CC BY
515
Для корреспонденции
Балакина Анастасия Станиславовна - аспирант ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» Адрес: 109240, г. Москва, Устьинский проезд, д. 2/14 Телефон: (495) 698-53-65 Е-таИ: [email protected]
A.С. Балакина, Н.В. Трусов, Л.И. Авреньева, Г.В. Гусева, И.В. Аксенов, Л.В. Кравченко,
B.А. Тутельян
Влияние рутина и гесперидина на экспрессию гена Nrf2 и активность гемоксигеназы-1 и NAD(P)H-хиноноксидоредуктазы при их раздельном и совместном действии
ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии», Москва Federal Research Centre of Nutrition, Biotechnology and Food Safety, Moscow
Флавоноиды рутин (Р) и гесперидин (Гес) обладают широким спектром биологической активности, основу которой составляют выраженные антирадикальные свойства и способность повышать активность антиоксидантных ферментов, в том числе активность гемоксигеназы-1 (ГО-1) и МАБ(Р)И-хиноноксидоредуктазы (ХР). Полагают, что главным регулятором активности ГО-1 и ХР является транскрипционный фактор Ыг/2. Целью настоящей работы было изучение влияния Р и Гес на экспрессию гена и белка Ыг/2, на активность и экспрессию мРНК и белка ГО-1 и ХР при их раздельном и совместном действии. Включение в рацион крыс-самцов линии Вистар (с исходной массой тела 180-200 г) в течение 14 дней Р (400 мг на 1 кг массы тела) и Гес (400 мг на 1 кг массы тела) раздельно или совместно не оказывало токсического или проокси-дантного действия, которое оценивали по уровню в печени малонового диальдегида, гидроперекисей липидов, восстановленного и окисленного глутатиона. Р и в меньшей степени Гес вызывали возрастание активности ГО-1 и ХР. Их совместное действие на активность ГО-1 практически не отличалось от раздельного эффекта флавоноидов. Комбинированное действие Р и Гес на активность ХР носило аддитивный характер. По данным вестерн-блоттинга, изменения уровня белка ГО-1, ХР и Ыг/2 при действии Р и Гес раздельно или совместно не являлись статистически значимыми. Результаты полимеразной цепной реакции в режиме реального времени показали наличие небольших, хотя и статистически значимых, изменений уровня экспрессии генов Ыг/2 (Ш/2), ГО-1 (Итох1) и ХР (NQO1) как при раздельном, так и при совместном действии Р и Гес. Таким образом, полученные результаты показали, что высокие дозы Р и Гес раздельно или совместно не оказывают значительного влияния на
Effect of rutin and hesperidin on the expression of Nrf2 gene and the activity of hemoxygenase-1 and NAD(P)H-quinone oxidoreductase at their separate and combined action
A.S. Balakina, N.V. Trusov, L.I. Avreneva, G.V. Guseva, I.V. Aksenov, L.V. Kravchenko, V.A. Tutelyan
экспрессию гена и белка транскрипционного фактора Ыг/2 и что обнаруженное возрастание активности ГО-1 и ХР не связано с усилением экспрессии генов Нтох1 и NQO1.
Ключевые слова:рутин, гесперидин, N7/2, гемоксигеназа-1, хинон-редуктаза
Flavonoids rutin (R) and hesperidin (Hes) have a broad spectrum of the biological activity based on their antiradical properties and ability to increase the activity of antioxidant enzymes, including the activity of heme oxygenase-1 (HO-1) and NAD(P)H-quinone oxidoreductase (QR). It is supposed that the main regulator of the activity of HO-1 and QR is the transcription factor Nrf2. The purpose of the study was to determine the effects of R and Hes on the expression of Nrf2 gene and protein, on the activity and mRNA and protein expression of HO-1 and QR at their separate and combined action. Administration in diet of male Wistar rats (with initial body weight 180-200 g) R (400 mg/kg b.w.) and Hes (400 mg/ kg b.w.) during 14 days separately or in combination had no toxic or pro-oxidant effect, which were assessed by the level of liver MDA, hydroperoxides of lipids, reduced and oxidized glutathione. R and, to a lesser extent, Hes caused increased activity of HO-1 and QR. Their combined effect on the activity of HO-1 did not differ from the separate effect of each flavonoid. The combined action of R and Hes on the activity of QR was additive. According to Western blotting, changes in HO -1, Nrf2 and QR protein levels under the action of R and Hes separately or in combination were not statistically significant. The results of real time PCR demonstrated the presence of small, but statistically significant, changes in the level of expression of the genes Nrf2 (Nrf2), HO-1 (Hmox1) and QR (NQO1) both for separate and combined action of R and Hes. Thus, the obtained results showed that high-dose of R and Hes separately and in combination didn't significantly affect the gene and protein expression of transcription factor Nrf2 and that the increased activity of HO-1 and QR was not associated with the increased expression of Hmox1 and NQO1 genes.
Keywords: rutin, hesperidin, heme oxygenase-1, NAD(P)H-quinone oxidore-ductase
Рутин (Р) и гесперидин (Гес) являются основными представителями двух наиболее изученных подклассов флавоноидов - флавонолов и флаванонов. Они имеют близкую структуру, оба содержат в качестве гликозильного остатка рутинозу (б-О-Ьрамнозил-D-глюкозу), оба в толстой кишке подвергаются последовательному действию бактериальных ферментов -a-L-рамнозидазы и р-глюкозидазы - с образованием агликонов кверцетина и гесперидина, метаболизм которых в энтероцитах осуществляется одними и теми же ферментами - UDP-глюкуронозилтрансферазами и сульфотрансферазами [1, 2]. Р и Гес, как и их агли-коны - кверцетин и гесперидин, обладают широким спектром биологической активности, в основе которой находятся выраженные антиоксидантные свойства [3-5]. В разных модельных системах in vitro Р и Гес проявляют антирадикальную активность, сравнимую или превосходящую активность таких природных антиоксидантов, как витамины Е и С [6]. В то же время в исследованиях in vivo в условиях окислительного стресса разной этиологии было обнаружено, что антиоксидантная активность Р и Гес связана
не только с их антирадикальными свойствами, но и со способностью активировать антиоксидантные ферменты [4, 7-9].
