Вплив ліпосомального препарату Бутаінтервіт на протеїнсинтезувальну функцію печінки щурів за отруєння тетрахлорметаном Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Вюник Дншропетровського унiверситету. Бюлопя, медицина Visnik Dnipropetrovs'kogo universitetu. Seria Biologia, medicina Visnyk of Dnepropetrovsk University. Biology, medicine

Visn. Dnipropetr. Univ. Ser. Biol. Med. 2016. 7(2), 123-126.

ISSN 2310-4155 print ISSN 2312-7295 online

doi:10.15421/021622

www.medicine.dp.ua

УДК 577.1

Вплив лiпосомального препарату Буташтерв^ на протешсинтезувальну функцiю печшки щурiв за отруення тетрахлорметаном

M.I. XapiB, Б.В. Гутий

Львiвський нацюнальний yuieepcnmem ветеринарной медицини та бютехнологш iMeHi С.З. Гжицького, Львiв, Украта

Наведено результата дослджень впливу комплексного лшосомального препарату Бетаiнтервiт на протешсинтезувальну функ-ц1ю печiнки шурiв за отруення тетрахлорметаном. Тетрахлорметан за внутршньом'язового уведення в организм шурiв (0,25 мл/100 г маси тша) спричиняе антигенне навантаження на органiзм, викликае порушення протешсинтезувальну функци печшки. Про це свщчить зниження у кровi конценртацii протешу. В умовах оксидацшного стресу у шурiв рiвень альбумшв у сироватцi кровi на 70% нижчий, н1ж у клiнiчно здорових тварин, а концентрацiя загальних протешш у сироватцi кровi лише на 10% нижча. Поряд зi зниженням вмiсту альбумiнiв у сироватцi ^^i тдвишився рiвень глобулiновоi фракцii (ра 8,8%). Це викликало альбумшо-глобулшову диспропорцто в сироватц кровi хворих тварин. Унаслiдок цього вiдношення альбумши/глобулши склало 0,28 ± 0,03, проти 0,52 ± 0,02 у кшично здорових шурiв. Для нормалгзаци функционального стану печiнки за оксидацiйного стресу доцшьно застосовувати лiпосомальний препарат Буташтервщ який мiстить бутафосфан, штерферон, розторопшу плямисту, вiтамiни А, D i Е. За оксидацiйного стресу та за да лiпосомального препарату в шурiв другоi дослiдноi групи виявлене пiдвишення рiвня загальних протеiнiв i альбумiнiв та зниження концентрани глобулшв у сироватц кровi на п'яту та десяту добу дослiджень. На чотирнадцяту добу дослiджень за оксидацшного стресу та за до лiпосомального препарату в шурiв спостерiгали нормалгзапга показникiв про-теiнсинтезувальноi функцii печшки. Показники загальних протеiнiв, альбумiнiв, глобулшв i сшввщношення концентрапи альбу-мшв i глобулiнiв порiвняно з контрольною групою тварин перебували у межах норми.

Ключов1 слова: альбумши; глобулши; бутафосфан; штерферон; розторопша плямиста; впамши

Influence of the liposomal preparation Butaintervite on protein synthesis function in the livers of rats under the influence of carbon tetrachloride poisoning

M.I. Hariv, B.V. Gutyj

Lviv National University of Veterinary Medicine and Biotechnologies named after S.Z. Gzhytskyj, Lviv, Ukraine

This article presents the results of research into the influence of the complex liposomal preparation Butaintervit on protein synthesis function in the livers of rats under the influence of carbon tetrachloride poisoning. Intramuscular injection of carbon tetrachloride into rats at a dose of 0.25 ml per 100 g of body weight causes antigenic load on the body and leads to disruption of protein synthesis function in the liver. This is shown by reduction in blood levels of total protein and its fractions. Thus, the level of albumin in the serum of rats under the conditions of oxidative stress was 70% lower than in clinically healthy animals. However, the level of total protein in the serum was only 10% lower. This is because, along with the decrease of albumin content in the serum, the levels of globulin protein fraction increased by 8.8%. This has led to albumin/globulin disparities in the serum of sick animals. As a result, the value of A/G coefficient was 0.28 ± 0.03, compared to 0.52 ± 0.02 in clinically healthy rats. For the normalization of functional state of the liver under oxidative stress it is advisable to apply the liposomal preparation Butaintervite, which in its structure contains butafosfan, interferon, thistle and vitamins A, D and E. Under conditions of oxidative stress and under the action of the liposomal preparation in the rats from the second experimental group we have found significant increase in the levels of total protein and albumins and a decrease in serum globulin in the animals on the fifth and tenth

flbeiecbKuü mijiommbHuu yuieepcnmem eemepumpnoi Meduijuuu ma 6iотехноnогiü iMeni C.3. Г^ицbкого, eyn. nexapcbxa, 50, flbeie, 79010, yKpaiua

