CC BY
107
УДК 57.083.133
Ле Ань Туан, А. В. Канарский, А. В. Щербаков, В. К.Чеботарь
ЭФФЕКТИВНОСТЬ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ДРОЖЖЕЙ DEBARYOMYCES HANSENII НА ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЕ ИЗ МЕЛАССЫ
Ключевые слова: меласса, дрожжи Debaryomyces hansenii Н433, культивирование, в- фруктофуранозидаза.
Установлено, что при культивировании дрожжей D. hansenii Н433 на питательной среде из мелассы при температуре 20 oC достигается наибольшая скорость роста дрожжей и наименьшая продолжительность генерации. Наибольший выход биомассы дрожжей D. hansenii Н433 наблюдается при температуре 15 oC и дополнительном введении в питательную среду биогенных веществ. Показано, что дрожжи D. hansenii Н433 при культивировании на питательной среде из мелассы с ограниченным содержанием биогенных веществ синтезируют внеклеточный фермент в- фруктофуранозидазу.
Keywords: molasses, yeast Debaryomyces hansenii H433, cultivation, в- fructofuranosidase.
It is found that when cultured yeast D. hansenii Н433 nutrient medium from molasses at 20 oC achieved the highest growth rate and the smallest yeast generation duration. The highest yield of yeast biomass D. hansenii H433 is observed at a temperature of 15 oC, and further adding to the culture medium of nutrients. It is shown that the yeast D. hansenii H433 when cultured in a nutrient medium from the molasses with a limited content of nutrients synthesized extracellular enzyme в- fructofuranosidase.
Актуальность
Кормовой белок составляет важную часть рациона кормления в промышленном животноводстве - его основная цель состоит в восполнении дефицита незаменимых аминокислот в растительных кормах. Исключительная скорость размножения и богатый химический состав дрожжевых клеток обусловливают широкое использование их биомассы как ценного кормового продукта для целей животноводства и птицеводства. Производство биомассы дрожжей на питательной среде из доступного по цене сырья рассматривают как одно из средств устранения растущего белкового дефицита в кормлении животных.
В производстве кормового белка микробиологическим синтезом используются отходы картофеле-крахмального производства (клеточный сок и соковые воды, мезга), послеспиртовая барда, молочная сыворотка, отходы консервной промышленности и др.
Среди штаммов-продуцентов кормового белка получили распространение виды дрожжей C.utilis, C. scottii и C. tropicalis, способные, наряду с гексо-зами, усваивать пентозы, а также выживать в присутствие фурфурола в питательной среде [1,2].
Штамм дрожжей С. scottii удовлетворительно утилизирует трудноусвояемую арабинозу и развивается при температуре 36-38 °С и рН = 4,2^4,6. Рекомендуется использовать также совместное культивирование C.scottii и С. tropicalis поскольку более урожайные штаммы C. trolicalis, в отличие от С. scottii, не являются прототрофами и не способны сами синтезировать все витамины. Однако, ввиду нестерильности производства кормового белка, в биореакторах обычно формируется ассоциация культур, включающая 5-8 видов дрожжей [3].
При биохимической переработке сульфитно-спиртовой барды на кормовой белок используют в основном культуру C. utilis, которая является неприхотливой и пригодна для культивирования совместно с высокоурожайной культурой C. tropicalis.
При синтезе кормового белка дрожжами на питательных средах из мелассной барды получают кормовой белок культивированием дрожжей C.utilis, Trichosporon cutaneum, Torulopsis pinus, на зерновой барде — C. arboreae, C. tropicalis CK-4.
Дрожжи C. utilis усваивают глюкозу, ксилозу, не полностью — галактозу и не ассимилируют араби-нозу. Они не нуждаются в витаминах. Дрожжи C. tropicalis кроме глюкозы и ксилозы усваивают галактозу и частично арабинозу [4].
Различные виды дрожжей с разной эффективностью усваивают глицерин и органические кислоты. В частности, дрожжи C. utilis и Tr. cutaneum активнее и полнее ассимилируют молочную кислоту и глицерин, составляющие более 1/3 всех усваиваемых источников углерода, и накапливают больше биомассы, чем дрожжи C. tropicalis.
