CC BY
83
ПРОМЫШЛЕННАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ И ЭКОЛОГИЯ
УДК 57.083.133
Ле Ань Туан, Т. Е. Банницына, А. В. Канарский, А. В. Качалкин, И. А. Максимова
ФЕРМЕНТАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ И ЭФФЕКТИВНОСТЬ СИНТЕЗА БЕЛКА
ДРОЖЖАМИ ВЕБАЯУОМУСЕБ НАШЕЮ/ И ОиЕНОМУСЕБ РШЪиЪА№
ПРИ ГЛУБИННОЙ ТВЕРДОФАЗНОЙ ФЕРМЕНТАЦИИ СВЕКЛОВИЧНОГО ЖОМА
Ключевые слова: пектин, свекловичный жом, дрожжи, ферментация, кормовой белок.
Установлено, что дрожжи D. hansenii штамм Н4651 и G. pullulans штамм КЕ 1-34, проявляют пектиназную активность при культивировании на питательной среде из пектина. Показана возможность глубинной твердофазной ферментации свекловичного жома дрожжами D. hansenii штамм Н4651 и G. pullulans штамм КЕ 1-34, сопровождающаяся биоконверсией пектина в кормовой белок.
Keywords: pectin, beet pulp, yeast, fermentation, feed protein.
It is found that the yeast D. hansenii H4651 and G. pullulans KB 1-34, exhibit pectinase activity when cultured on a nutrient medium of pectin. The possibility of profound solid-state fermentation of sugar beet pulp D. hansenii yeast H4651 and G. pullulans KB 1-34, accompanied by bioconversion of pectin in feed protein.
Введение
Вторичные ресурсы переработки
сельскохозяйственного сырья принято использовать как кормовые добавки животным [1]. При этом из-за низкого содержания белка и высокого содержания клетчатки это сырье используется, как правило, в кормах для жвачных животных. Традиционными методами промышленной микробиологии, предусматривающей предварительный кислотный гидролиз клетчатки и других компонентов данного сырья, возможно, повысить содержание белка и даже получить высококачественные кормовые дрожжи. По такой технологии получали кормовые дрожжи, перерабатывая лузгу подсолнуха, кукурузную кочерыжку, отруби. К сожалению, данная технология переработки энергоемкая и экологически неприемлема для окружающей среды. По этой причине биотехнологические предприятия, работающие по такой технологии, были ликвидированы. Однако проблема повышения качества кормовых добавок для животных остается весьма актуальной.
Анализируя состав вторичных ресурсов переработки сельхозсырья, можно обратить внимание на растворимость некоторых углеводных компонентов при достаточно низкой температуре и подверженность этих компонентов
ферментативному гидролизу с образованием достаточно простых по химическому строению источников углерода для ассимилирования микроорганизмами.
В частности, свекловичный жом содержит пектиновые вещества, которые классифицируют как протопектин, нерастворимое в воде вещество растительного происхождения, пектин или растворимый пектин, - водорастворимые полигалактуроновые кислоты [2,3]. Пектиновые вещества расщепляются под действием комплекса
ферментов - гидролаз, трансэлиминазы и протопектиназы. Синтез пектолитических ферментов бактериями и грибами достаточно полно изучен и их применение в пищевой промышленности дает положительные результаты [4,5].
Следует отметить, что утилизация пектин содержащего сырья с получением кормового белка ранее не рассматривалась. С технологической и экономической точек зрения при обогащении свекловичного жома белком микробиологического происхождения представляет интерес биоконверсия растворимого пектина дрожжами, синтезирующими комплекс пектолитических ферментов и, в частности, внеклеточный фермент
полигалактоураназа. При гидролитическом расщеплении водорастворимого пектина
полигалактоуроназой (пектиназой) следует ожидать образование наиболее доступных для ассимилирования дрожжами углерод содержащих соединений - галактоуроновых и
полигалактоуроновых кислот.