В настоящее время установлено, что главным регулятором активности антиоксидантных ферментов является транскрипционный фактор Nrf2 [10-13]. Он инициирует экспрессию генов, содержащих в промоторной области регуляторный элемент ARE (антиоксидант-респонсив-ный элемент). В цитоплазме клетки Nrf2 связан с репрессивным белком Keapl, который регулирует его уби-квитинирование и деградацию и определяет его низкую базальную экспрессию, достаточную для поддержания внутриклеточного гомеостаза. В условиях окислительного стресса действие оксидантов и электрофилов приводит к модификации (окислению или алкилированию) специфических тиолов цистеина в молекулах Keapl и Nrf2, подавлению убиквитинирования Nrf2, освобождению и транслокации его в ядро, где он связывается с ARE генов-мишеней.
К Nrf2/ARE-регулируемым генам относятся гены большого числа антиоксидантных ферментов и многих ферментов детоксикации (II фазы метаболизма ксенобио-
тиков), в том числе NAD(P)H-хиноноксидоредуктазы (ХР) и гемоксигеназы-1 (ГО-1). ХР и ГО-1 часто относят к ферментам II фазы метаболизма ксенобиотиков, но они имеют важное значение и для антиоксидантной защиты клетки. Так, ХР представляет собой флавопро-теин, который катализирует восстановление широкого спектра эндогенных и экзогенных хинонов, хинониминов и некоторых азотсодержащих соединений, используя в качестве доноров атома водорода NADH или NADPH. Антиоксидантная активность ХР реализуется за счет ингибирования окислительно-восстановительных циклических трансформаций хинонов, что снижает возможность генерации активных форм кислорода (супероксидного аниона и перекиси водорода), и обеднения пула тиолов. Кроме того, ХР участвует в метаболизме двух природных хинонов-антиоксидантов - убихинона (коэнзима Q) (восстанавливая его в активный убихинол) и а-токоферола (восстанавливая его хинон в гидрохинон с высокой антиоксидантной активностью) [10, 14, 15].
ГО-1 является лимитирующим звеном превращения прооксидантного гема в билирубин, оказывающий антирадикальное действие в отношении супероксидных и пероксильных радикалов. Общее свойство индукторов этого фермента - способность вызывать окислительный стресс. Многие авторы отмечают, что активность ГО-1 является одним из самых чувствительных индикаторов клеточного повреждения и индукция ее приводит к усилению антиоксидантной и противовоспалительной функций клетки, тем самым определяя степень способности ее к выживанию [10, 11].
Природными индукторами сигнальной системы №!2/АРЕ являются многие полифенолы и в первую очередь соединения, содержащие -ОН группы в орто-и пара-положении [16]. К их числу относят флавоноиды кверцетин, Гес, а также эпигаллокатехингаллат. Предполагают, что способностью активировать N^2 обладают не сами фенольные индукторы, а высокореактивные продукты их окисления - хиноны, активно взаимодействующие с тиоловыми группами, в том числе с критическими тиолами цистеина Кеар1 [11, 17].
Следует отметить, что в настоящее время происходит интенсивное накопление данных о свойствах и молекулярных механизмах биологической активности отдельных флавоноидов и имеются лишь единичные сведения об их взаимодействии при совместном поступлении в организм. Учитывая близкую структуру, общие пути метаболизма и наличие общих мишеней действия Р и Гес, целью настоящей работы было изучение их влияния на экспрессию гена ЫМ2, на активность ГО-1 и ХР, экспрессию мРНК и белка ГО-1 и ХР при их раздельном и совместном поступлении.
Материал и методы
Исследования проводили на крысах-самцах линии Вистар с исходной массой тела 180-200 г. Крысы были разделены на 4 группы по 8 животных в каждой и со-
держались по 2-3 особи в клетке ("Techniplast", Италия). В работе придерживались нормативов содержания лабораторных животных в соответствии с Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных или в иных научных целях (Страсбург, 1986 г.).
Крысы контрольной группы в течение 14 дней получали стандартный полусинтетический рацион, крысы 1-й опытной группы - тот же рацион с включением Р ("Sigma-Aldrich", США) в количестве 400 мг на 1 кг массы тела, животные 2-й опытной группы получали рацион с включением Гес ("Sigma-Aldrich", США) в том же количестве, крысы 3-й опытной группы - рацион, содержащий Р и Гес в количестве 400 мг каждого на 1 кг массы тела. Животные получали питьевую воду без ограничений и корм ежедневно в одно и то же время в режиме свободного доступа из расчета 15 г сухого корма на крысу. Контроль за поедаемостью корма и состоянием животных проводили ежедневно, контроль массы тела - через день.
В гомогенатах печени определяли содержание малонового диальдегида (МДА) [18], гидроперекисей ли-пидов [19], восстановленного и окисленного глутати-она [20]. В микросомальной и цитозольной фракциях, выделенных из печени, определяли, соответственно, активность ГО-1 [21] и ХР [22].
Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией в режиме реального времени
При подготовке к проведению обратной транскрипции (ОТ) из печени выделяли общую РНК по методу [23] с помощью реагента "TRI Reagent" ("Sigma-Aldrich", США). Концентрацию РНК определяли на спектрофотометре "NanoDrop 1000" ("Thermo Scientific", США).