Дрожжи Tr. cutaneum способны усваивать пир-ролидонкарбоновую кислоту, а также пептоны, пептиды и липиды, не усваиваемые дрожжами C. utilis и Tor. pinus. Эти особенности дрожжей учитывают при подборе их для совместного культивирования на различных по составу питательных средах. Вследствие автоселекции в биореакторе образуются сложные биоценозы микроорганизмов. В частности, при культивировании дрожжей на ме-лассной барде в биоценозе присутствуют следующие продуценты кормового белка (г сухой биомассы/1 л): C. utilis Л-35 — 18,0; C. utilis Л-22 — 17,6; Tor. pinus Л-30 — 12,1; C. tropicalis Л-36 — 15,4; C. curvata Л-32 — 8,4; C. mesenterica - 12,8; Tr. cutaneum Л-52 — 25,2. Это подтверждает важность применения в микробиотехнологии кормового белка смешанной культуры продуцентов, являющейся более продуктивной, чем монокультуры.
К сожалению, технология микробиологического синтеза кормового белка, реализованная в прошлом веке, в настоящее время является нерентабельной. Химический гидролиз клетчатки является энергоемким и опасным для окружающей среды процессом.
Ранее используемые вторичные ресурсы переработки древесины (сульфитная барда) отсутствуют. Используемые культуры дрожжей сегодня относят к патогенным микроорганизмам. Культивирование этих культур требует высоких энергетических затрат (электрической энергии, воды, сжатого воздуха). Кроме того, ранее используемые в промышленности дрожжи - продуценты кормового белка могут эффективно культивироваться на питательных средах, содержащих простые сахара.
В этой связи весьма актуально создание высокорентабельной, экологически обеспеченной технологии микробиологического производства кормового белка с использованием продуцентов, способных синтезировать белок в составе безопасной биомассы при низких энергетических затратах и ассимилировать углерод из гетерогенных по составу питательных сред. К таким продуцентам кормового белка можно отнести аскомицетовые дрожжи [5,6,7].
Еще одной важной задачей является поиск альтернативных источников углерода для культивирования дрожжей как источника кормового белка. Доступным сырьевым ресурсом для биотехнологической промышленности является меласса, которую используют в производстве этилового спирта, пищевых кислот, пекарных дрожжей и других биопродуктов [8,9,10,11].
Цель настоящей работы - определение эффективности культивирования аскомицетовых дрожжей БвЬагуотуса' ИатвпИ на питательной среде из мелассы.
Для достижения данной цели было определено влияние температуры и продолжительности культивирования на рост клеток дрожжей, количество биомассы дрожжей, потребление редуцирующих веществ. На основании полученных результатов были рассчитаны кинетические и экономические характеристики факторов роста дрожжей Б. ИатвпИ на питательной среде из мелассы.
Методическая часть
В работе использован штамм дрожжей рода Б. Иат'впИ Н433, предоставленный Всероссийской коллекцией непатогенных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии» (г. Пушкин).
Культуру дрожжей выращивали на питательной среде, приготовленной из мелассы с начальным содержанием редуцирующих веществ 0,9 ± 0,1 % с добавлением и без добавления биогенных веществ. Определение редуцирующих сахаров проводили по методике, приведенной в работе [12]. К 120 мкл исследуемой пробы добавляли 1200 мкл дистиллированной воды и 600 мкл Б№А. Выдерживали пробы 10 минут при 100 °С, затем 5 мин. при 0 °С. Далее добавляли во все пробы по 6 мл дистиллированной воды и измеряли оптическую плотность при 540 нм при ширине кюветы 5мм. В контрольный образец вместо пробы добавляли дистиллированную воду - 120 мкл.
Кроме начального содержания редуцирующих веществ в питательной среде определяли общее со-
держание редуцирующих веществ. Для этого проводили гидролиз всех углеводов питательной среды в закрытых пробирках при рН 12 нагреванием до температуры кипения в течение 60 мин. Общее содержание редуцирующих веществ в экспериментах составляло 15 ± 1 %.
Предварительно разбавленную мелассу стерилизовали в автоклаве при 120° С в течении 20 минут. Затем в стерилизованный раствор мелассы добавляли (МН4)2804 и КН2Р04, исходя из начального содержания редуцирующих веществ и выхода дрожжей. В питательной среде рН составило 6,65.