Lviv National University of Veterinary Medicine and Biotechnologies named after S.Z. Gzhytskyi, Pekarska Str., 50, Lviv, 79010, Ukraine Tel.: +38-068-136-20-54. E-mail: [email protected]

days of the experiment. On the fourteenth day of the experiment under the conditions of oxidative stress and under the action of the liposomal preparation in the rats from the second experimental group the normalization of protein synthesis function in the liver was observed. The level of indicators of total protein, albumin, globulin and the coefficient of albumin/globulin compared with the control group of animals were within normal values.

Keywords: albumin; globulin; butafosfan; interferon; milk thistle; vitamins

Вступ

Найбшш проблеми ветеринарно! медицини - зни-ження муюлойчю! реактивносп у постнатальний перюд розвитку та дя антропогенних чинникв, яю дестабшзу-ють метаболчш процеси в оргатзм^ викликають зни-ження природно! резистенгаосп, пригн1чують проте!нси-нтезувальну активн1сть печшки (Chumachenko et al., 2004; Gutyj et al., 2016). Стшюсть орган1зму тварин i людини до захворювань забезпечуе iмунна система, головна функцш яко! - розтзнавання та знешкодження чужорщних речо-вин для п1дгримання стабiльносгi гомеостазу оргатзму. Велику роль у цих процесах ввдграе печшка, де синтезу-ються протеши, особливо глобулiновi фракци. Крiм цьо-го, у печiнцi ввдбувасться синтез ензишв-амшотрансфе-раз, що тдтримують загальний гомеостаз в орган1зм1 (Germanyuk and Martyinyuk, 1964; Hariv, 2012). Серед ба-гатьох факторiв, яю негативно впливають на iмунну систему, протешсинтезувальну та ензимну функщю печшки тварин важливе м1сце поодають р1зн1 iмунодепресанги, як1 пригн1чують вищезгадаш функцц (Hariv, 2013). У цих умовах розвивасться iмунодефшигний стан. Власне тому оргашзм може уражатися вторинними багае^альними або вiрусними iнфекцiями (Devanto et al., 2002; Kurkin et al., 2003; Meyers et al., 2003). Для пдвищення адаптацш-но! здатносл та 1муноб1олог1чно! реактивносп оргатзму, посилення протешсинтезувально! та ензимно! функцц тварин останшми роками з успхом використовують нов1 комплексн1 препарати (Batakov, 2001; Liu and Finley, 2005; Rababah et al., 2005). Окрем1 автори встановили стимулю-вальний вплив бутафосфану, розторопш1 та вгтамшв на актившсть iмунноl та атиоксидангао! систем тварин (Batakov, 2001; Khariv et al., 2016; Martyshuk et al., 2016). Однак метаболчна дiя цих препаратв на функцю печшки та 1мунну систему ниш в науковш л1тератур1 висвплена недостатньо.

Наведене вище обгрунтовуе доцiльнiсть дослвдження впливу комплексного лшосомального препарату Буташ-тервiт, до складу якого входять бутафосфан, штерферон, розторопша та впатни, на формування iмунiтету та за-безпечення високо! природно! резистенгностi у тварин, !х впливу на функщю печiнки, позитивного впливу на обмш речовин, прискорення росту та збереження поголiв'я.

