CC BY
35
УДК 57.083.133
А. К. Яковлева, З. А. Канарекая, А. В. Канарский
ВЛИЯНИЕ ХЛОРИДА НАТРИЯ НА ФЕРМЕНТАТИВНУЮ АКТИВНОСТЬ ДРОЖЖЕЙ DEBARYOMYCES НАШЕШ1 Н4651
Ключевые слова: меласса, хлорид натрия, галотолерантные дрожжи, культивирование, ферментативная активность.
Установлено, что при культивировании дрожжей D. hansenii Н4б51 на питательной среде из мелассы, содержащей 10 % хлорида натрия, проявляется максимальная /3-фруктофуранозидазная активность, которая обусловливает увеличение содержания редуцирующих веществ в питательной среде по окончанию культивирования и способствует росту дрожжевых клеток.
Keywords: molasses, sodium chloride, halotolerant yeast, cultivation, enzymatic activity.
It was established that the cultivation of yeast D. hansenii H4651 on a nutrient medium from molasses containing 10 % sodium chloride shows maximum fi-fructofuranosidase activity, which causes an increase in the content of reducing substances in the nutrient medium at the end of cultivation and promotes the growth ofyeast cells.
Актуальность
Микроорганизмы, способные расти в среде с содержанием NaCl от 15 % и выше, относят к экстремальным галотолерантным формам и объединяют под общим названием галофилы. Отмечено, что в этих экстремальных условиях галлофилы проявляют достаточно высокую ферментативную активность [1].
Одним из представителей галофильных микроорганизмов являются дрожжи Debaryomyces hansenii. Дрожжи D. hansenii являются наиболее распространенным видом среди аскомицетов. Данный вид дрожжей достаточно просто диагностируется по характерным морфологическим признакам: круглые клетки с характерным множественным почкованием, аски с одной круглой аскоспорой [2].
Дрожжи D. hansenii являются осмотолерантными и способные расти в среде, содержащей до 4 M NaCl, в то время как рост S. cerevisiae ограничивается в средах, содержащих менее чем 1,7 M NaCl. D. hansenii находят в морской воде и почве, пищевых продуктах, в вине, пиве, фруктах. Эти дрожжи встречаются в продуктах питания с высоким содержанием сахара [3].
Дрожжи D. hansenii обитают во всех видах сыров, в том числе в мягких сырах и рассолах, в полутвердых и твердых сырах. Установлено, что дрожжи D. hansenii, ингибирует прорастание в сырном рассоле нежелательных микроорганизмов, таких как Clostridium butyricum и C. tyrobutyricum, т.к. эти дрожжи не производят антимикробные метаболиты, как вне- так и внутриклеточные. Дрожжи D. hansenii усваивают лактат, лактозу и галактозу, что обуславливает их использование в качестве компонента заквасок при изготовлении сыров, в которых они способны эффективно размножаться [4].
Установлено, что для дрожжей D. hansenii оптимальными условиями культивирования являются 15 - 25°С и рН 6,8 - 7,2, при которых эти дрожжи способны ассимилировать субстрат с содержанием до 25 % солей [5]. При культивировании на питательных средах
приготовленных из вторичных ресурсов переработки растительного сырья наблюдается наибольшая удельная скорость роста дрожжей D. катепИ и проявление этими дрожжами в-фруктофуранозидазной, целлюлазной, ксиланазной, пектиназной и других видов активностей [6]. Следует отметить, что основным преимуществом использования галофильных микроорганизмов в биотехнологии является возможность их культивирования в присутствии посторонней микрофлоры. Несомненно, что такой процесс значительно удешевляет затраты на культивирование. В этой связи при условии повышения ферментативной активности дрожжей D. катепИ целесообразно использовать эту культуру в качестве продуцентов внеклеточных ферментов в промышленности.
Цель работы: исследование влияния хлорида натрия на ферментативную активность аскомицетовых галофильных дрожжей D. катепИ Н4651 при культивировании на питательной среде из мелассы.
Для достижения данной цели определялось влияние температуры и продолжительности культивирования на рост клеток дрожжей, потребление редуцирующих веществ и синтез внеклеточной в-фруктофуранозидазы.
Методическая часть
В работе был использован штамм дрожжей D. катепИ Н4651, предоставленный коллекцией кафедры «Бионанотехнология и биоорганический синтез» Московского государственного университета пищевых производств.
Культивирование дрожжей D.кanseni проводили на стерильной питательной среде из мелассы с начальным содержанием редуцирующих веществ 0,23 % и сахарозы 1,74 % [7].
Мелассу предварительно разбавили в дистиллированной воде, стерилизовали в автоклаве в течение 30 мин и при температуре 115 °С. Далее в стерилизованный раствор мелассы вносили (МН4)^04 и КН2Р04 исходя из начального содержания редуцирующих веществ и выхода дрожжей. В подготовленную питательную среду
вносили хлорид натрия, содержание которого в питательной среде составляло 10, 20, 30 и 40 %.
Дрожжи О. hansenii Н4651 культивировались в колбах объемом 100 мл при температуре 25±1 °С при непрерывном перемешивании на шейкере в течение 5 суток.
Для определения количества дрожжевых клеток в культуральной жидкости использовали камеру Горяева-Тома [8]. Р-фруктофуранозидазная активность дрожжей О. hansenii Н4651 определялась по скорости ферментативной реакции гидролиза сахарозы, которую устанавливали по количеству образовавшегося инверта в реакционной жидкости [9].
Результаты и обсуждение
На рис. 1 представлены результаты, отражающие изменение содержания редуцирующих веществ в питательной среде при культивировании дрожжей О. hansenii Н4651 во взаимосвязи с содержанием хлорида натрия в питательной среде и продолжительностью культивирования.