Культивирование осуществлялось в колбах Эр-ленмейера объемом 100 мл при 15±1°С; 20±1оС; 25±1°С при непрерывном перемешивании на шей-кере инкубатора Е8-20 в течении 5 суток. Отбор проб проводили каждые 24 часа.
Определение биомассы дрожжей проводили фотометрическим методом с предварительным построением калибровочного графика. Оптическую плотность определяли при длине волны 540 нм при ширине кюветы 5 мм [13].
Для определения количества дрожжевых клеток использовали камеру Горяева - Тома [14]
Активность в-фруктофуранозидазы определяли по скорости ферментативной реакции гидролиза сахарозы, которую устанавливали по количеству образовавшегося инверта в реакционной жидкости [15].
Удельная скорость роста, продолжительность генерации и выход дрожжей рассчитывали согласно рекомендациям в работе [16].
Результаты и обсуждение
Как видно из результатов исследований, представленных на рис. 1, продолжительность лаг-фазы после инокуляции дрожжей Б. ИатвпИ Н433 на питательную среду из мелассы зависит от температуры культивирования. При температуре культивировании дрожжей Б. ИатвпИ Н433 15°С продолжительность лаг-фазы в два раза выше по сравнению с продолжительностью этого периодом при температуре культивирования 20 и 25 °С. Продолжительность фазы ускоренного роста дрожжей Б. ИатвпИ Н433 незначительна, поэтому сделать выводы о влиянии рассмотренных температур культивирования и биогенных веществ (азота, калия и фосфора), дополнительно внесенных в питательную среду, на рост дрожжей не представляется возможным.
Деление клеток и синтез биомассы на стадии логарифмической фазы роста Б. ИатвпИ Н433 зависит как от температуры культивирования, так и от наличия биогенных веществ. Наиболее интенсивное деление клеток дрожжей Б. ИатвпИ Н433 и накопление биомассы происходит при 25 °С. Через 100 час. культивирования клеток дрожжей Б. ИатвпИ Н433 при температуре 20 и 25 °С происходит максимальное увеличение количества клеток и наблюдается фаза замедленного роста дрожжей. Деление клеток дрожжей Б. ИатвпИ Н433 при температуре 15° С происходит значительно медленней и фаза замедленного роста не наблюдается. Накопление биомассы дрожжей Б. ИатвпИ Н433 имеет противоположный характер. При температуре культивиро-
вания 15 и 20°С накопление биомассы дрожжей Б. Натвпи Н433 заканчивается через 100 час, при температуре культивирования 25°С накопление биомассы дрожжей Б. Натвпи Н433 не заканчивается.
1.У
О ZO 40 60 80 100 120 110
Продолн*итетьностъ ку л ыи[! и р г езл н и я. ч
а
ь.о
I 1
О 20 Ю ЪО 80 100 120 140
Продолжительностькульгивиров^ния, ч
б
Рис. 1 - Влияние продолжительности и температуры культивирования дрожжей Б. Натеки (Н433) на питательной среде из мелассы на рост числа клеток (а) и синтез биомассы (б): 1 - с дополнительными биогенными веществами при температуре 25оС, 2 - без биогенных веществ при температуре 20оС, 3 - без дополнительных биогенных веществ при температуре 25оС, 4 - с дополнительными биогенными веществами при температуре 20оС, 5 - с дополнительными биогенными веществами при температуре 15оС, 6 -без дополнительных биогенных веществ при температуре 15оС
Следует отметить, что дополнительное внесение в питательную среду биогенных веществ существенного влияния на рассмотренные фазы деления клеток дрожжей Б. Натвпи Н433 и рост биомассы не оказывает. Видимо, присутствующих в мелассе соединений азота, калия и фосфора достаточно для жизнедеятельности дрожжей Б. Натвпи Н433.
В период культивирования дрожжи Б. Натвпи Н433 потребляют редуцирующие вещества. Однако, как показали исследования, потребление редуцирующих веществ не адекватно количеству синтезируемой биомассы дрожжей Б. Натвпи Н433 . Содержание редуцирующих веществ после 50 час. культивирования дрожжей Б. НатвпИ Н433 начинает увеличиваться (рис. 2). Установленную закономерность
можно объяснить синтезом дрожжами Б. Натвпи Н433 внеклеточной в- фруктофуранозидазы, которая гидролизует сахарозу в питательной среде (табл. 1). При этом наибольшее накопление в культуральной жидкости внеклеточной в- фруктофуранозидазы происходит при температуре культивирования дрожжей Б. НатвпИ Н433 20°С.