Матерiал i методи досл1джень

Дослiдження проводили на молодих бiлих лабора-торних щурах-самцях лiнii Вiстар масою 180-200 г, яких утримували у стандартних умовах iнстигутського вiварiю Державного науково-дослвдного контрольного iнституту ветеринарних препаратiв та кормових добавок. Упродовж експерименту шурiв утримували на зба-лансованому рацiонi, який мiстив усi необхвдш компо-ненти. Питну воду тварини отримували без обмежень. Для дослвджень сформовано три групи шурiв по 20 тва-

рин у кожнш. Щурам I i II дослвдних груп для отриман-ня оксидацшного стресу на першу та третю добу дослiджень уводили внутрiшньом'язово 50% тетра-хлорметан у формi олшного розчину (0,25 мл/100 г маси тша) за методикою О.В. Стефанова. Масу тiла шурiв визначали !х щоденним зважуванням, що дозволило чгтко дотримуватися до препарату у вказатй вище дозi протягом усього експерименту. Тварини контрольно! групи отримували ш'екцй аналогичного об'ему фiзiологiчного розчину. Теоретично можливий вплив води на аналзоваш гематологiчнi та бiохiмiчнi показни-ки однаковий у дослiднiй i контрольнш групах. Твари-нам II дослвдно! групи на 1-шу i 3-тю добу дослiджень через годину пиля введення тетрахлоретану додатково уводили лшосомальний препарат (2 мл/кг маси твари-ни). До складу даного препарату входять бутафосфан, штерферон, розторопша iн'eкцiйна та впамши А, Е i D3. Кров для бюх1тчних i гематологiчних дослвджень забирали з яремно! вени на 2, 5, 10 та 14-ту добу експерименту гад слабким ефiрним наркозом. Дослвджували концентращю проте!ну загального, його фракцii, рiвень сечовини, креатинiну та бiлiрубiну загального за методикою Vlizlo (2012).

Усi матпуляци з тваринами проводили ввдповщно до Свропейсько! конвенцii про захист хребетних тварин, як використовуються для експериментальних i науко-вих цiлей (Страсбург, 1986 р.).

Статистичне опрацювання даних проводили iз засто-суванням програми Statistica 6.0 (StatSoft Inc., USA) з визначенням середнього арифметичного (M) та його стандартно! похибки (m). В усiх випадках вiрогiдними вважали вiдмiнностi мiж групами за Р < 0,05 (ANOVA).

Результата та ix обговорення

Важливий показник протеiнсингезувальноi функцц печiнки - рiвень загального проте!ну та його фракций у сироватцi кровi. Вш вщображае змiни, що настають в органiзмi за рiзних патолопчних статв. За оксидацшного стресу у шурiв рiвень альбумiнiв у сироватцi кровi знижу-вався на 70% порiвняно з клiнiчно здоровими тваринами (табл.). Але рiвень загального проте!ну в сироватщ кровi був лише на 10% нижчим: поряд зi зниженням вмiсту альбумшв у сироватцi кровi пдвищився рiвень глобулшово! фракци протешу (на 8,8%). Це викликало альбумiно-глобулiнову диспропорщю у сироватцi кровi хворих тварин. Унаслiдок цього величина коефщента альбумiни/глобулiни склала 0,28 ± 0,03, проти 0,52 ± 0,02 у клЫчно здорових шурiв.

На 5-ту i 10-ту добу дослiджень показники загальних проте!шв i альбумiнiв у I дослвднш групi залишалися низькими. На 14-ту добу у I дослщнш групi показники загальних протешв i альбумiнiв незначно пдвищилися, проте були нижчими вщ показникiв контрольно! групи (вщповщно рiвень загальних протешв на 5%, рiвень

альбумшш - на 24%). Ршень глобулшш перебував у межах контрольних величин. Досить показова величина кое-фщента альбумин/глобулти на 14-ту добу дослджень у I дооддно1 групи (0,41 ± 0,04 проти контролю 0,52 ± 0,02, Р < 0,05). Така величина коефщента, безсумншно, вказуе на пригшчення протешсинтезувальнох функцц печ1нки на даний перюд дослвджень. В умовах оксидац1йного стресу та за да лшосомального препарату у шур1в другго досхпд-но! групи встановлено в1ропдне пiдвишення р1вня загаль-

них протешв та альбумшв, зниження р1вня глобулшв у кров1 шур1в 5- та 10-ту добу дослвджень. На 14-ту добу досладжень за оксидацшного стресу та за да лтосомаль-ного препарату у шур1в II дослвдно1 групи спостертаемо нормалзащю показник1в протешсингезувально1 функцц печшки. У межах нормальних величин перебували показ-ники загальних протеМв, альбумшв, глобулшв i коефщенг альбумiни/глобулiни порiвняно з контрольною групою тварин.