Применение дрожжей в качестве продуцента ферментов и кормового белка при утилизации пектина в свекловичном жоме целесообразно при реализации технологии глубинной твердофазной ферментации рассматриваемого растительного сырья, как менее энергоемким способом культивирования. При глубинной твердофазной ферментации возможно обогащение свекловичного жома, как кормовым белком, так и придание этой кормовой добавки дополнительных ценных для кормления животных свойств. В частности, в данный кормовой продукт будет содержать пектолитические ферменты, что дает возможность снизить расход этих ферментов или полностью исключить их введение в состав комбикормов.
Известно, что дрожжи в активной форме способствуют продуктивности жвачных животных:
повышается удойность крупного рогатого скота и привесы выращиваемых телят. Соответственно, сохранение в активной форме используемых для биоконверсии пектина свекловичного жома дрожжей будет способствовать повышению эффективности применения этой кормовой добавки в рационе жвачных животных [6-10].
Необходимо отметить, что обогащение свекловичного жома белком позволит эффективно использовать эту кормовую добавку не только для кормления жвачных животных, но моногастричных животных, в частности, свиней.
Установлено, что клеточные стенки дрожжей содержат хитинглюкановые комплексы, которые эффективно адсорбируют и выводят из организма животных микотоксины. Глюкоманнаны клеточной стенки дрожжей способствуют поддержанию иммунитета животных. Также показано, что дополнительное использование в рационе животных рибонуклеиновых кислот дрожжей позволяет увеличить интенсивность их роста [11-13]. Проведенный выше анализ подтверждает целесообразность применения дрожжей для биоконверсии пектина свекловичного жома методом глубинной твердофазной ферментации.
Цель настоящих исследований - определение ферментативной активности и эффективности синтеза белка аскомицетовыми Debaryomyces hansenii и базидиомицетовыми Guehomyces pullulans при глубинной твердофазной ферментации свекловичного жома
Задачи для достижения цели:
- определение влияния на продуктивность и пектиназную активность дрожжей аскомицетовых D. hansenii и базидиомицетовых G. pullulans при глубинном культивировании на питательной среде из пектина
- определение эффективности синтеза белка и ферментативной активности дрожжей аскомицетовых D. hansenii и базидиомицетовых G. pullulans при глубинном твердофазном культивировании свекловичного жома
Методическая часть
В работе использовались:
- Базидиомицетовые дрожжи Guеhomyces pullulans штамм KB 1-34 предоставленный коллекцией кафедры биологии почв Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова.
- Аскомицетовые дрожжи Debaryomyces hansenii штамм Н4651 - предоставленный коллекцией кафедры «Бионанотехнология и биоорганический синтез» Московского государственного университета пищевых производств.
Культуры дрожжей выращивали на питательной среде, приготовленной из пектина "Classic СМ 201" со степенью этерификации 82,5%, концентрацией пектина 1% с начальным содержанием редуцирующих веществ 0,5 ± 0,1 % с добавлением биогенных веществ (солей (NH4)2SO4 и KH2PO4). Определение редуцирующих сахаров проводили по методике, описанной в работе [14]. К 120 мкл исследуемой
пробы добавляли 1200 мкл дистиллированной воды и 600 мкл Б№А. Выдерживали пробы 10 минут при 100°С, затем 5 мин. при 0 °С. Далее добавляли во все пробы по 6 мл дистиллированной воды и измеряли оптическую плотность при 540 нм при ширине кюветы 5мм. В контрольный образец вместо пробы добавляли дистиллированную воду - 120 мкл.
Предварительно растворенный пектин стерилизовали в автоклаве при 120° С в течении 20 минут. Затем в стерилизованный раствор пектина добавляли (КН4)2804 и КН2Р04 исходя из начального содержания редуцирующих веществ и выхода дрожжей. В питательной среде рН составило 5,8.