Для проведения ОТ готовили смесь общим объемом 25 мкл, состоящую из 5 мкл 5-кратного буфера для M-MuLV обратной транскриптазы («СибЭнзим», РФ), 5 мкл смеси дезоксинуклеотид-трифосфатов (2,5 мМ каждый) («СибЭнзим», РФ), 4 мкл 83 мкМ oligo(dT)-праймера («Литех», РФ), 4,57 мкл DEPC-воды ("Thermo Scientific", США), 0,63 мкл (25Е) ингибитора РНКаз RiboLock ("Thermo Scientific", США), 0,8 мкл (160Е) M-MuLV обратной транскриптазы («СибЭнзим», РФ) и 5 мкл РНК (0,4 мкг/мкл). Реакцию ОТ проводили на приборе "CFX 96" ("Bio-Rad", США) при 37 °С в течение 1 ч. Полученную в реакции ОТ комплементарную ДНК (кДНК) использовали для оценки экспрессии генов ХР (NQO1), ГО-1 (Hmoxl), Nrf2 (Nrf2) и ß-актина (Actb) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени. Реакционная смесь для ПЦР общим объемом 25 мкл содержала 12,5 мкл 2-кратного iQ SYBR Green Supermix ("Bio-Rad", США) (100 мМ KCl, 40 мМ Трис-HCl pH 8,4, 0,4 мМ дезоксинуклеотид-трифосфаты, 50 ед/мл iTaq ДНК-полимераза, 6 мМ MgCl2, интеркали-рующий краситель SYBR Green I, 20 нМ флюоресцеин и стабилизаторы), по 2,5 мкл прямого и обратного прай-меров к исследуемому гену (концентрация праймеров
1 ОЕ/мл) («Литех», РФ), 5 мкл воды без нуклеаз ("Thermo Scientific", США) и 2,5 мкл кДНК в разведении 1:10. Последовательность праймеров представлена в табл. 1.
Амплификацию проводили на приборе «CFX 96» ("BioRad", США). Реакцию ПЦР для всех изучаемых генов проводили по следующей схеме: активация iTaq ДНК-полимеразы при 95 °С в течение 3 мин; 40 циклов, каждый из которых состоял из денатурации при 95 °С в течение 15 с для Actb и Nrf2; 20 с - NQO1 и 5 с - Hmoxl, отжига праймеров (58 °С, 15 с для Actb; 58 °С, 20 с - Nrf2; 60 °С, 30 с - NQO1 и Hmoxl) и синтеза продукта при 72 °С в течение 45 с - для Actb, 27 с - Nrf2; 30 с - NQO1 и 10 с - Hmoxl; после окончания циклов проводили контроль специфичности праймеров с помощью анализа кривой плавления (melt curve) в диапазоне 50-95 °С (шаг 0,5 °С по 10 с каждый).
Уровни экспрессии изучаемых генов нормализовали относительно уровня экспрессии гена сравнения ß-актина (Actb) и рассчитывали по значению порогового цикла (Ct - cycle threshold) с использованием программы "Relative expression software tool" (REST) v.2.0.13 ("Qiagen", Германия). Данные представляли как средние значения (n=6), амплификацию для каждого значения проводили в трех повторах.
Вестерн-блоттинг
Субклеточное фракционирование проводили по стандартному методу. Ткань гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе Поттера-Эльвейма с тефлоновым пестиком в троекратном объеме раствора 0,25 М сахарозы и 0,001 М ЭДТА, pH 7,2-7,4, при 1200 об/мин в течение 90 с. Для освобождения от неразрушившихся клеток гомогенат центрифугировали при 100g в течение 5 мин. Полученную надосадочную фракцию центрифугировали при 1000g в течение 10 мин. Осадок дважды ресуспендировали в троекратном объеме буфера и центрифугировали при 600g в течение 10 мин. Объединенные надосадочные фракции после каждого центрифугирования составили цитоплазматическую фракцию. Ядерную фракцию получали путем ресуспен-дирования осадка в 4-кратном объеме буфера при 900 об/мин в течение 60 с. Полученные фракции хранили при -20 °С.
В цитоплазматической фракции определяли уровень белков ГО-1, ХР, Nrf2, в ядерной - уровень белка Nrf2. Общее содержание белка в пробах определяли по методу Брэдфорда с использованием коммерческого реагента согласно инструкции производителя ("Sigma-Aldrich", США). Образцы ядерной и цитоплазматической фракции, содержащие соответственно по 10 и 20 мкг белка, подвергали электрофоретическому разделению в 10% полиакриламидном геле при 200В в течение 50 мин ("Mini-Protean Tetra Cell", "Bio-Rad", США) с последующим переносом на поливинилидендифторидную (PVDF) мембрану при 20В в течение 30 мин ("Trans-Blot SD Cell", "Bio-Rad", США). Мембраны инкубировали в 5% растворе обезжиренного сухого молока («Bio-Rad»,
Таблица 1. Последовательности праймеров
Ген Нуклеотидная последовательность праймеров
Actb F CgTTgACATCCgTAAAgACCTC R TAggAgCCAgggCAgTAATCT
Nrf2 F GACCTAAAgCACAgCCAACACAT R CTCAATCggCTTgAATgTTTgTC
NQO1 F gTgAgAAgAgCCCTgATTgT R CCTgTgATgTCgTTTCTggA
Hmoxl F ACCCCACCAAgTTCAAACAg R gAgCAggAAggCggTCTTAg
США) в TBST буфере ("Bio-Rad", США) в течение 50 мин при комнатной температуре, затем оставляли на ночь при 4 °С в растворе соответствующих антител в TBST буфере [разведение Nrf2 ("Santa Cruz Biotechology", США) - 1:100, SP-1 ("Sigma-Aldrich", США) - 1:250, ГО-1 ("Sigma-Aldrich", США) - 1:100, ХР ("Sigma-Aldrich", США) -1:400, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (ГАФДГ) ("Sigma-Aldrich", США) - 1:10000, актина ("Sigma-Aldrich", США) - 1:250]. После 5-кратного промывания в TBST буфере мембраны обрабатывали раствором IgG-HRP ("Bio-Rad", США) (разведение 1:3000) и Streptactin-HRP ("Bio-Rad", США) (разведение 1:20 000) в TBST буфере в течение 45 мин при комнатной температуре. После 6-кратного промывания в TBST буфере мембраны обрабатывали в течение 5 мин смесью субстратов "Immun-Star HRP" ("Bio-Rad", США) и далее оценивали интенсивность хемилюминесценции на системе гель-документирования "ChemiDoc XRS" ("Bio-Rad", США) с помощью программы Quantity One ("Bio-Rad", США). При этом уровни экспрессии белков Nrf2, ГО-1 и ХР нормализовали относительно уровня экспрессии белков сравнения: актина, ГАФДГ и SP-1. Данные представили в виде средних значений из трех независимых определений.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы IBM SPSS Statistics Ver. 20 ("SPSS Inc.", США). Данные представляли в виде среднего арифметического (M) и стандартной ошибки среднего (m): M±m. Для выявления статистически значимых (р<0,05) различий между группами применяли одно-факторный дисперсионный анализ с использованием в качестве апостериорного критерия LSD-теста.
