CC BY
32
УДК 57.083.133
Утилизация Сахаров из ферментолизатов соломы пшеничной психрофильными
дрожжами в анаэробных условиях
Канд. хим. наук И.В. Кручина-Богданов, [email protected]
ООО «АМТ»
198097, Россия, Санкт-Петербург, пр. Стачек, 47
Е.Р. Якубов, [email protected] д-р техн. наук А.В. Канарский, [email protected] канд. техн. наук З.А. Канарская, [email protected]
Казанский национальный исследовательский технологический университет 420015, Россия, Казань, ул. Карла Маркса, 68
Исследовали возможность сбраживания редуцирующих сахаров, синтеза этанола и органических кислот штаммами таких психрофильных дрожжей, как Debaryomyces hansenii Н4651, Н433 и Н18-3 и Guehomyces pullulans KB1-34 при культивировании их при температурах 15; 20 и 25°C на питательной среде, приготовленной из ферментолизатов пшеничной соломы. Изучено влияние внесения солей на возможности штаммов. Исследовали глубокую утилизацию углеводов в ферментолизатах соломы при двухступенчатом способе культивирования. Эксперимент осуществлялся в два этапа: штаммы дрожжей культивировались с добавлением и без добавления сульфата аммония, солей калия и фосфора в аэробных условиях. Культивирование проводилось в колбах Эрленмейра объемом 250 мл в течение трех суток. После достижения необходимой биомассы перемешивание прекращалось, тем самым создавались анаэробные условия, необходимые для сбраживания и утилизации простых сахаров. Сбраживание так же продолжалось в течение трех суток. Состав остаточных углеводов и продуктов брожения анализировали методом ионно-эксклюзионной ВЭЖХ на колонке с катионитом Hitachi 2614 с двойным детектированием (рефрактометр + фотометр с длиной волны 210 нм). Полученные результаты показывают продолжительную активность внеклеточных целлюлолитических ферментов, которые гидролизуют олигомерные углеводы клетчатки соломы с образованием простых сахаров как субстрата для сбраживания с получением вторичных продуктов метаболизма. При ограниченном доступе воздуха происходит гетероферментативное кислотообразование с преобладанием пропионовокислого механизма, а также спиртовое брожение.
Ключевые слова: культивирование микроорганизмов; ферментолизат; психрофильные дрожжи; брожение; утилизация сахаров.
DOI: 10.17586/2310-1164-2019-12-2-3-10
Utilization of sugars from wheat fermentatives with psychrophilic yeast under
anaerobic conditions
Ph. D. Igor V. Kruchina-Bogdanov, [email protected]
Ltd "АМТ"
26, Stachek ave., St. Petersburg, 198096, Russia
Eugene R. Yakubov [email protected]
D. Sc. Albert V. Kanarskiy, [email protected] Ph. D. Zosya A. Kanarskaya, [email protected]
Kazan National Research Technological University 68, Karl Marx str., Kazan, 420015, Russia
The possibility of reducing fermentation of sugars, the synthesis of ethanol and organic acids by strains of psychrophilic yeasts, such as Debaryomyces hansenii H4651, H433 and H18-3 and Guehomyces pullulans KB1-34, was studied under cultivation at the temperatures of 15; 20; 25°C in c. The effect of salt addition on the capabilities of the strains was also studied. Deep utilization of carbohydrates in fermentatives straw with a two-step method of cultivation was examied. The experiment was carried out in two stages: first, yeast strains were cultivated with and without adding ammonium sulfate, potassium salts, and phosphorus under aerobic conditions. Cultivation was carried out in 250 ml Erlenmeyer flasks for three days. After reaching the required biomass, mixing was stopped, thereby creating the anaerobic conditions necessary for the digestion and utilization of simple sugars. Fermentation lasted for three days also.
The composition of the residual carbohydrates and fermentation products was analyzed by ion-exclusion HPLC using a Hitachi 2614 double-detection cation exchange resin (refractometer + photometer with a wavelength of 210 nm). The results show a prolonged activity of extracellular cellulolytic enzymes that hydrolyze the oligomeric carbohydrates of the straw fiber to form simple sugars as a substrate for digestion with the production of secondary metabolic products. With limited air access heterofermentative acid formation occurs with a predominance of the propionic acid mechanism, as well as alcoholic fermentation. Keywords: cultivation of microorganisms; fermentative; psychrophilic yeast; fermentation; utilization of sugars.
