роста и продуцирования био-сурфактантов. О росте микроорганизмов судили по изменению оптической плотности клеточной суспензии (при 600 нм). Бесклеточный супернатант получали центрифугированием культуральной среды на центрифуге TG16WS («Поликом», Россия) при 12 000 g в течение 10 мин при 4 оС. Поверхностное натяжение су-пернатанта измеряли на тензиометре Kruss K6 («Kruss», Germany) методом отрыва кольца Дю Нуи при 25 оС [5]. Содержание биосурфактанта оценивали по концентрации сахаров в культу-ральной среде бактерий. Для этого определяли концентрацию углеводов колориметрическим методом после взаимодействия с фе-нолсернокислотным реактивом [8]. Бесклеточный супернатант (0,5 мл) помещали в пробирку, добавляли 500 мкл 5%-го раствора фенола в воде. При интенсивном перемешивании вносили 2,5 мл концентрированной серной кислоты (р = 1,84 г/мл), оставляли на 10 мин. Измерение оптической плотности полученного раствора проводили при длине волны 480 нм на фотометре «Эксперт-003» (ООО «Эконикс-Эксперт», Россия). Раствор сравнения готовили анало-
гично, заменяя пробу дистиллированной водой.
Индекс эмульгирования. Индекс эмульгирования бесклеточного супернатанта определяли по методике [7]. В мерную пробирку к 4,0 мл полученной пробы бесклеточного су-пернатанта добавляли 4,0 мл гидрофобного субстрата (н-гексадекана). Полученную смесь интенсивно перемешивали в течение 2 мин и оставляли на 24 ч при комнатной температуре, после чего определяли индекс эмульгирования (Е24, %), рассчитываемый как процентное отношение высоты слоя эмульсии к общей высоте слоя жидкости в пробирке.
Определение гидрофобности клеточной поверхности. Гидрофобность определяли по MATH-тесту (Microbial Adherence to Hydrocarbon) с модификациями [29, 30]. После 6 сут культивирования родококков в условиях, описанных выше, содержимое колб центрифугировали в течение 10 мин при 12 000 g на центрифуге TG16WS (ООО «Фирма «ПОЛИКОМ», Россия). Клеточную биомассу дважды отмывали дистиллированной водой и ресуспенди-ровали в фосфатно-магниевом буфере (рН = 7,0) так, чтобы значение оптической плотности (при 600 нм) клеточной суспензии всех образцов было в пределах 0,48-0,50. К 3,0 мл клеточной суспензии добавляли 0,5 мл н-гексаде-кана. Содержимое пробирок интенсивно встряхивали в течение 3 мин и оставляли для разделения фаз на 10 мин при температуре 37 оС. Аккуратно пипеткой отбирали 3 мл нижней водной фракции и измеряли ее оптическую плотность при 600 нм. Степень адгезии клеток (гидрофобность клеточной поверхности) рассчитывали по формуле
Н, % = (1- ОП1/ОП0) x 100%,
где ОП0 ОП1 - оптическая плотность клеточной суспензии до и после добавления н-гексаде-кана соответственно. В качестве контрольного образца использовали буферный раствор вместо суспензии клеток.
Экстракция и выделение внеклеточных липидов. Внеклеточные липиды выделяли из бесклеточного супернатанта экстракцией смесью хлороформ : метанол (3 : 1, v/v). Бесклеточный супернатант подкисляли соляной кислотой до рН 2 и оставляли на 12 ч при 4 оС. Экстракцию проводили из равного объёма пробы. Нижний органический слой отбирали, растворитель удаляли на ротационном испарителе ИР-1М2 (ОАО «Химлаборприбор», Россия) при 35 оС и 0,2 атм. Незадолго до окончания упаривания к смеси добавляли бензол и упаривали досуха.
Тонкослойная хроматография глико-липидов. Разделение липидных компонентов
проводили на пластинах TLC Silica gel 60 F254 («Merck», Germany). В качестве подвижной фазы использовали систему хлороформ : метанол : вода (65 : 15 : 2). Для обнаружения гликолипидов пластинки обрабатывали нафтольным реагентом (0,5 г a-нафтола в 100 мл смеси метанол : вода (1:1, v/v)), затем 10%-ой концентрированной серной кислотой, и нагревали при 110 оС до максимального проявления окраски [36]. Гликолипиды проявлялись в виде сине-фиолетовых пятен.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Качественный анализ гликолипидных биосурфактантов. Бактерии-нефтедеструк-торы Rhodococcus sp. X5 и Rhodococcus sp. S67 культивировали в жидкой минеральной среде с добавлением н-гексадекана при 26 оС в течение 6 сут Для обнаружения гликолико-липидных биосурфактантов, продуцируемых бактериями в ростовую среду (биосурфактантов экзотипа), проводили экстракцию липидов из бесклеточной культуральной среды полярными органическими растворителями. Липиды разделяли методом тонкослойной хроматографии. Для обнаружения на хроматограмме гликолипидов применяли нафтольный реагент - специфический проявитель для сахаров, который позволяет идентифицировать гликолипиды среди других липидных компонентов [2]. На хроматограмме обнаруживается несколько гликолипидных компонентов, одинаковых для обоих штаммов (рис. 1).