При культивировании дрожжей О. hansenii Н4651 отмечена тенденция увеличения содержания РВ в культуральной среде, а затем снижения этого показателя.
При этом достижение максимального значения РВ в культуральной жидкости происходит при культивировании дрожжей О. hansenii Н4651 на питательной среде, содержащей 10% хлорида натрия через 100 часов кльтивирования. При содержании в питательной среде хлорида натрия 40% значение этого показателя несколько ниже. Однако максимальное значение РВ в питательной среда достигается через 65 часов. Следует отметить, что значительных изменений РВ в культуральной жидкости при культивировании О. hansenii Н4651 на питательной среде, не содержащей и содержащей хлорид натрия 20 и 30 %, не наблюдается.
О 50 100 150
Время, ч
Рис. 1 — Содержание редуцирующих веществ в процессе культивирования дрожжей В. hansenii Н465! на средах, содержащих мелассу и сахарозу
Установленная выше тенденция сохраняется и на время окончания культивирования: максимальное содержание РВ характерно при культивировании
дрожжей О. hansenii Н4651 на питательной среде содержащей 10 и 40 % хлорида натрия (табл. 1).
Максимальное количество клеток накапливается дрожжами О. hansenii Н4651 в питательной среде с содержанием хлористого натрия 10 %. Как видно из полученных данных, дрожжи при этой концентрации хлорида натрия в питательной среде растут эффективней, чем в питательной среде без хлорида натрия. Однако, увеличение содержания хлорида натрия более 10 %, негативно сказываются на росте клеток (табл.1).
Таблица 1 - Р-фруктофуранозидазная активность дрожжей В. hansenii Н4651 при культивировании на питательной среде из мелассы*
Показатели** Содержание №С1 в питательной среде, %
Контроль 10 20 30 40
***Содержание редуцирующих веществ в культуральной жидкости, % 0,08 0,28 0,08 0,05 0,13
Количество клеток, • 108 0,250 1,200 0,016 0,011 0,011
в- фруктофураноз и-дазная активность, мкмоль/мл культуральной жидкости 1,67 5,97 1,19 1,19 2,39
*температура культивирования 25 ± 1 °С. **показатели определялись по завершению культивирования дрожжей - 120 час. ***начальное содержание редуцирующих веществ в питательной среде - 0,23 %
Увеличение РВ в культуральной жидкости объясняется синтезом дрожжами внеклеточного фермента Р-фруктофуранозидаза, гидролизующего сахарозу в питательной среде. Наибольшую активность Р-фруктофуранозидазы проявляется дрожжами О. hansenii Н4651 при культивировании на питательной среде с содержанием хлористого натрия 10%.
При этом же содержании хлорида натрия в культуральной жидкости наблюдается и максимальной количество клеток дрожжей продуцентов Р-фруктофуранозидазы.
Таким образом, при культивировании дрожжей О. hansenii Н4651 на питательной среде из мелассы, содержащей 10% хлорида натрия проявляется максимальная Р-фруктофуранозидазная активность, которая обуславливает увеличение содержания редуцирующих веществ в питательной среде в период культивирования и способствует росту дрожжевых клеток.
Литература
1 Яковлева А.К., Канарский А.В., Канарская З.А. Вестник Казан. технол. унив. Т. 20. № 8. С. 147 - 152. (2017).
2 Чернов И.Ю. Дрожжи в природе. М.: Товарищество научных изданий КМК. 336 с. (2013).
3 U. Breuer, H. Harms. Debaryomyces hansenii — an extremophilic yeast with biotechnological potential // Yeast. Vol.23. Pp. 415-437. (2006).
4 Klaus Gori1, Louise Marie S0rensen1, Mikael Agerlin Petersen, Lene Jespersen, Nils Arneborg. Debaryomyces hansenii strains differ in their production of flavor compounds in a cheese-surface model // MicrobiologyOpen. Vol.2. Pp. 161-168. (2012).
5 Yudin N.Yu., Arlyapov V.A., Zaitsev A.S., Reshetilov A.N. Influence of time of cultivation, the composition of the
test sample and assay conditions on the oxidation of asset-yeast Debaryomyces hansenii. Estestvennye nauki. [Science]. № 3. PP. 186-197. (In Russ.). (2012).
6 Ле Ань Туан, Канарский А.В., Канарская З.А. Вестник Воронежского гос. унив. инженерных технологий. № 1. С. 191-197. (2016).
7 Морозова Ю.А., Скворцов Е.В., Алимова Ф.К., Канарский А.В. Вестник Казан. технол. унив. Т. 15. № 19. С. 120-122. (2012).
8 Нетрусов А.И., Егорова М.А., Захарчук Л.М. и др.: Практикум по микробиологии: учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений. М.: Издательский центр «Академия». 608 с. (2005).
9 Polygalina G.V., Cherednichenko V.S., Rimareva L.V. Opredelenie aktinosti fermentov [Determination of activity enzymes]. M. DeLee print. 375 p. (2003).
© А. К. Яковлева, магистрант, кафедры пищевой биотехнологии КНИТУ, [email protected]; З. А. Канарская, к.т.н., доцент кафедры пищевой биотехнологии, [email protected]; А. В. Канарский, д.т.н., профессор кафедры пищевой биотехнологии, КНИТУ, [email protected].
© A. K. Yakovleva, graduate student, dep. Food biotechnology KSRTU , [email protected]; Z. A. Kanarskaya, Ph.D. tech. sci., docent dep. Food biotechnology KSRTU, [email protected]; A. V. Kanarskiy, Dr. Tech. Sci., professor, Department of Food Biotechnology, Kazan National Research Technological University, [email protected].