Культивирование осуществлялось в колбах Эрленмейера объемом 100 мл при 20±1оС и 25±1° С при непрерывном перемешивании на шейкере инкубатора Е8-20 в течении 5 суток. Отбор проб проводили каждые 24 часа.
Определение биомассы дрожжей проводили фотометрическим методом с предварительным построением калибровочного графика. Оптическую плотность биомассы дрожжей определяли при длине волны 540 нм и ширине кюветы 5 мм [15]. Для определения количества дрожжевых клеток использовали камеру Горяева - Тома [16].
Для глубинной твердофазной ферментации использовали измельченный свекловичный гранулированный жом влажностью 8,9 % и прессованный жом с влажностью 75 %. Концентрация свекловичного жома варьировалась от 5 до 10 %. Дополнительных биогенных веществ в питательную среду не вводили. Начальное содержание РВ 2,2 % в питательной среде, рН 3,5. Культивирование осуществлялось в колбах Эрленмейера объемом 250 мл при 20±1оС и 25±1° С при непрерывном перемешивании на шейкере инкубатора Е8-20 в течении 5 суток. Отбор проб проводили каждые 24 часа.
В свекловичном жоме до и после ферментации определяли содержание сырого протеина и белка по Барштейну стандартным методом согласно ГОСТ 13496.4-93.
Активность в-фруктофуранозидазы определяли по скорости ферментативной реакции гидролиза сахарозы, которую устанавливали по количеству образовавшегося инверта в реакционной жидкости [17].
Определение ксиланазной активности. Исследование ксиланазной активности проводили в трех повторностях по методу [18].
Определение целлюлазной активности. Исследование целлюлазной активности проводили в трех повторностях по методу ШРАС [19].
Результаты и обсуждение
Анализ полученных результатов исследований, представленных на рисунках 1 и 2, показывает, что дрожжи G.pullulans и D. hansenii при культивировании на питательной среде из пектина с биогенными веществами имеют некоторые отличия в физиологической активности. При этом на
физиологическую активность дрожжей G. pullulans и D. hansenii оказывает влияние температура культивирования.
Характер роста количества клеток и накопления биомассы дрожжей G. pullulans и Б. hansenii при культивировании на питательной среде из пектина с биогенными веществами при температуре культивирования 20оС вполне сопоставим. По количеству клеток и биомассы дрожжей можно сделать вывод о том, что продолжительность лаг-фазы и экспоненциальной фазы при этой температуре культивирования рассмотренных дрожжей незначительна. Дрожжи в. pullulans и Б. hansenii в рассматриваемых условиях достаточно быстро адаптируются к пектину, как источнику углерода, и после 2 - 3 часов культивирования рост дрожжей и накопление биомассы происходит в фазе линейного роста.
Переходная и стационарная фазы роста количества клеток дрожжей G. pullulans и Б. hansenii в рассматриваемых условиях культивирования в период до 120 час. достоверно не выражены. Накопление биомассы дрожжей G. pullulans и D. hansenii в рассматриваемых условиях культивирования практически заканчивается после 120 час.
а
Рис. 1 - Влияние продолжительности культивирования при температуре 20оС (1) и 25оС (2) на рост клеток дрожжей О. риЫиЬаш (а) и Б. Нашепи (б) на питательная среда из пектина с биогенными веществами
Повышение температуры культивирования дрожжей G. pullulans и D. hansenii с 20 о С до 25 о С существенно снижает физиологическую активность этих дрожжей. Для дрожжей G. pullulans при температуре культивирования 25 о С на питательной среде из пектина характерна достаточно
продолжительная лаг - фаза и экспоненциальная фаза роста дрожжей. Рост количества клеток дрожжей G. pullulans практически заканчивается после 70 час. культивирования и их количество ниже, чем при культивировании этих дрожжей при температуре 20 о С.