На хроматограмме проявлялись два наиболее интенсивно окрашенных сигнала, которые имели одинаковую хроматографическую подвижность независимо от культивируемого штамма родококков. Сравнение полученных результатов с данными, полученными ранее нами [22] и другими авторами, позволило предположить, что эти соединения могут быть как сукци-ноилтрегалолипидами [34], так и трегалозами-колатами [36]. Трегалолипиды наиболее часто продуцируются родококками, способными утилизировать гидрофобные субстраты [3, с. 291]. Таким образом предполагается, что трегалоли-пиды обеспечивают доступность углеводородов нефти для бактерий-нефтедеструкторов Rhodococcus sp. X5 и Rhodococcus sp S67 [27, с. 291].
Динамика роста бактерий-нефтеде-структоров Rhodococcus sp. X5 и Rhodococcus sp. S67 и их способность продуцировать биосурфактанты. Для выяснения взаимосвязи между образованием биосурфактантов и фазами роста бактерий проводили кинетический эксперимент, в котором определяли поверхностное натяжение и содержание сахаров в культуральной среде без клеток каждые 24 ч. В ходе культивирования Rhodococcus sp. эмульсии, напоминающей молоко. Эмульсия распределялась равномерно по всему объему среды, и ее мутность увеличивалась при дальнейшем культивировании в течение 6 сут. На поверхности культуральной среды Rhodococcus sp. S67 уже через 24 ч наблюдали фор-
Рис. 1. Хроматограмма липидного экстракта бесклеточного супернатанта после культивирования бактерий Rhodococcus sp. X5 и Rhodococcus sp S67 на н-гексадекане при 26 оС в течение 6 сут (пластины TLC Silica gel 60 F254 («Merck», Germany); подвижная фаза - хлороформ : метанол : вода (65 : 15 : 2)
мирование пленки, в то время как образование суспензии в объеме было меньше, чем у Rho-docccus sp. Х5. Можно предположить, что бактерии Rhodocccus sp. Х5 в большей степени продуцируют биосурфактанты экзотипа, а бактерии Rhodocccus sp. Б67 синтезируют клеточ-носвязанные биосурфактанты. На рис. 2 и 3 представлены зависимости между динамикой роста бактерий Rhodococcus sp. X5 и Rhodo-coccus sp. S67 на н-гексадекане и физико-химическими показателями среды. Численность бактерий в жидкой среде определяли турби-диметрическим методом по изменению мутности среды в процессе роста биомассы. Следует отметить, что при этом не удается учитывать бактерии, образовавшие слой на поверхности культуральной среды. Бактерии X5 адаптировались и переходили в экпоненциальную стадию роста через сутки культивирования, интенсивный рост продолжался в течение 3 сут, максимальное значение оптической плотности бактериальной суспензии составило 3,0 (рис. 2, кривая 1). В то же время в культуральной среде бактерий Rhodocccus sp. S67 наблюдалось постепенное увеличение оптической плотности, максимальное значение достигалось на 5-е сутки и составило 0,5 (рис. 3, кривая 1). Полученный результат коррелирует с физиологическим поведением изучаемых родококков: образование молочной суспензии у Rhodococcus sp. X5 и формирование биопленки на поверхности у Rhodococcus sp. S67.
Общее содержание продуцируемых био-сурфактантов можно оценить по изменению поверхностного натяжения среды, а содержание гликолипидных биосурфактантов - косвенно по содержанию сахаров в среде. Поверхностное натяжение культуральной среды и содержание трегалолипидов по мере роста бактерий на н-гексадекане определяли после удаления клеток центрифугированием (в бесклеточном супернатанте) через каждые 24 ч (рис. 2 и 3, кривая 2). У обоих родококков наблюда-
ли резкое уменьшение поверхностного натяжения бесклеточного супернатанта на первые сутки культивирования с 72 мН/м до 38 мН/м. В течение следующих 2 сут происходило постепенное уменьшение поверхностного натяжения до 27 мН/м, это значение сохранялось на протяжении всего времени роста микроорганизмов. Такие значения поверхностной активности культуральной среды характерны и для других родококков (табл. 1).