Введение
Микроорганизмы, называемые психрофильными, преимущественно обнаруживаются в местах с низкой температурой. Выделяют психротолерантные дрожжи, которые способны произрастать в условиях, характерных для психрофилов - при температурах, близких к нулю градусов по Цельсию, но наивысшую скорость роста имеют в диапазоне температур 15-25°С и истинные психрофилы, не способные расти при температуре выше 20°С [1]. При температуре более 20°С наблюдается увеличение скорости деления клеток психротолерантных дрожжей, но снижается выход биомассы и активность внеклеточных ферментов [2]. Дрожжи Debaryomyces hansenii - один из самых распространенных видов среди аскомицетов. Они часто встречается в морской воде и других соленых водоемах [3]. Такое обилие D. hansenii в средах с высоким содержанием солей связано с наличием у этого вида галотолерантности. D. Иа^епи способны расти при концентрации свыше 10%, поэтому они
относятся к одним из наиболее солеустойчивых видов [4]. Их устойчивость к солям объясняется свойствами, включающими в себя поддержание внутриклеточной концентрации ионов, изменение состава мембран, накопление осмопротекторов. Известно, что цитоплазма клеток D. hansenii обладает высокой буферностью, объясняемой активной регуляцией внутриклеточного содержания №+ и К+ благодаря специфике их переноса через мембраны клеток [5]. В средах с высоким содержанием D. hansenii активно синтезируют и запасают в клетках арамит и глицерин - осмопротекторы и сахароспирты [6].
Высокая гидролитическая активность D. hansenii так же может объяснять их широкое распространение. Данному виду свойственна и высокая пектинолитическая активность [7].
При ферментативном гидролизе целлюлозы штаммами дрожжей G. pullulans происходит накопление олигомерных продуктов, в частности, целлобиозы, которые мешают более полному гидролизу целлюлозы до глюкозы. Установлено, что свободные или иммобилизованные клетки дрожжей О. рШиШт в альгинате кальция синтезируют фермент Р-глюкозидазу, гидролизующую целлобиозу [8].
В этанол содержащей питательной среде дрожжи О. риНиШ^ синтезируют глюкопротеин с молекулярной массой 100-151 а.е.м, обладающий иммуностимулирующей активностью, которая обусловлена высоким содержанием маннозы в гликопротеине. Синтез данного глюкопротеина интенсивно проходит в фазе активного роста дрожжей при ограничении содержания азота. Активность этих ферментов повышается при недостатке углерода в среде [9].
Анализ ферментативных свойств психрофильных дрожжей, проведенный авторами ранее, показывает результат перспективности применения этих микроорганизмов в биотехнологии. Наряду с этим были выявлены технологические преимущества культивирования психрофильных дрожжей вида Debaryomyces hansenii и Guehomyces ри1Ыат на мелассе - питательной среде из вторичных ресурсов переработки растительного сырья. Установлено, что дрожжи штаммов D. hansenii Н4651 и G. рШиШт КВ1-34 активно растут при температуре 15-25°С на питательных средах с мелассой, в том числе без источника азота - за счет поглощения присутствующих азотсодержащих компонентов -с накоплением биомассы дрожжей, использующейся для кормовых целей и в качестве продуцента ферментов. Однако на логарифмической фазе роста в аэробных условиях эти психрофильные дрожжи ассимилируют не более 1-2% простых сахаров из питательной среды, так что в культуральной жидкости остается значительная часть сахарозы [10].
Ранее проведенные исследования показали, что выращивание психрофильных дрожжей G. рЫШат КВ1-34 и D. hansenii Н4651 на мелассе помимо накопления биомассы как источника кормового белка может быть направлено на биосинтез важных для ветеринарии и кормления
сельскохозяйственных животных органических кислот, в частности пропионовой, изомасляной и других [11]. Необходимо выделить, что дрожжи обладают Р-фруктофуранозидазной активностью [12]. Фермент Р-фруктофуранозидаза выделяется в культуральную жидкость, вследствие этого происходит гидролиз сахарозы до глюкозы и фруктозы, которые в дальнейшем сбраживаются дрожжами.