Результаты и обсуждение
Включение в рацион Р и Гес как по отдельности, так и совместно не оказывало какого-либо влияния на общее состояние животных, массу тела и относительную массу печени. C целью выявления возможного прооксидантного действия Р и Гес, точнее продуктов их окисления, в печени крыс определяли содержание некоторых маркеров окислительного стресса. Полученные результаты показали, что индивидуальное или совмест-
Таблица 2. Влияние рутина и гесперидина на маркеры окислительного стресса при их раздельном и совместном действии
Показатель Группа животных, рацион
контрольная, базальный 1-я опытная, +Р 2-я опытная, +Гес 3-я опытная, +Р +Гес
МДА, нмоль/г ткани 64,5±3,8 72,1 ±2,0 65,0±5,6 77,1 ±5,3
Гидроперекиси липидов, мкмоль/г ткани 0,32±0,01 0,35±0,00 0,33±0,01 0,32±0,02
Глутатион восстановленный, мкмоль/г ткани 4,10±0,10 4,41 ±0,22 4,18±0,14 3,75±0,30
Глутатион окисленный, мкмоль/г ткани 0,58±0,02 0,58±0,02 0,62±0,02 0,56±0,03
Глутатион восстановленный/окисленный 7,07±0,24 7,66±0,48 6,82±0,36 6,77±0,55
Таблица 3. Влияние рутина и гесперидина на активность гемоксигеназы-1 и М0(Р)Н-хиноноксидоредуктазы при их раздельном и совместном действии
Показатель Группа животных, рацион
контрольная, базальный 1-я опытная, +Р 2-я опытная, +Гес 3-я опытная, + Р +Гес
ГО-1, мкмоль/минхмг белка 7,36±0,23a 9,45±0,60ь 9^0^, ь 8,57±0^, ь
ХР, мкмоль/минхмг белка 0^0^ 0,29±0,04ь 0,23±0^, ь 0,32±0,05ь
П р и м е ч а н и е. Различия между значениями, обозначенными a, Ь, статистически значимы (р<0,05).
ное воздействие Р и Гес не приводило к достоверным изменениям уровня МДА, гидроперекисей липидов, количества восстановленного и окисленного глутатиона и их соотношения (табл. 2).
У крыс, получавших рацион с Р или с Гес, обнаруживали умеренное возрастание активности ГО-1 - на 28% (р<0,05) и на 24% (р>0,05) соответственно (табл. 3). У животных 3-й опытной группы, получавших Р вместе с Гес, активность ГО-1 превышала контрольный уровень на 16% (р>0,05) и была ниже активности фермента у крыс 1-й и 2-й опытных групп. Р (1-я опытная группа) вызывал увеличение активности ХР на 61% (р<0,05), а Гес (2-я опытная группа) - на 28% (р>0,05). При совместном воздействии Р и Гес (3-я опытная группа) активность ХР возрастала на 78% (р<0,05) от контроля, что превышало активность фермента у крыс 1-й (на 10%) и 2-й опытных групп (на 39%).
Результаты вестерн-блот-анализа показали, что уровень белка ГО-1 в печени увеличивался в равной степени (в 1,5 раза) при введении Р или Гес в рацион, и более чем в 2 раза при их совместном введении (рис. 1). Содержание белка ХР также возрастало при действии Р (на 57%), но не изменялось существенно относительно контроля у крыс, получавших с рационом Гес или Гес вместе с Р (рис. 2).
Не обнаружено каких-либо различий между группами в уровне белка N^2 в ядерной фракции печени крыс (рис. 3а). В то же время во фракции цитозо-ля отмечалось умеренное возрастание содержания белка N^2: у крыс, получавших Р, на 32%, у получавших Гес - на 40% и у получавших Р и Гес - на 46% (рис. 3б). Во всех случаях изменения уровня белка N^2 и изученных ферментов оставались статистически недостоверными.
2 I
СО ^
250200 150 100 500
Р Гес Р + Гес
К
Р
Гес Р + Гес
Рис. 1. Вестерн-блот-анализ белка гемоксигеназы-1 и содержание белка гемоксигеназы-1 в печени крыс при раздельном и совместном действии рутина и гесперидина
ХР Актин
250
200
150
100-
50
I
К
Р
Гес
Р + Гес
Рис. 2. Вестерн-блот-анализ белка М0(Р)Н-хиноноксидо-редуктазы и содержание белка М0(Р)Н-хиноноксидоредук-тазы в печени крыс при раздельном и совместном действии рутина и гесперидина
К
К
Р
Гес Р + Гес
0
Nrf2 —»-1— SP-1
К Р Гес Р + Гес
250-^ 2001 I 150
5 ё ^ * 100-
=с о
ф
CÜ -.о
Si ° 50>
0
I
Гес
Р + Гес
Nrf2 ГАФДГ
250-1
с' 2002 || 150-
J ¡
Í 5 100-
е
g *
> 500-
К Р Гес Р + Гес
Р б
Гес Р + Гес
Рис. 3. Вестерн-блот-анализ белка \lrf2 и содержание белка \lrf2 в ядерной (а) и цитозольной (б) фракциях печени крыс при раздельном и совместном действии рутина и гесперидина
200
150
100-
50
*+
I
Р Гес Р + Гес Hmoxl
I
+
I
К Р Гес Р + Гес NQO1
Р Гес Р + Гес Nrf2
Рис. 4. Влияние рутина и гесперидина на экспрессию матричной рибонуклеиновой кислоты Hmoxl, NQO1 и Nrf2 при их раздельном и сочетанном поступлении
* - статистически значимое различие (р<0,05) по сравнению с контрольной группой; + - статистически значимое различие (р<0,05) по сравнению с 1-й опытной группой.