Таким образом, бактерии-нефтедеструкто-ры Rhodococcus sp. X5 и Rhodococcus sp. S67 при росте на н-гексадекане являются одними из самых эффективных продуцентов биосур-фактантов экзотипа. Содержание гликолипидов в бесклеточном супернатанте увеличивалось по мере роста клеток, и наибольшее значение достигалось на поздней фазе экспоненциального роста. Бактерии Х5 продуцируют углеводсодержащие компоненты в большем количестве (305 мг/л трегалолипидов), чем бактерии S67 (280 мг/л трегалолипидов) (рис. 2 и 3, кривая 3). В работе [11] было показано, что бактерии Rhodococcus sp. BAP-1 при росте на флуорантене через 5 сут продуцировали гликолипидные биосурфактанты в количествах 150-360 мг/л в зависимости от концентрации ростового субстрата. Важно отметить, что полученные нами результаты указывают на то, что снижение поверхностного натяжения куль-туральной среды может быть обусловлено наличием не только трегалолипидов, биосинтез которых требует дополнительных затрат энергии, но и более простых соединений, например, промежуточных метаболитов, образующихся при окислении гексадекана.
Одним из механизмов проявления поверхностной активности среды может быть увеличение содержания свободных жирных кислот во время лаг-фазы роста бактерий, что повышает биодоступность гидрофобных субстратов обеспечивает экпоненциальный рост биомассы и биосинтез гликолипидов микроорганизмами
Таблица 1
Значение поверхностного натяжения среды при культивировании бактерий рода Rhodococcus в жидкой минеральной среде
Микроорганизмы Образец Поверхностное натяжение, мН/м Субстрат Источники
Rhodococcus sp. 51T7 Бесклеточный супернатант 30-35 Н-алкан (С12-С16) [9]
R. erythropolis Культуральная среда 27,1 Н-гексадекан
R. longus Культуральная среда 27,2 Н-гексадекан
R. opacus Культуральная среда 26,5 Н-гексадекан [23]
R. ruber Культуральная среда 27,4 Н-гексадекан
R.erythropolis EK-1 Бесклеточный сепернатант 30-39 Н-гексадекан [24]
R.erythropolis 3C-9 Культуральная среда 33,4 Н-гексадекан [20]
R. wratislaviensis BN38 Культуральная среда 28,6 Н-гексадекан [34]
R. ruber Z25 Липидный экстракт 29,5 Н-гексадекан [40]
Рис. 2. Динамика роста культуры Rhodococcus эр. Х5 (1), поверхностного натяжения среды
(2) и содержания трегалолипидов в среде (3)
Рис. 3. Динамика роста культуры Rhodococcus эр. Б67 (1), поверхностного натяжения среды
(2) и содержания трегалолипидов в среде (3)
на следующей стадии [13, 25].
Еще одной важной характеристикой био-ПАВ является эмульгирующая активность, которая обусловлена структурными особенностями этих соединеий. Трегалолипиды характеризуются высокой поверхностной и эмульгирующей активностью [3]. В ходе культивирования родококков на н-гексадекане определяли индекс эмульгирования ^24) бесклеточного супернатанта. Индекс эмульгирования среды
^обососсиз зр. X5 выше (55%), чем у №обо-соссиз зр. S67 (40%) (рис. 4). Этот результат согласуется со способностью этих штаммов продуцировать трегалолипиды в культураль-ную среду (рис. 2 и 3, кривая 3). Таким образом, продуцируемые ЯЬобососсиз зр. X5 и ЯЬобососсиз зр. S67 гликолипидные биосурфак-танты принимают участие в образовании эмуль сии с гидрофобными субстратами, что и обес печивает эффективную биодеградацию угле-
Рис. 4. Индекс эмульгирования бесклеточного супернатанта и гидрофобность клеточной поверхности к н-гексадекану (H%) Rhodococcus sp. X5 и Rhodococcus sp. S67
водородов нефти этими бактериями.
Гидрофобность клеточной поверхности. Известно, что родококки продуцируют преимущественно гликолипиды, связанные с клеточной стенкой бактерий [3]. При росте на н-гек-садекане гидрофобность клеточной поверхности у бактерий ЯЬобососсиз зр. S67 выше, чем у №обососсиз зр. X5 (рис. 4). Как уже было описано выше, на поверхности культуральной среды бактерий S67 формируется слой микроорганизмов с гидрофобным субстратом, толщина которого увеличивается во времени культивирования, в то время, как бактерии X5 образуют молочную эмульсию в присутствии н-гек-садекана. Формирование слоя биомассы на поверхности среды в процессе культивирования штамма Мобососсиз зр. S67 обусловлено, вероятно, способностью этих бактерий образовывать биосурфактанты эндотипа более эффективно, чем ЯЬобососсиз зр. X5. Клеточно-свя-занные биосурфактанты играют ключевую роль в формировании гидрофобной клеточной стенки бактерий, увеличивая их сродство к гидрофобному субстрату [3, с. 291]. Степень адге-
1. Филонов А.Е., Кошелева И.А., Самойлен-ко В.А., Шкидченко А.Н., Нечаева И.А., Пунтус И.Ф., Гафаров А.Б., Якшина Т.В., Боронин А.М., Петриков К.В. Биопрепарат для очистки почв от
зии клеток на гексадекане составила 61% для Rhodococcus sp. S67 и 53% для Rhodococcus sp. X5 (рис. 4). Таким образом, у бактерии Rhodococcus sp. S67 некоторая часть трегалолипидов остается прочно связанной с клеточной стенкой бактерий, в то время как бактерии Rhodococcus sp. X5 продуцируют трегало-липиды в среду в большей степени. Такое различие в физиолого-биохимическом поведении углеводородокисляющих родококков является удивительным и интересно для дальнейшего изучения.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Бактерии-нефтедеструкторы Rhodococcus sp. S67 и Rhodococcus sp. X5 - компоненты биопрепарата «МикроБак» - являются эффективными продуцентами гликолипидных биосур-фактантов при росте в жидкой минеральной среде на н-гексадекане и обладают значительным биотехнологическим потенциалом для получения сукциноилтрегалолипидов с целью их дальнейшего применения.