РВ,К50
0.0 -
П ?0 4(1 fin so ion 1?ct MO Продолжительноггь культивирование ч
Рис. 2 - Влияние продолжительности и температуры культивирования дрожжей D. hansenii Н433 на питательной среде из мелассы на содержание редуцирующих веществ в культуральной жидкости: 1 - без дополнительных биогенных веществ при температуре 25оС, 2 - без дополнительных биогенных веществ при температуре 20оС, 3 -без дополнительных биогенных веществ при температуре 15оС, 4 - с дополнительными биогенными веществами при температуре 25оС, 5 - с дополнительными биогенными веществами при температуре 20оС, 6 - с дополнительными биогенными веществами при температуре 15оС
Следует отметить, что в условиях культивирования с внесением дополнительных биогенных веществ в питательную среду дрожжи Б. hansenii Н433 внеклеточный фермент в- фруктофуранозидаза не синтезируют.
Таблица 1 - Активность внеклеточной 0-фруктофуранозидазы, синтезируемой дрожжами Б. Натеки Н^ш на питательной среде из мелассы
Активность в-фруктофуранозидазы, мкмоль/мл
культуральной среды
при температуре культивирования, С
15 20 25
0,94/0,00 1,63/0,00 1,15/0,00
* числитель - культивирование без дополнительных биогенных веществ;
знаменатель - культивирование с внесением дополнительных биогенных веществ
Продолжительность культивирования дрожжей 120 час.
Удельная скорость роста дрожжей Б. НатвпИ Н433 несколько выше при температуре 20 °С. При этой температуре культивирования продолжительность генерации дрожжей Б. НатвпИ Н433 снижается по сравнению с продолжительностью генерации при других температурах культивирования исследуемых дрожжей (табл. 1).
Таблица 2 - Кинетические и экономические факторы культивирования дрожжей Б. Натвни Н433 на питательной среде из мелассы*
Факторы** Температура культивирования, о С
15 20 25
Удельная скорость роста ч-1 0,015/0,0 16 0,02/0,01 8 0,016/0,02 0
Продолжительность генерации Q, ч-1 46,2/43,3 34,6/38,5 43,3/34,6
Выход биомассы, % 30/39,2 17/35 14/28,6
* числитель - культивирование без дополнительных биогенных веществ;
Знаменатель - культивирование с дополнительными биогенными веществами.
** общая продолжительность культивирования 120 час.
Внесение дополнительных биогенных веществ в питательную среду не оказало существенного влияния на удельную скорость роста и продолжительность генерации дрожжей. Однако, выход биомассы выше при культивировании дрожжей Б. ИатвпИ Н433 на питательной среде с дополнительным внесением биогенных веществ. При этом со снижением температуры культивирования дрожжей Б. ИатвпИ Н433 выход биомассы увеличивается, что указывает на более полное использование дрожжами редуцирующих веществ.
Выводы
1. При культивировании дрожжей Б. ИатвпИ Н433 на питательной среде из мелассы при температуре 20 °С достигается наибольшая скорость роста дрожжей и наименьшая продолжительность генерации.
2. Наибольший выход биомассы дрожжей Б. Иат'впИ Н433 наблюдается при температуре 15 °С и дополнительном введении в питательную среду биогенных веществ.
3. Дрожжи Б. Иат'впИ Н433 при культивировании на питательной среде из мелассы с ограниченным содержанием биогенных веществ синтезируют внеклеточный фермент в- фруктофуранозидазу.
Литература
1. Новожилов Е. В. Производство кормовых дрожжей на сульфитно-щелоковых средах: учеб. Пособие / Е.В. Но-
вожилов. - Архангельск: Арханг. Гос. Техн. Ун-т, 2008. 104с.
2. А. А. Андреев, Л. И. Брызгалов, Производство кормовых дрожжей. 3-е изд., перераб. и доп. М. Лег. пром-сть. 1986. 248 с.