Также была установлена способность штаммов дрожжей D. hansenii Н4651 и G. pullulans KB1-34 проявлять ксиланазную, целлюлазную и целлобиазную активности, что позволяет, следовательно, утилизировать олигомерные гемицеллюлозы, полученные при ферментолизе клетчатки соломы [13]. Однако при аэробном культивировании полного исчерпания редуцирующих веществ и олигосахаридов не происходит: в культуральной жидкости остаются значительные количества простых сахаров и олигомерных углеводов.
Цель настоящих исследований — определить возможности глубокой утилизации углеводов в ферментолизатах соломы психрофильными дрожжами при двухступенчатом способе культивирования: в аэробных условиях с накоплением биомассы дрожжей и далее в условиях ограниченного доступа воздуха с получением продуктов брожения.
Объекты и методы исследования
В экспериментах использовались штаммы дрожжей D. hansenii Н4651, Н433 и Н18-3 и G. pullulans KB1-34, биомассу которых наращивали до 3-5-108 кл./мл культивируя их на питательных средах, изготовленных из ферментолизатов соломы. Культивирование проводили с добавлением и без добавления сульфата аммония, солей калия и фосфора в аэробных условиях. Начальное содержание редуцирующих веществ (РВ) составляло 0,25%. Культивирование дрожжей D. hansenii и G. pullulans проводили в колбах Эрленмейера объемом 250 мл, помещенных в термостат, при температуре от 15 до 25°C и 120 об/мин.
Необходимая концентрация дрожжей достигалась за 3 суток. Остаточное содержание РВ составляло от 0,01 до 0,05%.
Затем перемешивание прекращалось, и тем самым создавались анаэробные условия для утилизации остаточных простых сахаров рассматриваемыми психрофильными дрожжами. Сбраживание остаточных сахаров продолжалось в течение 3 суток.
Состав остаточных углеводов и продуктов брожения в ферментационной жидкости для штаммов D. hansenii Н4651, Н433 и Н18-3 и G. pullulans KB1-34 анализировали методом ионно-эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на колонке с катионитом Hitachi 2614 с двойным детектированием (рефрактометр + фотометр с длиной волны 210 нм) [14, 15].
Результаты и их обсуждение
Таблица 1 - Начальная концентрация углеводов (г/л) в питательной среде из пшеничной соломы после стерилизации
Table 1. Initial concentration of carbohydrates (g/l) in a substratum from wheat after sterilization
Углеводы Концентрация
Гемицеллюлозы 0,001
Тетраозы —
Триозы —
Дисахариды 0,048
Глюкоза 0,039
Фруктоза 0,059
Анализ результатов, представленных в таблице 2, показывает, что содержание остаточных сахаров в культуральной среде после стадии брожения повышалось в ряде случаев, прежде всего, за счет дисахаридов, очевидно образующихся из присутствующих в среде не полностью гидролизованной целлюлозы и гемицеллюлоз под действием экзо-Р-целлюлолитической активности штаммов D. hansenii Н18-3 и Н433.