КИЙ СПИСОК
загрязнений нефтью и нефтепродуктами, способ его получения и применения / Патент № 2378060, Российская Федерация. Опубл. 10.01.2009. Бюл. № 1.
2. Abu-Ruwaida A.S., Banat I.M., Haditirto S., Salem A., Kadri M. Isolation of biosurfactant-produ-cing bacteria, product characterization, and evaluation // Acta Biotechnologica. V.11. № 4. P. 315-324.
3. Alvarez H.M. Biology of Rhodococcus, Microbiology Monographs 16. Springer-Verlag, 2010. 371 p.
4. Banat I.M., Franzetti A., Gandolfi I., Bestetti G., Martinotti M.G., Fracchia L., Smyth T.J., Marchant R. Production and aplications trehalose lipid biosurfactants // Appl. Microbiol. and Biotechnol. 2010. V. 87, № 2. P. 427-444.
5. Bodour A.A., Miller-Maier R.M. Application of a modified drop-collapse technique for surfactant quantitation and screening of biosurfactant-producing microorganisms // Journal of Microbiological Methods. 1998. V. 32, № 3. P. 273-280.
6. Carhart G., Hegeman G. Improved method of selection for mutants of Pseudomonas putida // Appl. Microbiol. 1975. V. 30. Р. 1046-1053.
7. Cooper D.G., Goldenberg B.G. Surface-active agents from two Bacillus species // App Environ Microbiol. 1987. V. 53, № 2. P. 224-233.
8. Dubois M. Colorimetric method for determination of sugars and related substances // Anal Chem. 1956. V. 28, № 3. P. 350-356.
9. Espuny M.J., Egjido S., Mercade M.E., Manresa A. Characterizations of trehalose tetraesters produced by Rhodococcus sp. 51T7 // Toxicological and Environmental chemistry. 1989. V. 48. P. 83-88.
10. Evans C.G.T., Herbert D., Tempest D.B. The continuous cultivation of microorganisms. 2. Construction of a chemostat // Meth Microbiol.1970. V. 2. P. 277-327.
11. Hongqi Y.L., Hua W.F. Uptake modes of fluoranthene by strain Rhodococcus sp. Bap-1 // Biotechnology & Biotechnological Equipment. 2013. V. 27, № 6. P. 4256-4262.
12. Iwabuchi N., Sunairi M., Anzai H., Nakaji-ma M., Harayama S. Relationships between colony morphotypes and oil tolerance in Rhodococcus rhodochrous // Appl Environ Microbiol. 2000. V. 66, № 11. P.5073-5077.
13. Kretschmer A., Bock H., Wagner F. Chemical and physical characterization of Interfacial-Active Lipids from Rhodococcus erythropolis grown on n-alkanes // Applied and Environmental Micro-bology. 1982. V. 44, № 4. P. 864-870.
14. Lang S., Philp J.C. Surface-active lipids in rhodococci // Antonie Van Leeuwenhoek. 1998. V. 74. № 1-3. P. 59-70.
15. Liu C.W., Liu H.S. Rhodococcus erythro-polis strain NTU-1 efficiently degrades and traps diesel and crude oil in batch and fed-batch bio-reactors // Process Biochemistry. 2011. V. 46, № 1. P. 202-209.
16. Niescher S., Lang S., Kaschabek S, Schlomann M. Identification and structural characterization of novel trehalose dinocardiomycolates from n-alkanegrown Rhodococcus opacus 1CP // Applied Microbiol Botechnol. 2006. V. 70. P. 605611.
17. Ortiz A., Teruel J.A., Espuny M.J., Marques A., Manresa A., Aranda F.J. Interactions of a Rhodococcus sp. biosurfactant trehalose lipid with phosphatidylethanolamine membranes // Biochim Biophys Acta. 2008. V. 1778, № 12. P. 2806-2813.