Физиологическая активность дрожжей D. hansenii при температуре культивирования 25оС несколько выше физиологической активности дрожжей G. pullulans. Для дрожжей D. hansenii в рассматриваемых условиях культивирования практически не выражены лаг - фаза и экспоненциальная фазы роста и деление клеток продолжается в течении 120 час.
Рис. 2 - Влияние продолжительности культивирования при температуре 20оС (1) и 25оС (2) на синтез биомассы дрожжей О. ри11и1аш (а) и Б. Натепи (б) на питательной среде из пектина с биогенными веществами
Следует отметить, что росту числа клеток и синтезу биомассы дрожжей G. pullulans и D. hansenii при культивировании на питательной среде из пектина с биогенными веществами не соответствует потребление редуцирующих веществ из питательной среды (рис. 3). В частности, при культивировании дрожжей G. pullulans на рассматриваемой питательной среде при температурах 20 и 25оС в течение 50 час. Наблюдаемый выход дрожжей по числу клеток и накоплению биомассы выше потребления редуцирующих веществ. Более того, продолжение культивирования этих дрожжей при температуре 25о С приводит к повышению содержания редуцирующих веществ в культуральной жидкости
а
б
б
на фоне снижения продуктивности этих дрожжей при температуре культивировании 20 о С.
О потреблении редуцирующих веществ D. Натвпи при культивировании на питательной среде из пектина с биогенными веществами также достоверно судить не представляется возможным (рис. 3 б). Культивирование этих дрожжей на рассматриваемой питательной среде при температуре 25 о С вызывает большее потребление редуцирующих веществ, чем при температуре 20 о С и, следовательно, должно приводить к более высокой продуктивности D. Натвпи в данных условиях. Однако, исходя из тенденций роста числа клеток и синтезу биомассы продуктивность дрожжей Б. Натвпи при культивировании 20о С выше, чем при культивировании 25о С.
а
03 0 2 01
0 -,-,-,-,-,-,-
0 20 40 £0 30 100 120 140 Продолжительность культиви ровани я, ч
б
02 01 0
0 20 40 £0 S0 130 120 143 Продолжительность культивирования, ч
Рис. 3 - Влияние продолжительности культивирование при температуре 20оС (1) и 25оС (2) дрожжей G. pullulans (a) и D. hansenii (б) на содержание редуцирующих веществ в питательной среде из пектина с биогенными веществами
Несоответствие продуктивности дрожжей G. pullulans и D. hansenii потреблению редуцирующих веществ можно объяснить дополнительным образованием РВ в результате гидролиза пектина ферментами, синтезируемыми этими дрожжами. В таблице 1 представлены результаты определения пектиназной активности дрожжей G. pullulans и D. hansenii штаммов - 4651 при культивировании на питательной среде из пектина. Анализ этих результатов показывает, что пектиназная активность этих дрожжей зависит от температуры культивирования. С повышением температуры культивирования дрожжей с 20 до 25о С пектиназная активность дрожжей увеличивается. При этом в рассматриваемых условиях пектиназная активность
аскомицетовых дрожжей Б. Иатгпи выше пектиназной активности базидиомицетовых дрожжей G. ри11и1ат.
Представленные выше результаты исследований положены в основу изучения возможности утилизации пектина, содержащегося в свекловичном жоме, с получением кормового белка твердофазной ферментацией дрожжами Б. Натвпи и G. ри11и1ат
Таблица 1 - Пектиназная активность дрожжей О. ри11и1ат штамм КВ 1-34 и Б. Натепи штамм Н4651 на питательной среде из пектина
Температура Пектиназная
Штамм культиви- активность,
рования, оС ПгА/ml
D. hansenii 20 26,4
(Н4651) 25 32,0
G. pullulans 20 21,6
(KB 1-34) 25 28,0
Проведенные исследования показали, что на эффективность синтеза кормового белка при глубинной твердофазной ферментации
рассматриваемыми дрожжами существенное влияние оказывает способ консервирования свекловичного жома (табл. 2). При культивировании дрожжей Б. Натвпи и G. ри11и1ат на питательной среде, содержащей 10 % измельченного гранулированного свекловичного жома
синтезируется меньше белка, чем при культивировании этих дрожжей на питательной среде, приготовленной из прессованного жома.