Таблица 2 — Концентрация сахаров (мг/л) после двух стадий культивирования дрожжей D. hansenii и G. pullulans на питательной среде из гидролизата соломы
Table 2. Concentration of sugars (mg/l) after two stages of D. hansenii and G. pullulans yeast cultivation in a substratum from wheat hydrolyzate
Углеводы Температура культивирования Штаммы
D. hansenii Н18-3 D. hansenii Н433 D. hansenii Н4651 G. pullulans KB1-34
+С* -С +С -С +С -С +С -С
Гемицел-люлозы 15°C 1,88 2,45 1,79 0,45 0,6 0,015 0,58 0
20°C 1,31 - 1,4 0,58 - - - -
25°C - - - - 2,05 - 0 0
Тетраозы 15°C 0,08 0,081 0,088 0,046 0 0,041 0 0,046
20°C 0,084 - 0,093 0,11 - - - -
25°C - - - - 0 - 0,058 0
Триозы 15°C 0,78 0,881 0,83 0,54 0 0 0 0
20°C 0,65 - 0,79 0,86 - - - -
25°C - - - - 0 - 0,007 0
Дисахариды 15°C 10,54 10,822 9,87 6,4 0,044 0 0,074 0
20°C 7,45 - 8,87 8,84 - - - -
25°C - - - - 2,16 - 0,24 0,018
Глюкоза 15° C 4,11 4,71 3,9 3,08 0,057 0,05 0,092 0
20°C 2,58 - 3,79 3,27 - - - -
25°C - - - - 0 - 0 0,008
Фруктоза 15°C 0,42 0,64 0,51 0,35 0 0 0 0
20°C 0,43 - 0,54 0,47 - - - -
25°C - - - - 0 - 0 0
*+С — с внесением солей; —С — без внесения солей
**Знак «-» — исследования не проводились
Одновременно с этим происходил процесс сбраживания: до конечной плотности 1,10-1,95% (культивирование D. hansenii Н18-3 и Н433). Содержание сахаров после сбраживания штаммами D. hansenii Н4651 и G. риИиШт КВ1-34 стало значительно ниже — близко к пределу чувствительности анализа. При этом продукция целлюлолитических экзоферментов данными штаммами могла быть менее значительной.
Внесение солей в среду заметно усиливало накопление сахаров в присутствии штамма D. hansenii Н18-3, тогда как для штаммов D. hansenii Н433 и G. риНиШт КВ1-34 наблюдался обратный эффект.
Штаммы D. hansenii Н18-3 и Н433 при брожении синтезируют этанол в сравнимых количествах. При этом максимальный выход этанола наблюдался на ферментолизате при температуре 15°С, причем для первого из этих штаммов — без внесения солей, а для второго — с солями (таблица 3). Напротив, штаммы D. hansenii Н4651, G. риНиШ^ КВ1-34, проявляли низкую метаболическую активность во всех отношениях при всех условиях.
Таблица 3 - Продукты брожения после двух стадий культивирования дрожжей D. hansenii и G. pullulans на питательной среде из гидролизата соломы
Table 3. Fermentation products after two stages of D. hansenii and G. pullulans yeast cultivation in a substratum from wheat hydrolyzate
Продукты метаболизма Темп. культ. Штамм
D. hansenii Н18-3 D. hansenii Н433 D. hansenii Н4651 G. pullulans KB1-34
+С -С +С -С +С -С +С -С
15°C 1,51 1,68 1,56 0,94 0,024 0,031 0,036 0
Этанол (%) 20°C 1,132 - 1,41 1,38 - - - -
25°C - - - - 0 - 0 0,011
15°C 0,028 0,005 0,032 0,063 0 0 0,001 0,001
Лимонная 20°C 0,019 - 0,009 0,018 - - - -
25°C - - - - 0,001 - 0 0
15°C 0,22 0,052 0,22 0,24 0,004 0 0 0,001
Яблочная 20°C 0,16 - 0,17 0,19 - - - -
25°C - - - - 0 - 0,003 0,002
15°C 0,008 0 0,008 0,011 0 0 0 0
Пировиноградная 20°C 0,005 - 0,007 0,007 - - - -
25°C - - - - 0 - 0 0
15°C 2,41 0,22 2,35 0,077 0,002 0,033 0 0,005
Янтарная 20°C 2,16 - 2,44 1,43 - - - -
25°C - - - - 0,004 - 0 0
15°C 0,173 0 0,2 0,36 0 0 0 0
Молочная 20°C 0,095 - 0,14 0,065 - - - -
25°C - - - - 0 - 0 0
15°C 0,18 0,059 0,22 0,046 0 0 0 0
Муравьиная 20°C 0,17 - 0,81 0,066 - - - -
25°C - - - - 0 - 0 0
) ч 15°C 0,74 1,95 0,78 0,19 0 0 0,002 0,003
1- v—( S ё 5 s « Уксусная 20°C 0,56 - 0,8 0,64 - - - -
25°C - - - - 0 - 0 0,034
15°C 0 0 0 0,008 0 0 0 0
Фумаровая 20°C 0 - 0 0 - - - -