18. Ortiz A., Teruel J.A., Manresa A., Espuny M.J., Marques A., Aranda F. J. Effects of a bacterial trehalose lipid on phosphatidylglycerol membranes // Biochim Biophys Acta. V. 1808, № 8. P. 2067-2072.
19. Pacheco G.J., Ciapina E.M., Gomes E. B., Junior N. P. Biosurfactant production by Rhodococ-cus erythropolis and its application to oil removal // Braz J Microbiol. 2010. V. 3, № 41. P. 685-693.
20. Peng F., Liu Z., Wang L., Shao Z. An oil-degrading bacterium: Rhodococcus erythropolis strain 3C-9 and its biosurfactants // J Appl Microbiol. 2007. V. 102, № 6. P. 1603-1611.
21. Peng F., Wang Y., Sun F., Liu Z., Lai Q., Shao Z. A novel lipopeptide produced by a Pacific Ocean deep-sea bacterium, Rhodococcus sp. TW53 // J Appl Microbiol. 2008. V. 105, № 3. P. 698-705.
22. Petrikov K., Delegan Y., Surin A., Pona-moreva O., Puntus I., Filonov A., Boronin A. Glyco-lipids of Pseudomonas and Rhodococcus oil-degrading bacteria used in bioremediation preparations: Formation and structure // Process Biochemistry. 2013. V. 48, № (5-6). P. 931-935.
23. Philp J.C., Kuyukina M.S., Ivshina I.B., Dunbar S. A., Christofi N., Lang S., Wray V. Alkano-trophic Rhodococcus ruber as a biosurfactant producer // Appl. Microbiol Biotechnol. 2002. V. 59, № (2-3). P. 318-324.
24. Pirog T.P., Voloshina I.N., Shevchuk T.A., Karpenko E.V. Production of surfactants by Rhodococcus erythropolis strain EK-1, grown on hyd-rophilic and hydrophobic substrates. // Applied biochemistry and microbiology. 2004. V. 40, № 5. P. 470-475.
25. Rehm H. J., Reiff I. Mechanisms and occurrence of microbial oxidation of long-chain alkanes // Reactors and Reactions. Springer Berlin Heidelberg. 1981. V. 19. P. 175-215.
26. Rodrigues L.R., Teixeira J.A. Biomedical and therapeutic applications of biosurfactants // Adv Exp Med Biol. 2010. V. 672. P. 75-87.
27. Romeo-Zeron L. Introduction to enhanced oil recovery (EOR) processes and bioremediation of oil-contaminated sites. Intech. 2012. 318 p.
28. Ron E., Rosenberg E. Natural roles of biosurfactants // Environ Microbiol. 2001. V. 3, № 4. P. 229-236.
29. Rosenberg, M. Bacterial adherence to hy-
drocarbons: a useful technique for studying cell surface hydrophobicity // FEMS Microbiology. 1984. V. 22. P.289-295.
30. Satpute S.K., Banpurkar A.G., Dhakephal-kar P.K., Banat I.M., Chopade B.A.. Methods for investigating biosurfactants and bioemulsifiers: a review // Crit Rev Biotechnol. 2010. V. 30, № 2. P. 127-144.
31. Singer M.E., Finnerty W.R. and Tunelid A. Physical and chemical properties of a biosurfactant synthesized by Rhodococcus species H13-A // Can J Microbiol.1990. V. 36, № 11. P. 746-750.
32. Sudo T., Zhao X., Wakamatsu Y., Shiba-hara M., Nomura N., Nakahara T., Suzuki A., Koba-yashi Y., Jin C., Murata T., Yokoyama K. Induction of the differentiation of human HL-60 promyelocyte leukemia cell line by succinoyl trehalose lipids // Cytotechnology. 2000. V. 33, № (1-3). P. 259-264.
33. Tokumoto Y., Nomura N., Uchiyama H., Imura T., Morita T., Fukuoka T., Kitamoto D. Structural characterization and surface-active properties of a succinoyl trehalose lipid produced by Rhodococcus sp. SD-74 // J Oleo Sci. 2009. V. 58, № 2. P. 97-102.
34. Tuleva B., Christova N., Cohen R., Stoev G., Stoineva I. Production and structural elucidation of trehalose tetraesters (biosurfactants) from a novel alkanothrophic Rhodococcus wratislaviensis strain // J Appl Microbiol. 2008. V. 104, № 6. P. 1703-1710.
35. Uchida Y., Masako C., Hirano J., Tabuchi
T. Extracellular accumulation of mono-and di-succinoyl trehalose lipids by strain of Rhodococcus erythropolis grown on n-alkans // Agri. Biol. Chem. 1989. V.53, № 3. P. 757-763.