Показники функцюнального стану печшки щурiв за оксидацшного стресу та за лшосомального препарату (M ± m; n = 5)

Таблиця

Достдна Доба дослщжень

2-га 5-та 10-та 14-та

група

К 65,4 ± 1,87

Протеш загальний, г/л Д1 59,6 ± 1,33* 58,2 ± 2,05* 60,8 ± 1,98 62,8 ± 2,13

Д2 58,8 ± 1,76* 62,7 ± 1,09 64,4 ± 0,87 66,2 ± 1,26

К 22,4 ± 1,24

Альбум1ни, г/л Д1 13,1 ± 1,65* 12,9 ± 2,21* 15,2 ± 1,94* 18,1 ± 1,85*

Д2 13,7 ± 1,94* 19,1 ± 1,37 20,9 ± 1,64 22,9 ± 0,89

К 43,1 ± 1,41

Глобулши, г/л Д1 46,5 ± 2,25* 45,3 ± 2,65 45,6 ± 1,87 44,7 ± 2,26

Д2 46,1 ± 1,82* 43,6 ± 2,24 43,5 ± 1,64 43,3 ± 1,75

К 0,52 ± 0,02

Коефiцiент, А/Г Д1 0,28 ± 0,03* 0,31 ± 0,04* 0,33 ± 0,03* 0,41 ± 0,04*

Д2 0,29 ± 0,03* 0,45 ± 0,03* 0,48 ± 0,02 0,53 ± 0,03

Or^e, BcraHoBgeHo no3HrHBHy giro ginocoMagbHoro npenapary Ha opram3M rnypiB, iHTOKCHKOBaHHx rerpaxgop-MeraHOM, ^o npoaBgaerbca b K^Ma^a^! nporeiH-CHHre3yBagbHoi' $yнкцц neniHKH. ToKcnnHa gia rerpaxgop-MeraHy Ha neniHKy cynpoBog^yerbca nopymeHHaM ii' $yнкцioнagbнoгo craHy, ^o xapaKrepn3yerbca nopymeH-hhm npoтelнcннтeзyвagbнol $yHK^i' nenrnKH, HaKonnneH-hhm aMiHorpaHC$epa3 y cupoBar^ KpoBi ga6oparopHHx rBa-puH (Chen et al., 2000; Usha et al., 2007; Saba et al., 2010). 3rigHo 3 grreparypHHMH gaHHMH, nigBH^eHHa aKruBHocri hhx eH3HMiB mcga ypa^eHHa neniHKH ricHo Kopegroe 3i cry-neHeM gecrpyкцц reпaтоцнтiв (Wolf, 1999; Sato et al., 1999; Longo et al., 2007; Morita et al., 2009; Khariv, 2016). OKpeMi нayкoвцi (Wolf 1999; Cherkashina and Petrenko, 2006; Morita et al., 2009) BBa^arorb, ^o noKa3HHKH aKrHBHocri eH3HMiB y cupoBar^ KpoBi He 3aB^gn o6'eKruBHo Bigo6pa®ararb $yнкцioнagbннн i Mop^togorrcHnn craHH neniHKH.

OrpyeHHa тerpaxgopмeraнoм cynpoBog^yerbca nopy-

meHHaM reMonoern^oi $yнкцц KicrKoBoro Mo3Ky rnypiB,

^o xapaKrepH3yerbca 3MiHoro Mop^ogorwHux noKa3HHKiB KpoBi (Calabrese et al., 1999; Weber et al., 2003; Lee et al., 2004; Usha et al., 2007; Saba et al., 2010; Vyshtakaliuk et al., 2015). 3MiHa Mop^ogoriHHux noKa3HHKiB KpoBi ricHo noB'a3aHa 3 nopymeHaM epurponoeruHHoi $yнкцii KicrKoBoro Mo3Ky (Wolf, 1999; Sato et al., 1999; Longo et al., 2007; Morita et al., 2009; Kumarappan et al., 2011). y rBapuH 3a iHroKcuKa^i тerpaxдopмeraнoм Hacrae npnrmHeHHa KpoBorBipHoi $yнкцц KicrKoBoro Mo3Ky. Ha ^ BKa3ye 3MeHmeHHa KigbKocri epnrponnriB ra 3HH®eHHa BMicry reMorgo6iHy y KpoBi. nicga Hboro Hacrae rKaHHHHa rinoKcia, BHacgigoK noro ynoBigbHrororbca oKucHo-BigHoBHi npo^cn ra noripmyerbca o6MiH penoBHH y rKaHHHax opram3My, 3ok-peMa, neniHKH.