25°C - - - - 0 - 0 0
15°C 5,54 5,47 5,79 2,32 0,057 0,053 0,012 0,003
Пропионовая 20°C 5,3 - 6,27 4,79 - - - -
25°C - - - - 0,014 0 0,012 0,178
15°C 0,093 0,93 0,091 0 0,162 0,135 0 0
Изомасляная 20°C 0,055 - 0,077 0,074 - - - -
25°C - - - - 0,003 0 0 0
15°C 0,048 0,062 0,05 0,029 0,017 0,015 0 0
Масляная 20°C 0,027 - 0,017 0,18 - - - -
25°C - - - - 0 0 0 0
15°C 0,187 0,09 0,15 0,049 0,075 0,071 0 0,003
Изовалериановая 20°C 0,305 - 0,191 0,127 - - - -
25°C - - - - 0 0 0,004 0
15°C 0,124 0,032 0,106 0,07 0,155 0,157 0,001 0
Валериановая 20°C 0,001 - 0,221 0,09 - - - -
25°C - - - - 0 0 0 0
На рисунке собраны данные о составе культуральной жидкости исследованных штаммов в выбранных условиях. Здесь можно видеть, что метаболическая активность трех из четырех штаммов заметно выше при 15°С, и только у штамма D. ка^ет Н433 проявляется более высокий уровень метаболитов при 20°С, причем это касается взаимосвязанных процессов проявления внеклеточной целлюлолитической активности и накопления продуктов брожения.
□ Сумма кислот И Этанол И Сумма углеводов
15°С
о- ° ° _ 1-1 П
о- о _ _ 1-1 п
□ Сумма кислот И Этанол □ Сумма углеводов
20°С
Рисунок - Состав (г/л) продуктов анаэробного культивирования психрофилъных дрожжей на гидролизатах
пшеничной соломы при 15 и 20°C Штаммы: 1 и 2 — D. hansenii Н18-3 с добавкой и без добавки солей соответственно; 3 и 4 — D. hansenii Н433 с добавкой и без добавки солей соответственно; 5 и 6 — D. hansenii Н4651 с добавкой и без добавки солей соответственно;
7 и 8 — G. pullulans KB1-34 с добавкой и без добавки солей соответственно
Figure. Composition (g/l) of psychrophilic yeasts' anaerobic cultivation products in wheat hydrolyzates at 15 and 20°C Starins of: 1 and 2 — D. hansenii Н18-3 with and without the addition of salts; 3 and 4 — D. hansenii Н433 with and without the addition of salts; 5 and 6 — D. hansenii Н4651 with and without the addition of salts; 7 and 8 — G. pullulans KB1-34 with and without the addition of salts
Присутствие солей приводило к повышению активности только штамма D. hansenii Н18-3, тогда как на остальные дрожжи соли оказали ингибирующее действие.
Стоит отметить, что во всех случаях кислотообразование в описываемой системе конкурировало со спиртовым брожением, что может служить основанием считать вторую стадию культивирования процессом с ограниченным доступом воздуха, а не полностью анаэробным.
Наблюдаемый спектр органических кислот (таблица 3) при ферментации у обоих исследованных штаммов типичен для гетероферментативного кислотообразования дрожжами с преобладанием пропионовокислого механизма брожения (пропионовая и янтарная кислоты) [12]. В незначительных количествах синтезируются лимонная, уксусная, молочная, масляная, изовалериановая и валериановая кислоты. Однозначного влияния температуры и присутствия солевой добавки не отмечено.
Выводы
При культивировании штаммов дрожжей D. hansenii Н4651, Н433 и Н18-3 и G. pullulans KB1-34 на ферментолизатах соломы наблюдается активность внеклеточных целлюлолитических ферментов, которые гидролизуют олигомерные углеводы клетчатки соломы с образованием простых сахаров как субстрата для сбраживания с получением вторичных продуктов метаболизма. При ограниченном доступе воздуха происходит гетероферментативное кислотообразование с преобладанием пропионовокислого механизма, а также спиртовое брожение с максимальным уровнем этанола в бражке до 1,6%. Все три вида метаболической активности взаимосвязаны и характеризуют физиологическое состояние дрожжей.