36. Ueda S., Fujiwara N., Naka T., Sakaguchi I., Ozeki Y., Yano I., Kasama T., Kobayashi K. Structure-activity relationship of mycoloyl glycolipids derived from Rhodococcus sp. 4306 // Microb Pathog. 2001. V. 30, № 2. P. 91-99.
37. Yakimov M.M., Giuliano L., Bruni V., Scarfi S., Golyshin P.N. Characterization of antarctic hydrocarbon-degrading bacteria capable of producing bioemulsifiers // New Microbiol. 1999. V. 22, № 3. P. 249-256.
38. Zaragoza A., Aranda F. J., Espuny M. J., Teruel J.A., Marques A., Manresa A., Ortiz A. Hemolytic activity of a bacterial trehalose lipid biosurfactant produced by Rhodococcus sp.: evidence for a colloid-osmotic mechanism // Langmuir. 2010. V. 26, № 11. P. 8567-8572.
39. Zaragoza A., Teruel J.A., Aranda F.J., Ortiz A. Interaction of a trehalose lipid biosurfactant produced by Rhodococcus erythropolis 51T7 with a secretory phospholipase A2 // J Colloid Interface Sci. 2013. V. 408. P. 132-137.
40. Zheng C., Li S., Yu L., Huang L., Wu Q. Study of the biosurfactant-producing profile in a newly isolated Rhodococcus ruber strain // Annals of Microbiology. 2009. V. 59, № 4. P. 771-777.
1. Filonov A.E., Kosheleva I.A., Samoilenko V.A., Shkidchenko A.N., Nechaeva I.A., Puntus I.F., Gafarov A.B., Yakshina T.V., Boronin A.M., Petrikov K.V. Biopreperat dlya ochistki pochv ot zagryaznenii neft'yu i nefteproduktami, sposob ego polucheniya i primeneniya [A biopreparation for cleanup of soils from oil and oil-product spills, the method of its production and application]. Patent RF no. 2378060, publ. 10.01.2009, bulletin no.1.
2. Abu-Ruwaida A.S., Banat I.M., Haditirto S., Salem A., Kadri M. Isolation of biosurfactant-pro-ducing bacteria, product characterization, and evaluation. Acta Biotechnologica, vol. 11, no. 4, pp. 315-324.
3. Alvarez H.M. Biology of Rhodococcus, Microbiology Monographs 16. Springer-Verlag, 2010, 371 p.
4. Banat I.M., Franzetti A., Gandolfi I., Bestetti G., Martinotti M.G., Fracchia L., Smyth T.J., Marchant R. Production and aplications trehalose lipid biosurfactants. Appl. Microbiol. and Biotechnol., 2010, vol. 87, no. 2, pp. 427444.
5. Bodour A.A., Miller-Maier R.M. Application of a modified drop-collapse technique for surfactant quantitation and screening of biosurfactant-pro-ducing microorganisms. Journal of Microbiological
Methods, 1998, vol. 32, no. 3, pp. 273-280.
6. Carhart G., Hegeman G. Improved method of selection for mutants of Pseudomonas putida. Appl. Microbiol., 1975, vol. 30, pp. 1046-1053.
7. Cooper D.G., Goldenberg B.G. Surface-active agents from two Bacillus species. Appl. Environ. Microbiol., 1987, vol. 53, no. 2, pp. 224-233.
8. Dubois M. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Anal. Chem., 1956, vol. 28, no. 3, pp. 350-356.
9. Espuny M.J., Egjido S., Mercade M.E., Manresa A. Characterizations of trehalose tetraesters produced by Rhodococcus sp. 51T7. Toxi-cological and Environmental chemistry, 1989, vol. 48, pp. 83-88.
10. Evans C.G.T., Herbert D., Tempest D.B. The continuous cultivation of microorganisms. 2. Construction of a chemostat. Meth. Microbiol., 1970, vol. 2, pp. 277-327.
11. Hongqi Y.L., Hua W.F. Uptake modes of fluoranthene by strain Rhodococcus sp. Bap-1. Biotechnology & Biotechnological Equipment, 2013, vol. 27, no. 6, pp. 4256-4262.
12. Iwabuchi N., Sunairi M., Anzai H., Nakaji-ma M., Harayama S. Relationships between colony morphotypes and oil tolerance in Rhodococcus
rhodochrous. Appl. Environ. Microbiol., 2000, vol. 66., no. 11, pp. 5073-5077.
13. Kretschmer A., Bock, H., and Wagner F. Chemical and physical characterization of interfacial-active lipids from Rhodococcus erythropolis grown on n-alkanes. Appl. Environ. Microbol., 1982, vol. 44, no. 4, pp. 864-870.
14. Lang S., Philp J.C. Surface-active lipids in rhodococci. Antonie Van Leeuwenhoek, 1998, vol. 74, no. (1-3), pp. 59-70.