К
Р
К
*
*
*
А
0
К
По данным ПЦР, содержание мРНК Hmoxl в печени крыс, получавших рацион с Р, возрастало на 35% и практически не отличалось от контрольного уровня у крыс, получавших рацион с Гес (рис. 4). Несмотря на возрастание количества белка ГО-1 при совместном включении в рацион Р и Гес, экспрессия мРНК Hmoxl снижалась на 26% относительно контроля и на 45% относительно уровня в печени крыс, получавших только Р (рис. 4). Содержание мРНК NQO1 в печени уменьшалось значительно - на 36% относительно контроля при включении в рацион Р, но не отличалось существенно от контрольного уровня у крыс, получавших Гес или совместно Р с Гес (см. рис. 4). Как Р, так и Гес снижали незначительно, хотя и достоверно, уровень мРНК Nrf2 в печени соответственно на 27 и 20%. При совместном действии Р и Гес уровень экспрессии мРНК Nrf2 не отличался от контрольного и был достоверно выше уровня у крыс, получавших только Р (см. рис. 4).
Таким образом, проведенные исследования показали, что даже в больших дозах Р и Гес не оказывают токси-
ческого или прооксидантного действия на крыс, что подтверждает наши предыдущие данные и данные других авторов [24-26]. При этом Р и в меньшей степени Гес вызывали возрастание активности ГО-1 и ХР. Способность Р и кверцетина индуцировать активность ГО-1 у здоровых интактных крыс показана лишь в единичных исследованиях. Так, дозозависимое возрастание активности ГО-1 обнаруживали у крыс, получавших с рационом Р в дозе 40 и 400 мг на 1 кг массы тела [24]. Длительное введение крысам кверцетина в количестве 100 мг/кг массы тела вызывало избирательное увеличение более чем в 2 раза активности ГО-1 в печени [27]. В то же время в ряде исследований, проведенных как in vivo, так и in vitro с использованием разных линий клеток, показано, что в условиях окислительного стресса антиоксидан-тное и противовоспалительное действие Р и кверцетина связано непосредственно с их способностью индуцировать активность ГО-1 [8, 28, 29].
Результаты изучения молекулярных механизмов индуцирующего действия кверцетина на активность ГО-1,
полученные в исследованиях in vitro, свидетельствуют о том, что оно опосредовано главным образом активирующим влиянием кверцетина на транскрипционный фактор Nrf2. Так, в клетках нормальной печени человека L02 при индуцированном окислительном стрессе разной этиологии наблюдали усиление транслокации Nrf2 в ядро наряду с усилением экспрессии гена Hmox1 [30]. Аналогично, в клетках злокачественной мезоте-лиомы кверцетин индуцировал экспрессию белка Nrf2 и гена Nrf2, усиливал его транслокацию в ядро, что сопровождалось индукцией экспрессии мРНК Hmox1 и белка ГО-1 [31].
Индуцирующее действие Р (400 мг на 1 кг массы тела) на активность ХР при его включении в рацион крыс было обнаружено и в наших предыдущих исследованиях [25]. Способность кверцетина индуцировать активность, экспрессию белка ХР и мРНК NQO1 также показана in vitro на культурах клеток MCF-7 и HepG2 [15, 32]. В этих же экспериментах in vitro получены доказательства связи индуцированной кверцетином активации ХР с усилением экспрессии гена и белка Nrf2.
В отличие от результатов, полученных in vitro, в настоящей работе не выявлена зависимость индуцирующего действия Р на активность ГО-1 и ХР от его влияния на фактор Nrf2 как на уровне экспрессии мРНК Nrf2, так и на уровне экспрессии белка Nrf2 в цитоплазме и ядерной фракции.
Значительно менее изученным остается влияние Гес на активность Nrf2 и Nrf2-регулируемых ферментов. В исследовании у старых крыс со сниженными (по сравнению с молодыми) показателями антиоксидантного статуса введение Гес в дозе 100 мг на 1 кг массы тела в течение 90 дней восстанавливало уровень активности антиоксидантных ферментов миокарда до уровня у молодых крыс, что сопровождалось усилением экспрессии мРНК Nrf2 и белка Nrf2 [33]. При этом Гес не оказывал какого-либо влияния на изученные показатели у молодых крыс.
Наличие связи между индуцирующим действием Гес на активность ГО-1 и Nrf2 показано в двух работах, про-
Сведения об авторах
веденных на клетках нормальной печени человека L02 [34, 35]. В клетках, подвергавшихся действию Н2О2 или трет-бутил гидропероксида, Гес усиливал транслокацию Nrf2 в ядро и индуцировал активность ГО-1 и экспрессию мРНК Hmox1 и ферментного белка.
В отличие от данных, полученных на клеточных культурах, в наших исследованиях у крыс, получавших Гес в течение 2 нед, выявлено небольшое недостоверное возрастание активности ГО-1 и ХР при отсутствии существенного изменения экспрессии их генов и экспрессии гена и белка Nrf2.
Данные о комбинированном действии Р и Гес на активность ГО-1 и ХР и других антиоксидантных ферментов, так же как и сведения о взаимном влиянии этих флавоноидов на их биодоступность и метаболизм в организме, фактически отсутствуют. Полученные нами результаты показали, что совместное действие Р и Гес приводит к небольшому уменьшению индивидуальных эффектов Р и Гес на активность ГО-1 и экспрессию гена Hmox1. В отличие от ГО-1 активность ХР при совместном поступлении Р и Гес превышала активность фермента у крыс, получавших только Р или Гес, что можно оценить как аддитивность их эффектов. Это взаимодействие, однако, не прослеживалось на уровне экспрессии мРНК NQO1 и белка ХР.
Таким образом, можно заключить, что in vivo Р и Гес в высоких дозах как при раздельном, так и при совместном включении в рацион крыс не проявляли прооксидан-тную активность и не оказывали значительного влияния на экспрессию гена и белка транскрипционного фактора Nrf2 и обнаруженное при этом возрастание активности ГО-1 и ХР не связано с усилением экспрессии генов Hmox1 и NQO1. Эти результаты значительно отличаются от данных, полученных in vitro. Можно предположить, что, наряду с различиями в действующих концентрациях in vitro и in vivo, важную роль играет тот факт, что, попадая в организм, Р и Гес быстро метаболизируются и в крови выявляют почти исключительно их метаболиты: кверцетин и гесперитин [1, 36, 37], биологическая активность которых не изучена.
ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва): Балакина Анастасия Станиславовна - аспирант Е-таИ: [email protected]
Трусов Никита Вячеславович - научный сотрудник лаборатории энзимологии питания Е-тшИ: [email protected]
Авреньева Людмила Ивановна - кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории энзимо-
логии питания
Е-тшИ: [email protected]
Гусева Галина Владимировна - кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории энзимологии питания
Е-тшИ: [email protected]
Аксенов Илья Владимирович - кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории энзимологии питания
Е-тшИ: [email protected]
Кравченко Лидия Васильевна - кандидат медицинских наук, ведущий научный сотрудник лаборатории энзимологии питания
E-mail: [email protected]
Тутельян Виктор Александрович - академик РАН, доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией энзимологии питания, научный руководитель E-mail: [email protected]
Литература
1. Тутельян В.А., Лашнева Н.В. Биологически активные вещества 18. растительного происхождения. Флаваноны: пищевые источники, биодоступность, влияние на ферменты метаболизма ксенобиотиков // Вопр. питания. 2011. Т. 80, № 5. С. 4-23. 19.
2. Amaretti A., Raimondi S., Leonardi A. et al. Hydrolysis of the rutinose-conjugates flavonoids rutin and hesperidin by the gut microbiota and bifidobacteria // Nutrients. 2015. Vol. 7, N 4. P. 2788-2800.
3. Chua L.S. A review on plant-based rutin extraction methods and its 20. pharmacological activities // J. Ethnopharmacol. 2013. Vol. 150, N 3.
P. 805-817.
4. Parhiz H., Roohbakhsh A., Soltani F. et al. Antioxidant and anti- 21. inflammatory properties of the citrus flavonoids hesperidin and hesperetin: an updated review of their molecular mechanisms
and experimental models // Phytother. Res. 2015. Vol. 29, N 3. 22. P. 323-331.
5. Roohbakhsh A., Parhiz H., Soltani F. et al. Molecular mechanisms behind the biological effects of hesperidin and hesperetin for the prevention of cancer and cardiovascular diseases // Life Sci. 2015. 23. Vol. 124. P. 64-74.
6. Yang J., Guo J., Yuan J. In vitro antioxidant properties of rutin // LWT Food Sci. Technol. 2008. Vol. 41. P. 1060-1066. 24.
7. Kamel K.M., Abd El-Raouf O.M., Metwally S.A. et al. Hesperidin and rutin, antioxidant citrus flavonoids, attenuate cisplatin-induced nephrotoxicity in rats // J. Biochem. Mol. Toxicol. 2014. Vol. 28, N 7. 25. P. 312-319.
8. Liu S., Hou W., Yao P. et al. Heme oxygenase-1 mediates the protective role of quercetin against ethanol-induced rat hepatocytes oxidative damage // Toxicol. In Vitro. 2012. Vol. 26, N 1. P 74-80. 26.
9. Wang J., Zhu H., Yang Z., Liu Z. Antioxidative effects of hesperetin against lead acetate-induced oxidative stress in rats // Indian J. Pharmacol. 2013. Vol. 45, N 4. P. 395-398.
10. Ляхович В.В., Вавилин В.А., Зенков Н.К., Меньщикова Е.Б. Активная защита при окислительном стрессе. Антиоксидант - респон- 27. сивный элемент // Биохимия. 2006. Т. 71, № 9. С. 1183-1197.
11. Турпаев К.Т. Сигнальная система Механизм регуляции и значение для защиты клеток от токсического действия ксенобиотиков и электрофильных соединений // Биохимия. 28. 2013. Т. 78, №. 2. С. 147-166.
12. Kobayashi A., Kang M.I., Watai Y. et al. Oxidative and electrophilic stresses activate Nrf2 through inhibition of ubiquitination activity
of Keap1 // Mol. Cell Biol. 2006. Vol. 26, N 1. P. 221-229. 29.
13. Ma Q., He X. Molecular basis of electrophilic and oxidative defense: promises and perils of Nrf2 // Pharmacol. Rev. 2012. Vol. 64, N 4.
P. 1055-1081. 30.
14. Dinkova-Kostova A.T., Talalay P. NAD(P)H:quinone acceptor oxidoreductase 1 (NQO1), a multifunctional antioxidant enzyme and exceptionally versatile cytoprotector // Arch. Biochem. Biophys. 2010. Vol. 501, N 1. P. 116-123. 31.
15. Tanigawa S., Fujii M., Hou D.X. Action of Nrf2 and Keap1 in ARE-mediated NQO1 expression by quercetin // Free Radic. Biol. Med. 2007. Vol. 42, N 11. P. 1690-1703. 32.
16. Dinkova-Kostova A.T., Wang X.J. Induction of the Keap1/Nrf2/ARE pathway by oxidizable diphenols // Chem. Biol. Interact. 2011. Vol. 192, N 1-2. P. 101-106.
17. Lemmens K.J., Vrolijk M.F., Bouwman F.G. et al. The minor 33. structural difference between the antioxidants quercetin and 4'O-methylquercetin has a major impact on their selective thiol toxicity //
Int. J. Mol. Sci. 2014. Vol. 15, N 5. P. 7475-7484.
Ohkawa H., Ohishi N., Yagi K. Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction // Anal. Biochem. 1979. Vol. 95, N 2. P. 351-358.
Hermes-Lima M., Willmore W.G., Storey K.B. Quantification of lipid peroxidation in tissue extracts based on Fe(III)xylenol orange complex formation // Free Radic. Biol. Med. 1995. Vol. 19, N 3. P. 271-280.
Anderson M.E. Determination of glutathione and glutathione disulfide in biological samples // Methods Enzymol. 1985. Vol. 113. P. 548-555.
McNally S.J., Ross J.A., James Garden O., Wigmore S.J. Optimization of the paired enzyme assay for heme oxygenase activity // Anal. Biochem. 2004. Vol. 332, N 2. P. 398-400. Benson A.M., Hunkeler M.J., Talalay P. Increase of NAD(P)H:quinone reductase by dietary antioxidants: possible role in protection against carcinogenesis and toxicity // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1980. Vol. 77, N 9. P. 5216-5220.
Chomczynski P., Sacchi N. Single-step of RNA isolation by aced guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Anal. Biochem. 1987. Vol. 162. P. 156-159.