Висновки

У рая отруення шур1в тетрахлорметаном у печшщ на-стають глибокi деструкгивш змши клтгинних оболонок гепатоципв та мтгохондр1альних мембран, шо проявля-еться пригшченням протешсинтезувальнох функцц печш-ки. Вiдповiдно р1вень альбумшв у сироватц1 кров1 знижу-еться на 70% пор1вняно з клшчно здоровими шурами, а р1вень загального протешу у сироватц1 кров1 - на 10%. Р1вень глобулшв зростае на 8,8%, шо викликае альбу-м1но-глобулшову диспропорцию у сироватц1 кров1 хворих тварин. Унасgiдок цього величина альбумши/глобулши складае 0,28 ± 0,03 проти 0,52 ± 0,02 у клшчно здорових шур1в. На 14-ту добу доодджень у I доодднш грут кон-центрац1я загальних протеМв i альбумшв знижуеться на 5% та 24% пор1вняно з контрольною групою. Показова величина коефщента альбумiни/глобуgiни на 14-ту добу досл1джень у I досgiдноl групи: 0,41 ± 0,04 проти 0,52 ± 0,02 у контрол (Р < 0,05). Така величина коеф1щента вказуе на пригшчення протеiнсинтезувальноl функцЦ печ1нки на даний перюд дослigжень.

Пig час застосування лiпосомаgьного препарату за оксидац1йного стресу в сироватщ кров1 шур^в настае норматзащя протеiнсинтезуваgьноl функцЦ печiнки: на 14-ту добу вона повертаеться до ф1зюлопчно1 норми за показниками загального протешу, альбумшв та глобул1н1в.

Бiблiографiчнi посилання

Batakov, E.A., 2001. Effect of Silibum marianum oil and lega-lon on lipid peroxidation and liver antioxidant systems rats

intoxicates with carbon tetrachloride. Eksp. Klin. Farmakol. 64, 53-55.

Calabrese, E.J., Leonard, D.A., Zhao, X., Lakshmanan, K., 1999. Role of tissue repair in carbon tetrachloride hepato-toxicity in male and female Sprague-Dawley and Wistar rats. Int. J. Toxicol. 15, 62-69.

Chen, W., Kennedy, D.O., Kojima, A., Matsui-Yuasa, I., 2000. Polyamines and thiols in the cytoprotective effect of L-cys-teine and L-methionine on carbon tetrachloride-induced he-patotoxicity. Amino Acids 18(4), 319-327.

Cherkashina, D.V., Petrenko, A.Y., 2006. Hepatoprotective effect of fetal tissue cytosol and its thermostable fraction in rats with carbon tetrachloride-induced hepatitis. Bull. Exp. Biol. Med. 141(4), 544-547.

Devanto, V., Wu, X., Liu, R.H., 2002. Processed sweet corn has higher antioxidant activity. Agric. Foat. Chem. 50(17), 4959-4964.

Gutyj, B.V., Mursjka, S.D., Hufrij, D.F., Hariv, I.I., Levkivska, N.D., Nazaruk, N.V., Haydyuk, M.B., Priyma, O.B., Bilyk, O.Y., Guta, Z.A., 2016. Vplyv kadmijevogo navantazhennja na systemu antyoksydantnogo zahystu organizmu bugajciv [Influence of cadmium loading on the state of the antioxidant system in the organism of bulls]. Visn. Dnipropetr. Univ. Ser. Biol. Ekol. 24(1), 96-102 (in Ukrainian).

Khariv, M., Gutyj, B., Butsyak, V., Khariv, I. (2016). Gemato-logichni pokaznyky organizmu shhuriv za umov oksydacij-nogo stresu ta za dii' liposomal'nogo preparatu [Hematolog-ical indices of rat organisms under conditions of oxidative stress and liposomal preparation action]. Biological Bulletin of Bogdan Chmelnitskiy Melitopol State Pedagogical University 6(1), 276-289.