Проведенные исследования показали возможность боле полноценного использования ферментализатов клетчатки с использованием психрофильных дрожжей D. hansenii Н4651, Н433 и Н18-3 и G. pullulans KB1-34 с получением биомассы дрожжей и продуктов метаболизма (органических кислот и спиртов). Разрабатываемая технология даст возможность экономить энергоресурсы в микробиотехнологии указанных биопродуктов.
В дальнейших исследованиях необходима оптимизация параметров получения биомассы дрожжей, органических кислот и спиртов на ферментализатах клетчатки.
Литература
1. Robinson R.R., Feirag J., Slavin J.L. Effects of dietary arabinogalactan on gastrointestinal and blood parameters in healthy human subjects. Journal of the American College of Nutrition. 2001, V. 20, no. 4, рр. 279-285.
2. Андреева И.С., Соловьянова НА, Вечканов ВА, Терновой ВА. Разнообразие психротолерантных микроорганизмов в атмосферных аэрозолях западной Сибири // Международный научно-исследовательский журнал. 2015. № 1-1(32). С. 52-56.
3. Butinar L., Santos S., Spencer-Martins I., Oren A., Gunde-Cimerman N. Yeast diversity in hypersaline habitats. FEMS Microbiology Letters. 2005, V. 244, pp. 229-234.
4. Cocolin L., Urso R., Rantsiou K., Cantoni C., Comi G. Dynamics and characterization of yeasts during natural fermentation of Italian sausages. FEMS Yeast Res. 2006, V. 6, no. 5, pp. 692-701.
5. Lucas C., da Costa М., van Uden N. Osmoregulatory active sodium- glycerol co-transport in the halotolerant yeast Debaryomyces hansenii. Yeast. 1990, V. 6, pp. 187-191.
6. Prista C., Almagro A., Loureiro-Dias M.C., Ramos J. Physiological basis for high salt tolerance of Debaryomyces hansenii. Appl. Environ. Microbiol. 1997, V .63, pp. 4005-4009.
7. Наумович Н.И., Федоренчик А.А., Алещенкова З.М. Галофильные микроорганизмы из солевых отходов Старобинского месторождения // Биотехнология: состояние и перспективы развития: сб. тр. М., 2015. С. 400-401.
8. Кривовоз Б. Г. Производство биоэтанола на сахарном заводе // Техника и оборудование для села. 2010. № 3. C. 25-26.
9. Ермакова Н.В. Возможности переработки вторичного сырья // Известия Юго-Западного государственного университета. Серия: Техника и технологии. 2012. № 2. Ч. 1. С. 234-237.
10. Ле Ань Туан, Канарский А.В., Щербаков А.В., Чеботарь В.К. Эффективность культивирования дрожжей Debaryomyces hansenii на питательной среде из мелассы // Вестник Казанского технологического университета. 2015. Т. 18. № 13. С. 218-222.
11. Якубов Е.Р., Кручина-Богданов И.В., Канарская ЗА, Канарский А.В. Утилизация сахаров мелассы психрофильными дрожжами в анаэробных условиях // Инновационные технологии в пищевой промышленности: наука, образование и производство: сб. тр. Воронеж, 2018. С. 544-548.
12. Ле Ань Туан, Канарский А.В., Канарская ЗА., Свиридова ТВ. Эффективность синтеза в-фруктофуранозидазы дрожжами Debaryomyces hansenii при культивировании на питательной среде из мелассы // Вестник Воронежского государственного университета инженерных технологий. 2016. № 1(67). C.191-197.
13. Ле Ань Туан, Банницына Т.Е., Канарский А.В., Качалкин А.В., Максимова ИА. Ферментативная активность и эффективность синтеза белка дрожжами Debaryomyces hansenii и Guehomyces pullulans при глубинной твердофазной ферментации свекловичного жома // Вестник Казанского технологического университета 2015. № 15. С. 243-248.
14. Doyon G., Gaudreau G., St.-Gelais D., Beaulieu Y., Randall C.J. Simultaneous HPLC Determination of Organic Acids, Sugars and Alcohols. Canadian Institute of Food Science and Technology Journal. 1991, V. 24, no. 112, pp. 87-94.