Следует отметить, что при культивировании дрожжей Б. Натвпи и G. ри11и1ат на питательной среде, содержащей измельченный гранулированный жом, повышение температуры культивирования с 20 до 25о С способствовало повышению выхода кормового белка.
Снижение концентрации в питательной среде измельченного прессованного свекловичного жома с 10 до 5 % способствует повышению эффективности синтеза белка дрожжами Б. Натвпи и G. ри11и1ат\ Исследования показали, что максимальный выход белка биоконверсией пектина, присутствующего в свекловичном прессованном жоме, можно получить при температуре культивирования дрожжей G. ри11и1ат 20 оС и концентрации измельченного свекловичного жома 5 %.
Биоконверсии пектина в кормовой белок дрожжами Б. Натвпи и G. ри11и1ат способствует пектиназная активность этих дрожжей (табл. 3).
Видимо в рассматриваемых условиях культивирования дрожжи G. ри11и1ат начинают проявлять целлюлазную и ксиланазную активность. Следует полагать, что синтезируемые этими дрожжами ферменты способствуют, прежде всего, разрушению углеводной матрицы свекловичного жома и, соответственно, растворению пектина в культуральной жидкости. В совокупности с другими факторами это способствует более эффективной конверсии пектина в кормовой белок при глубинной твердофазной ферментации свекловичного жома дрожжами G. Ри11и1ат.
Таблица 2 - Синтез белка дрожжами Б. Нашепи, штамм Н4651 и О. риЫиЬаш штамм КВ 1-34 при глубинной твердофазной ферментации свекловичного жома
Штамм Температура культивирования, оС Концентрация жома при культивировании, % Содержание сырого протеина, % Содержание белка по Барштейну, %
*Свекловичный гранулированный жом влажностью 8,9 %
D. hansenii (Н4651) 20 10 9,22 9,04
D. hansenii (Н4651) 25 10,51 9,72
G. pullulans (KB 1-34) 20 9,17 8,64
G. pullulans (KB 1-34) 25 10,57 10,48
*Свекловичный прессованный жом с влажностью 75 %
D. hansenii (Н4651) 20 10 13,24 11,50
G. pullulans (KB 1-34 13,35 12,17
D. hansenii (Н4651) 5 15,77 15,30
G. pullulans (KB 1-34 16,57 16,20
* Исходное содержание сырого протеина в свекловичном жоме 7,02%, содержание белка по Барштейну 5,95% ** Продолжительность культивирования 120ч без дополнительного введения биогенных веществ
Таблица 3 - Ферментативная активность дрожжей Б. Натепи штамм Н4651 и О. ри11и1аш штамм КВ 1-34.при глубинном твердофазном культивировании свекловичного жома *
Штамм Пектиназная активность, ПгА/ml Ксиланазная активность, IU/ml Целлюлазная активность, FPU/ml
D. hansenii (Н4651) 33,8 - -
G. pullulans (KB 1-34) 37,7 1,68 0,074
*Концентрация измельченного свекловичного жома в питательной среде 5%, температура культивирования 20 о С, продолжительность культивирования 120ч.
Выводы
Установлено, что дрожжи D. hansenii штамм Н4651 и G. pullulans штамм KB 1-34, проявляют пектиназную активность при культивировании на питательной среде из пектина.
Показана возможность глубинной твердофазной ферментации свекловичного жома дрожжами D. hansenii штамм Н4651 и G. pullulans штамм KB 1-34, сопровождающаяся биоконверсией пектина в кормовой белок. При глубинной твердофазной ферментации свекловичного жома дрожжи G. pullulans штамм KB 1-34, проявляют также ксиланазную и целлюлазную активность.