Khariv, M.I., 2016. Dynamika aktyvnosti aminotransferaz syro-vatky krovi shhuriv za oksydacijnogo stresu ta dii' liposomal'nogo preparatu [Dynamics of indices of aminotransferase activity in the blood serum of rats under conditions of oxidative stress and effect of liposomal medicinal product]. Visn. Dnipropetr. Univ. Ser. Biol. Med. 7(1), 3-7.

Lee, J.Y., Lee, J.H., Kim, H.J., 2004. The preventive inhibition of chondroitin sulfate against the CCl4-induced oxidative stress of subcellular level. Arch. Pharm. Res. 27(3), 340-345.

Liu, R.H., Finley, J., 2005. Potential cell culture models for antioxidants research. J. Agric. Food Chem. 53(10), 4311-4314.

Longo, V., Chirulli, V., Giovanni Gervasi, P., Pellegrini, M., 2007. Lisosan G, a powder of grain, does not interfer with the drug metabolizing enzymes and has a protective role on carbon tetrachloride-induced hepatotoxicity. Biotechnol. Lett. 29(8), 1155-1159.

Martyshuk, T.V., Gutyj, B.V., Vishchur, O.I., 2016. Riven' produktiv perekysnogo okysnennja lipidiv u krovi shhuriv za umov oksydacijnogo stresu ta za dii' liposomal''nogo preparatu Butaselmevit [Level of lipid peroxidation products in the blood of rats under the influence of oxidative stress and under the action of liposomal preparation of Butaselmevit]. Biological Bulletin of Bogdan Chmelnitskiy Melitopol State Pedagogical University 6(2), 22-27 (in Ukrainian).

Meyers, K.K., Watkins, C.B., Pritts, M.P., Liu, R.H., 2003. Antioxidant and antiproliferative activities of strawberries. Agric. Foat. Chem. 23, 6887-6892.

Morita, M., Akai, S., Hosomi, H., Tsuneyama, K., Nakajima, M., Yokoi, T., 2009. Drug-induced hepatotoxicity test using y-glutamylcysteine synthetase knockdown rat. Toxicol. Lett. 189(2), 159-165.

Rababah, T.M., Ereifei, K.I., Howard, L., 2005. Effect of ascorbic acid and dehydration on concentrations of total phenol-ics, antioxidant capacity, anthocyanins, and color in fruits. J. Agric. Foat. Chem. 53(11), 4444-4447.

Saba, A. B., Oyagbemi, A.A., Azeez, O.I., 2010. Amelioration of carbon tetrachloride-induced hepatotoxicity and haemo-toxicity by aqueous leaf extract of Cnidoscolus aconitifolius in rats. Nig. J. Physiol. Sci. 25, 139-147.

Dai, W., Sato, S., Asano, G., 1999. The protective effect of he-patocyte growth-promoting factor (pHGF) against carbon te-trachloride-induced acute liver injury in rats: An ultrastructural study. J. Nippon Med. Sch. 68(2), 154-164.

Usha, K., Mary Kasturi, G., Hemalatha, P., 2007. Hepatoprotective effect of Hygrophila spinosa and Cassia occidentalis on carbon tetrachloride induced liver damage in experimental rats. Indian J. Clin. Biochem. 22(2), 132-135.

Vlizlo, V.V., Fedoruk, R.S., Ratych, I.B., 2012. Laboratorni metody doslidzhen u biolohiyi, tvarynnytstvi ta veterynarniy medytsyni [Laboratory methods of investigation in biology, stock-breeding and veterinary]. Dovidnyk. (in Ukrainian).

Vyshtakaliuk, A.B., Nazarov, N.G., Porfiriev, A.G., Zueva, I.V., Minnechanova, O.A., Mayatina, O.V., Reznik, V.S., Zobov, V.V., Nicolskyi, E.E., 2015. The influence of the Xymedon preparation (Hydroxyethyldimethyldihydropyrimidine) on the rat liver recovery under toxic damage induced by carbon tetrachloride. Dokl. Biochem. Biophys. 462, 143-146.

Weber, L., Boll, M., Stampfl, A., 2003. Hepatotoxicity and mechanism of action of haloalkanes: Carbon tetrachloride as a toxicological model. Crit. Rev. Toxicol. 33(2), 105-136.

Wolf, P.L., 1999. Biochemical diagnosis of liver disease. Indian J. Clin. Biochem. 14(1), 59-90.

Hadiumna do редкonегlí 26.09.2016