15. Liu C.W., Liu H.S. Rhodococcus erythropolis strain NTU-1 efficiently degrades and traps diesel and crude oil in batch and fed-batch bioreactors. Process Biochemistry, 2011, vol. 46, no.1, pp. 202-209.
16. Niescher S., Lang S., Kaschabek S, Schlomann M. Identification and structural characterization of novel trehalose dinocardiomycolates from n-alkane - grown Rhodococcus opacus 1CP. Applied Microbiol. Botechnol, 2006, vol. 70, pp. 605611.
17. Ortiz A., Teruel J.A., Espuny M.J., Marques A., Manresa A., Aranda F.J. Interactions of a Rhodococcus sp. biosurfactant trehalose lipid with phosphatidylethanolamine membranes. Biochim. Biophys. Acta, 2008, vol. 1778, no. 12, pp. 28062813.
18. Ortiz A., Teruel J.A., Manresa A., Espuny M.J., Marques A., Aranda F.J. Effects of a bacterial trehalose lipid on phosphatidylglycerol membranes. Biochim. Biophys. Acta, vol. 1808, no. 8, pp. 20672072.
19. Pacheco G.J., Ciapina E.M., Gomes E. B., Junior N. P. Biosurfactant production by Rhodococcus erythropolis and its application to oil removal. Braz. J. Microbiol., 2010, vol. 3, no. 41, pp. 685-693.
20. Peng F., Liu Z., Wang L., Shao Z. An oil-degrading bacterium: Rhodococcus erythropolis strain 3C-9 and its biosurfactants. J. Appl. Microbiol., 2007, vol. 102, no. 6, pp. 1603-1611.
21. Peng F., Wang Y., Sun F., Liu Z., Lai Q., Shao Z.A novel lipopeptide produced by a Pacific Ocean deep-sea bacterium, Rhodococcus sp. TW53. J. Appl. Microbiol., 2008, vol. 105, no. 3, pp. 698-705.
22. Petrikov K., Delegan Y., Surin A., Pona-moreva O., Puntus I., Filonov A., Boronin A. Gly-colipids of Pseudomonas and Rhodococcus oil-degrading bacteria used in bioremediation preparations: Formation and structure. Process Biochemistry, 2013, vol. 48, no. (5-6), pp. 931-935.
23. Philp J.C., Kuyukina M.S., Ivshina I.B., Dunbar S. A., Christofi N., Lang S., Wray V. Alkano-trophic Rhodococcus ruber as a biosurfactant producer. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2002, vol. 59, no. (2-3), pp. 318-324.
24. Pirog T.P., Voloshina I.N., Shevchuk T.A., Karpenko E.V. Production of surfactants by Rho-
dococcus erythropolis strain EK-1, grown on hydrophilic and hydrophobic substrates. Applied biochemistry and microbiology, 2004, vol. 40, no. 5, pp. 470-475.
25. Rehm H.J., Reiff I. Mechanisms and occurrence of microbial oxidation of long-chain alkanes. Reactors and Reactions. Springer Berlin Heidelberg, 1981, vol. 19, pp. 175-215.
26. Rodrigues L.R., Teixeira J.A. Biomedical and therapeutic applications of biosurfactants. Adv. Exp. Med. Biol., 2010, vol. 672, pp. 75-87.
27. Romeo-Zeron L. Introduction to enhanced oil recovery (EOR) processes and bioremediation of oil-contaminated sites. Intech, 2012, 318 p.
28. Ron E., Rosenberg E. Natural roles of biosurfactants. Environ. Microbiol., 2001, vol. 3, no. 4, pp. 229-236.
29. Rosenberg M. Bacterial adherence to hydrocarbons: a useful technique for studying cell surface hydrophobicity. FEMS Microbiology, 1984, vol. 22, pp. 289-295.
30. Satpute S.K., Banpurkar A.G., Dhakephal-kar P.K., Banat I.M., Chopade B.A. Methods for investigating biosurfactants and bioemulsifiers: a review. Crit. Rev. Biotechnol., 2010, vol. 30, no. 2, pp. 127-144.
31. Singer M.E., Finnerty W.R., Tunelid A. Physical and chemical properties of a biosurfactant synthesized by Rhodococcus species H13-A. Can. J. Microbiol., 1990, vol. 36, no. 11, pp. 746-750.
32. Sudo T., Zhao X., Wakamatsu Y., Shiba-hara M., Nomura N., Nakahara T., Suzuki A., Koba-yashi Y., Jin C., Murata T., Yokoyama K. Induction of the differentiation of human HL-60 promyelocyte leukemia cell line by succinoyl trehalose lipids. Cytotechnology, 2000, vol. 33, no. (1-3), pp. 259264.
33. Tokumoto Y., Nomura N., Uchiyama H., Imura T., Morita T., Fukuoka T., Kitamoto D. Structural characterization and surface-active properties of a succinoyl trehalose lipid produced by Rho-dococcus sp. SD-74. J. Oleo Sci., 2009, vol. 58, no. 2, pp. 97-102.