15. Kruchina-Bogdanov I.V., Anossoff A.V. Organic Acid IE-HPLC in Brewing Diagnostics. 27th Symposium on High Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques (15-19 June 2003, Nice - France), 2003. P. 61.
References
1. Robinson R.R., Feirag J., Slavin J.L. Effects of dietary arabinogalactan on gastrointestinal and blood parameters in healthy human subjects. Journal of the American college of Nutrition. 2001, V. 20, no. 4, рр. 279-285.
2. Andreeva I.S., Solov'yanova NA., Vechkanov VA., Тernovoy VA. Variety of psychrotolerant microorganisms in atmospheric aerosols of western Siberia. International Research Journal. 2015, no. 1-1(32), pp. 52-56 (In Russian).
3. Butinar L., Santos S., Spencer-Martins I., Oren A., Gunde-Cimerman N. Yeast diversity in hypersaline habitats. FEMS Microbiology Letters. 2005, V. 244, pp. 229-234.
4. Cocolin L., Urso R., Rantsiou K., Cantoni C., Comi G. Dynamics and characterization of yeasts during natural fermentation of Italian sausages. FEMS Yeast Res. 2006, V. 6, no. 5, pp. 692-701.
5. Lucas C., da Costa М., van Uden N. Osmoregulatory active sodium- glycerol co-transport in the halotolerant yeast Debaryomyces hansenii. Yeast. 1990, V. 6, pp. 187-191.
6. Prista C., Almagro A., Loureiro-Dias M.C., Ramos J. Physiological basis for high salt tolerance of Debaryomyces hansenii. Appl. Environ. Microbiol. 1997, V .63, pp. 4005-4009.
7. Naumovich N.I., Fedorenchik А.А., Alechsenkova Z.M. Halophilic microorganisms from salt waste from Starobinskoe field. Biotechnology: state and development prospects. Collection of works. Moscow, 2015, pp. 400-401 (In Russian).
8. Krivovoz B.G. Bioethanol production at a sugar factory. Machinery and Equipment for the Village. 2010, no. 3, pp. 25-26 (In Russian).
9. Ermakova N.V. Recyclability options. Proceedings of South-West State University. Series Technics and Technologies. 2012, no. 2, V. 1, pp. 234-237 (In Russian).
10. Le An' Tuan, Kanarskiy A.V., Shcherbakov A.V., Chebotar' V.K. The effectiveness of the cultivation of the yeast Debaryomyces hansenii on a nutrient medium from molasses. Proceedings of the Kazan Technological University. 2015, V. 18, no. 13, pp. 218-222 (In Russian).
11. Yakubov E.R., Kruchina-Bogdanov I.V., Kanarskaya ZA., Kanarskiy A.V. Utilization of molasses sugars with psychrophilic yeasts in anaerobic conditions. Innovative technologies in the food industry: science, education and production. Collection of works. Voronezh, 2018, pp. 544-548 (In Russian).
12. Le An' Tuan, Kanarskiy A.V., Kanarskaya Z.A., Sviridova T.V. The efficiency of P-fructofuranosidase synthesis by Debaryomyces hansenii yeast when cultivated on a nutrient medium from molasses. Proceedings of the Voronezh State University of Engineering Technologies. 2016, no. 1(67), pp. 191-197 (In Russian).
13. Le An' Tuan, Banytzina T.E., Kanarskiy A.V., Kachalkin A.V., Maksimova IA. Enzymatic activity and efficiency of protein synthesis by the yeast Debaryomyces hansenii and Guehomyces pullulans during deep solid-phase fermentation of beet pulp. Proceedings of the Kazan Technological University. 2015, no. 15, pp. 243-248 (In Russian).
14. Doyon G., Gaudreau G., St.-Gelais D., Beaulieu Y., Randall C.J. Simultaneous HPLC Determination of Organic Acids, Sugars and Alcohols. Canadian Institute of Food Science and Technology Journal. 1991, V. 24, no. 112, pp. 87-94.
15. Kruchina-Bogdanov I.V., Anossoff A.V. Organic Acid IE-HPLC in Brewing Diagnostics. 27th Symposium on High Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques (15-19 June 2003, Nice - France), 2003. P. 61.
Статья поступила в редакцию 09.04.2019