Кравченко Л.В., Авреньева Л.И., Аксенов И.В и др. Изучение влияния рутина на защитный потенциал крыс // Вопр. питания. 2015. Т. 84, № 3. С. 22-30.
Ускова М.А., Кравченко Л.В., Авреньева Л.И., Тутельян В.А. Влияние пробиотика Lactobacillus casei 114001 на биологическую активность рутина // Бюл. экспер. биол. 2010. Т. 149, № 5. С. 510-515.
Wiegand H., Boesch-Saadatmandi C., Regos I. et al. Effects of quercetin and catechin on hepatic glutathione-S transferase (GST), NAD(P)H quinone oxidoreductase 1 (NQO1), and antioxidant enzyme activity levels in rats // Nutr. Cancer. 2009. Vol. 61, N 5. P. 717-722.
Tang Y., Tian H., Shi Y. et al. Quercetin suppressed CYP2E1-dependent ethanol hepatotoxicity via depleting heme pool and releasing CO // Phytomedicine. 2013. Vol. 20, N 8-9. P. 699704.
Liu C.M., Ma J.Q., Xie W.R. et al. Quercetin protects mouse liver against nickel-induced DNA methylation and inflammation associated with the Nrf2/HO-1 and p38/STAT1/NF-KB pathway // Food Chem. Toxicol. 2015. Vol. 82. P. 19-26. Pan P.H., Lin S.Y., Wang Y.Y. et al. Protective effects of rutin on liver injury induced by biliary obstruction in rats // Free Radic. Biol. Med. 2014. Vol. 73. P. 106-116.
Ji L.L., Sheng Y.C., Zheng Z.Y. et al. The involvement of p62-Keap1-Nrf2 antioxidative signaling pathway and JNK in the protection of natural flavonoid quercetin against hepatotoxicity // Free Radic. Biol. Med. 2015. Vol. 85. P. 12-23.
Lee Y.J., Lee D.M., Lee S.H. Nrf2 expression and apoptosis in quercetin-treated malignant mesothelioma cells // Mol. Cells. 2015. Vol. 38, N 5. P. 416-425.
Valerio L.G. Jr, Kepa J.K., Pickwell G.V., Quattrochi L.C. Induction of human NAD(P)H:quinone oxidoreductase (NQO1) gene expression by the flavonol quercetin // Toxicol. Lett. 2001. Vol. 119, N 1. P. 49-57.
Elavarasan J., Velusamy P., Ganesan T. et al. Hesperidin-mediated expression of Nrf2 and upregulation of antioxidant status in senescent rat heart // J. Pharm. Pharmacol. 2012. Vol. 64, N 10. P. 1472-1482.
34. Chen M., Gu H., Ye Y. et al. Protective effects of hesperidin against oxidative stress of tert-butyl hydroperoxide in human hepatocytes // Food Chem. Toxicol. 2010. Vol. 48, N 10. P. 2980-2987.
35. Chen M.C., Ye Y.Y., Ji G., Liu J.W. Hesperidin upregulates heme oxygen-ase-1 to attenuate hydrogen peroxide-induced cell damage in hepatic L02 cells // J. Agric. Food Chem. 2010. Vol. 58, N 6. P. 3330-3335.
36. Manach C., Morand C., Demignt C. et al. Bioavailability of rutin and quercetin in rats // FEBS Lett. 1997. Vol. 409. P. 12-16.
37. Matsumoto H., Ikoma Y., Sugiura M. et al. Identification and quantification of the conjugated metabolites derived from orally administered hesperidin in rat plasma // J. Agric. Food Chem. 2004. Vol. 52, N 21. P. 6653-6659.
References
1. Tutelyan V.A., Lashneva N.V. Biological active substances of plant origin. Flavanones: dietary sources, biovailability, the influence on xenobiotic metabolizing enzymes. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2011; Vol. 80 (5): 4-23. (in Russian).
2. Amaretti A., Raimondi S., Leonardi A., et al. Hydrolysis of the rutin-ose-conjugates flavonoids rutin and hesperidin by the gut microbiota and bifidobacteria. Nutrients. 2015; Vol. 7 (4): 2788-800.
3. Chua L.S. A review on plant-based rutin extraction methods and its pharmacological activities. J Ethnopharmacol. 2013; Vol. 150 (3): 805-17.
4. Parhiz H., Roohbakhsh A., Soltani F., et al. Antioxidant and anti-inflammatory properties of the citrus flavonoids hesperidin and hesperetin: an updated review of their molecular mechanisms and experimental models. Phytother Res. 2015; Vol. 29 (3): 323-31.
5. Roohbakhsh A., Parhiz H., Soltani F., et al. Molecular mechanisms behind the biological effects of hesperidin and hesperetin for the prevention of cancer and cardiovascular diseases. Life Sci. 2015; Vol. 124: 64-74.
6. Yang J., Guo J., Yuan J. In vitro antioxidant properties of rutin. LWT Food Sci Technol. 2008; Vol. 41: 1060-6.
7. Kamel K.M., Abd El-Raouf O.M., Metwally S.A., et al. Hesperidin and rutin, antioxidant citrus flavonoids, attenuate cisplatin-induced nephrotoxicity in rats. J Biochem Mol Toxicol. 2014; Vol. 28 (7): 312-9.
8. Liu S., Hou W., Yao P., et al. Heme oxygenase-1 mediates the protective role of quercetin against ethanol-induced rat hepatocytes oxida-tive damage. Toxicol In Vitro. 2012; Vol. 26 (1): 74-80.
9. Wang J., Zhu H., Yang Z., Liu Z. Antioxidative effects of hesperetin against lead acetate-induced oxidative stress in rats. Indian J Pharmacol. 2013; Vol. 45 (4): 395-8.
10. Lyakhovich V.V., Vavilin V.A., Zenkov N.K., Menshchikova E.B. Active defense under oxidative stress. The antioxidant responsive element. Biokhimiia [Biochemistry]. 2006; Vol. 71 (9): 962-74. (in Russian)
11. Turpaev K.T. Keap1-Nrf2 signaling pathway: mechanisms of regulation and role in protection of cells against toxicity caused by xenobi-otics and electrophiles. Biokhimiia [Biochemistry]. 2013; Vol. 78 (2): 147-66. (in Russian)
12. Kobayashi A., Kang M.I., Watai Y., et al. Oxidative and electrophilic stresses activate Nrf2 through inhibition of ubiquitination activity of Keap1. Mol Cell Biol. 2006; Vol. 26 (1): 221-9.