34. Tuleva B., Christova N., Cohen R., Stoev G., Stoineva I. Production and structural elucidation of trehalose tetraesters (biosurfactants) from a novel alkanothrophic Rhodococcus wratislaviensis strain. J. Appl. Microbiol., 2008, vol. 104, no. 6, pp. 17031710.
35. Uchida Y., Masako C., Hirano J., Tabuchi T. Extracellular accumulation of mono-and di-suc-cinoyl trehalose lipids by strain of Rhodococcus erythropolis grown on n-alkans. Agri. Biol. Chem., 1989, vol. 53, no. 3, pp. 757-763.
36. Ueda S., Fujiwara N., Naka T., Sakaguchi I., Ozeki Y., Yano I., Kasama T., Kobayashi K. Structure-activity relationship of mycoloyl glycolipids derived from Rhodococcus sp. 4306. Microb.
Pathog., 2001, vol. 30, no. 2, pp. 91-99.
37. Yakimov M.M., Giuliano L., Bruni V., Scarfi S., Golyshin P.N. Characterization of antarctic hydrocarbon-degrading bacteria capable of producing bioemulsifiers. New Microbiol., 1999, vol. 22, no. 3, pp. 249-256.
38. Zaragoza A., Aranda F.J., Espuny M.J., Teruel J.A., Marques A., Manresa A., Ortiz A. Hemolytic activity of a bacterial trehalose lipid biosurfactant produced by Rhodococcus sp.: evidence for a colloid-osmotic mechanism. Langmuir, 2010,
vol. 26, no. 11, pp. 8567-8572.
39. Zaragoza A., Teruel J.A., Aranda F.J., Ortiz A. Interaction of a trehalose lipid biosurfactant produced by Rhodococcus erythropolis 51T7 with a secretory phospholipase A2. J. Colloid Interface Sci., 2013, vol. 408, pp. 132-137.
40. Zheng C., Li S., Yu L., Huang L., Wu Q. Study of the biosurfactant-producing profile in a newly isolated Rhodococcus ruber strain. Annals of Microbiology, 2009, vol. 59, no. 4, pp. 771-777.
Статья поступила в редакцию 17.12.2015 г.
УДК 577.152.54:661.746.5
СИНТЕЗ ИНВЕРТАЗЫ ШТАММАМИ МИКРОМИЦЕТА ASPERGILLUS NIGER ПРОДУЦЕНТАМИ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ
© Н.Ю. Шарова
Всероссийский научно-исследовательский институт пищевых добавок,
Россия, 191014, г. Санкт-Петербург, Литейный проспект, д. 55, natalya_sharova1@mail.ru
В статье представлены результаты исследований биосинтеза инвертазы продуцентами лимонной кислоты - штаммами микромицета Aspergillus niger Л-4, Л-7 и В-3. Цель работы - установить закономерности биосинтеза инвертазы продуцентом лимонной кислоты с перспективой получения фермента в качестве дополнительного целевого продукта микробиологического синтеза. В результате ферментации сахарозосодержащих субстратов штаммами Aspergillus niger Л-4, Л-7 и В-3 в лимонную кислоту максимальная активность инвертазы в нативном растворе составила, соответственно 0,646 ± 0,012 ед/см3, 0,322 ± 0,007 ед/см3 и 0,853 ± 0,008 ед/см3. В мицелии активность фермента находилась на уровне 0,275 ± 0,007 ед/мг для штамма Л-4, 0,228 ± 0,011 ед/мг для штамма Л-7 и 0,321 ± 0,017 ед/мг для штамма В-3. Инвертазная активность для исследуемых штаммов сопоставима с инвертазной активностью для изученных культур Aspergillus, растущих в кислой среде. Полученные данные могут быть применены для разработки способа получения двух пищевых микроингредиентов - лимонной кислоты и инвертазы - в одном биотехнологическом процессе. Ключевые слова: штаммы Aspergillus niger; продуцент; лимонная кислота; инвертазная активность; ферментация.
PRODUCTION OF INVERTASE BY ASPERGILLUS NIGER STRAINS -PRODUCERS OF CITRIC ACID
N.Yu. Sharova
All-Russian Research Institute for food additives,
55, Liteyny Ave., St. Petersburg, 191014, Russia, natalya_sharova1@mail.ru
The article presents the results of researches of invertase biosynthesis by Aspergillus niger L-4, L-7 and V-3, which are producers of citric acid. The goal of the work was to determine consistent patterns of invertase biosynthesis by producer of citric acid with prospect of receiving enzyme as an additional target product of microbial synthesis. As a result of a fermentation the substrate containing sucrose by Aspergillus niger L-4, L-7 and V-3 in citric acid the maximum extracellular invertase activity was respectively 0,646 ± 0,012 U/mL,