3. К. И. Джанаев. Автореф. дисс. канд. био. наук. Горс. гос. аграр. ун-т. Владикавказ, 2012. 22 с.
4. T. Satyanarayana, G. Kunze. Yeast biotechnology: Diversity and Applications. Springer. 2009, 737 с.
5. И.Ю. Чернов. Дрожжи в природе. Товарищество научных изданий КМК. Москва. 2013. 336 с.
6. И.П. Бабьева, И.Ю. Чернов. Биология дрожжей. Наука, М. 2004, 221 с.
7. Меледина Т.В., Давыденко С.Г., Васильева Л.М. Физиологическое состояние дрожжей: Учеб. Пособие. НИУ ИТМО, ИХиБТ, СПБ, 2013.48 с.
8. И.А. Капитонова. Журнал о передовых технологиях в сельском хозяйстве. № 3. с.18-19 (2014);
9. А.Н. Огурцов. Ферментативный катализ: учеб, пособие. НТУ "ХПИ", 2010, 304 с.
10. И.С. Витол, И.Б. Кобелева, С.Е. Траубенберг. Ферменты и их применение в пищевой промышленности: учебное пособие. Изд. Комплекс МГУПП, М. 2000, 66 с.
11. A. Halasz, R. Lâsztity. CRC press. P. 300. (2000).
12. Ю. А.Морозова, Е. В. Скворцов, Ф. К. Алимова, А. В. Канарский. Вест. Каз. Тех. Ун-та. Т. 15., № 19. С. 120122 ( 2012).
13. Б. А. Чакчир, Г. М. Алексеева. Фотометрические методы анализа. Методические указания. Изд-во СПХФА, СПб. 2002. 44 с.
14. А.И. Нетрусов, М.А. Егорова, Л.М. Захарчук. Практикум по микробиологии: Учеб. пособие для студ. высш. учеб. Заведений. Издательский центр "Академия", М. 2005. 608 с.
15. Г.В. Полыгалина, В.С. Чередниченко. Л.В. Римарева. Определение активности ферментов. Справочник. ДеЛи принт, М. 2003. 375с.
16. Е.А. Скиба. Технология производства дрожжей: учебное пособие. Алт. гос. техн. ун-т, БТИ. Изд-во Алт. гос. техн. ун-та, Бийск. 2010. 121 с.
17. Н.Ю. Юдина, В .А. Арляпов, А.С. Зайцева, А.Н. Реше-тилов. Естественные науки. Тула. Вып.3. С.186-197 (2012).
18. A. Converti, J. M. Dominguez. Biotechnology and Bioengineering, V.75, N.1, P. 39-45/ (2001)
19. Breuer U, Harms H. Yeast V.23 p. 415-437 (2006),
20. Aggarwal M, Mondal AK. Eukaryot Cell. V. 5 p. 262-271 (2006).
21. О.Н. Понаморева, В.А. Арляпов, С.С. Каманин, Н.Ю. Юдина, В.А Алферов. Вестник биотехнологии. Т 6. № 3. с. 5 - 12. (2010).
© Ле Ань Туан - аспирант каф. Пищ. БТ КНИТУ, letuan.tnvn@gmail.com; А. В. Канарский - д.т.н., профессор каф. Пищ. БТ КНИТУ, alb46@mail.ru; В. К. Чеботарь - к.б.н., заведующий лабораторией технологии микробных препаратов ГНУ ВНИИСХМ Россельхозакадемии, bisolbi-inter@rambler.ru; А. В. Щербаков - к.б.н., ст. научный сотрудник лаборатории технологии микробных препаратов ГНУ ВНИИСХМ Россельхозакадемии, avsherbakov@bisolbi.ru.
© Le Anh Tuan - graduate student of Food Biotechnology, Kazan National Research Technological University. letuan.tnvn@gmail.com; A. V. Kanarskiy -Dr. Sci. (Tech.), Prof., Department of food engineering in small enterprises, KNRTU alb46@mail.ru; V. K. Chebotar - Ph.D, Head of Laboratory of Microbial Technology products SSI VNIICHM RAA, bisolbi-inter@rambler.ru; A. V. Shcherbakov - Ph.D, Senior research assistant of Laboratory of Microbial Technology products SSI VNIICHM RAA, avsherbakov@bisolbi.ru.