13. Ma Q., He X. Molecular basis of electrophilic and oxidative defense: promises and perils of Nrf2. Pharmacol Rev. 2012; Vol. 64 (4): 1055-81.
14. Dinkova-Kostova A.T., Talalay P. NAD(P)H:quinone acceptor oxi-doreductase 1 (NQO1), a multifunctional antioxidant enzyme and exceptionally versatile cytoprotector. Arch Biochem Biophys. 2010; Vol. 501 (1): 116-23.
15. Tanigawa S., Fujii M., Hou D.X. Action of Nrf2 and Keap1 in ARE-mediated NQO1 expression by quercetin. Free Radic Biol Med. 2007; Vol. 42 (11): 1690-703.
16. Dinkova-Kostova A.T., Wang X.J. Induction of the Keap1/Nrf2/ARE pathway by oxidizable diphenols. Chem Biol Interact. 2011; Vol. 192 (1-2): 101-6.
17. Lemmens K.J., Vrolijk M.F., Bouwman F.G., et al. The minor structural difference between the antioxidants quercetin and 4'O-meth-ylquercetin has a major impact on their selective thiol toxicity. Int J Mol Sci. 2014; Vol. 15 (5): 7475-84.
18. Ohkawa H., Ohishi N., Yagi K. Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction. Anal Biochem. 1979; Vol. 95 (2): 351-8.
19. Hermes-Lima M., Willmore W.G., Storey K.B. Quantification of lipid peroxidation in tissue extracts based on Fe(III)xylenol orange complex formation. Free Radic Biol Med. 1995; Vol. 19 (3): 271-80.
20. Anderson M.E. Determination of glutathione and glutathione disulfide in biological samples. Methods Enzymol. 1985; Vol. 113: 548-55.
21. McNally S.J., Ross J.A., James Garden O., Wigmore S.J. Optimization of the paired enzyme assay for heme oxygenase activity. Anal Biochem. 2004; Vol. 332 (2): 398-400.
22. Benson A.M., Hunkeler M.J., Talalay P. Increase of NAD(P)H:quinone reductase by dietary antioxidants: possible role in protection against carcinogenesis and toxicity. Proc Natl Acad Sci USA. 1980; Vol. 77 (9): 5216-20.
23. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step of RNA isolation by aced gua-nidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 1987; Vol. 162: 156-9.
24. Kravchenko L.V., Avreneva L.I., Aksenov I.V., et al. Effects of rutin on protective capacity in rats. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2015; Vol. 84 (3): 22-30. (in Russian)
25. Uskova M.A., Kravchenko L.V., Avrenjeva L.I., Tutelyan V.A. Effect of Lactobacillus casei 114001 probiotic on bioactivity of rutin. Bull. Exp. Biol. Med. 2010; Vol. 149 (5): 578-82. (in Russian)
26. Wiegand H., Boesch-Saadatmandi C., Regos I., et al. Effects of quercetin and catechin on hepatic glutathione-S transferase (GST), NAD(P)H quinone oxidoreductase 1 (NQO1), and antioxidant enzyme activity levels in rats. Nutr Cancer. 2009; Vol. 61 (5): 717-22.
27. Tang Y., Tian H., Shi Y., et al. Quercetin suppressed CYP2E1-depen-dent ethanol hepatotoxicity via depleting heme pool and releasing CO. Phytomedicine. 2013; Vol. 20 (8-9): 699-704.
28. Liu C.M., Ma J.Q., Xie W.R., et al. Quercetin protects mouse liver against nickel-induced DNA methylation and inflammation associated with the Nrf2/HO-1 and p38/STAT1/NF-KB pathway. Food Chem Toxicol. 2015; Vol. 82: 19-26.
29. Pan P.H., Lin S.Y., Wang Y.Y., et al. Protective effects of rutin on liver injury induced by biliary obstruction in rats. Free Radic Biol Med. 2014; Vol. 73: 106-16.
30. Ji L.L., Sheng Y.C., Zheng Z.Y., et al. The involvement of p62-Keap1-Nrf2 antioxidative signaling pathway and JNK in the protection of natural flavonoid quercetin against hepatotoxicity. Free Radic Biol Med. 2015; Vol. 85: 12-23.
31. Lee Y.J., Lee D.M., Lee S.H. Nrf2 Expression and apoptosis in quer-cetin-treated malignant mesothelioma cells. Mol. Cells. 2015; Vol. 38 (5): 416-25.
32. Valerio L.G. Jr, Kepa J.K., Pickwell G.V., Quattrochi L.C. Induction of human NAD(P)H:quinone oxidoreductase (NQO1) gene expression by the flavonol quercetin. Toxicol Lett. 2001; Vol. 119 (1): 49-57.
33. Elavarasan J., Velusamy P., Ganesan T., et al. Hesperidin-mediated expression of Nrf2 and upregulation of antioxidant status in senescent rat heart. J Pharm Pharmacol. 2012; Vol. 64 (10): 1472-82.
34. Chen M., Gu H., Ye Y., et al. Protective effects of hesperidin against oxidative stress of tert-butyl hydroperoxide in human hepatocytes. Food Chem Toxicol. 2010; Vol. 48 (10): 2980-7.
35. Chen M.C., Ye Y.Y., Ji G., Liu J.W. Hesperidin upregulates heme oxygenase-1 to attenuate hydrogen peroxide-induced cell damage in hepatic L02 cells. J Agric Food Chem. 2010; Vol. 58 (6): 3330-5.
36. Manach C., Morand C., Demigne C., et al. Bioavailability of rutin and quercetin in rats. FEBS Lett. 1997; Vol. 409: 12-16.
37. Matsumoto H., Ikoma Y., Sugiura M., et al. Identification and quantification of the conjugated metabolites derived from orally administered hesperidin in rat plasma. J Agric Food Chem. 2004; Vol. 52 (21): 6653-9.