Литература
1. Р.А. Шурхно. Ф.Ю. Ахмадуллина, А.С. Сироткин, Л.Ф. Галанцева, О.Н. Ильинская, Вестник Казанского технологического университета,!!, 21. 223-228 (2014).
2. С.Т. Минзанова, В.Ф. Миронов, А.И. Коновалов, А.Б. Выштаколюк, О.В. Цепаева, А.З. Миндубаев, Л.Г. Миронова, В.В. Зобов, Пектины из нетрадиционных источников: технология, структура, свойства и биологическая активность. Печать-Сервис-ХХ1век, Казань, 2011. 224 с.
3. М.В. Харина, Л.М. Васильева, В.М. Емельянов, Вестник Казанского технологического университета, 17, 24. 159-162 (2014).
4. С.Н. Бутова. Автореф. дис. д-ра биол. наук, МГУПП, Москва, 2005. 11 - 12 с.
5. М.Ю. Шаламитский В сб. Инновации в науке, Новосибирск, 2014. С. 35-41.
6. T. M. Hill, H. G. Bateman II, J. M. Aldrich, PAS, and R. L. Schlotterbeck Oligosaccharides for Daily Calves. The Professional Animal Scientist 2008, 24 p.460-464
7. V. K. Silva, J. Della Torre da Silva, K. A. A. Torres, D. E. de Faria Filho, F. Hirota Hada, V. M. Barbosa de Moraes. J. Appl. Poult. Res. 18, 530-540 (2009).
8. Пат. США 3.909.352 (1975).
9. Пат. США 20060134759 (2006).
10. Пат США 4.122.196 (1978).
11. D. Brown, S. Gordon, Immunity, 19, 311-315 (2003).
12. J-P Jouany, A. Yiannikouris, G. Bertin, Archiva Zootechnica, S, 26 -50 (2005).
13. M. Castillo, S. M. Martín-Orúe, J. A. Taylor-Pickard, J. F. Pérez, J. Gasa, JANIMSCI, 86, 94-101 (2008).
14. Ю.А. Морозова, Е. В. Скворцов, Ф. К. Алимова, А. В. Канарский, Вестник Казанского технологического университета, 15, 19, 120-122 (2012).
15. Б. А. Чакчир, Г. М. Алексеева, Фотометрические методы анализа: Методические указания. СПХФА, СПб, 2002. 44 с.
16. А.И. Нетрусов, М.А. Егорова, Л.М. Захарчук и др, Практикум по микробиологии: Учеб пособие для студ. высш. учеб. заведений. Издательский центр "Академия", Москва, 2005. 608 с.
17. Г.В. Полыгалина, В.С. Чередниченко, Л.В. Римарева, Определение активности ферментов. ДеЛи принт, Москва, 2003. 375с.
18. J. Konig, R. Grasser, H. Pikor, K. Vogel, Anal Bioanal Chem, 5, 8, 80-87 (2002).
19. Measurement of cellulose activities, Pure & Appl. Chem International Union of Pure and applied Chemistry. 2, 257268.
© Ле Ань Туан - аспирант каф. Пищ. БТ КНИТУ, letuan.tnvn@gmail.com; Т. Е. Банницына - аспирант каф. Пищ. БТ КНИТУ, tatbannic@mail.ru; А. В. Канарский - профессор каф. Пищ. БТ КНИТУ, д.т.н, alb46@mail.ru; А. В. Качалкин - м.н.с, к.б.н, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, kachalkin_a@mail.ru; И. А. Максимова - м.н.с, к.б.н, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, maximova.irina@gmail.com.
© Le Anh Tuan - graduate student of Food Biotechnology, Kazan National Research Technological University. letuan.tnvn@gmail.com; Т. Е. Bannicina - graduate student of Food Biotechnology, Kazan National Research Technological University. tatbannic@mail.ru; A. V. Kanarskiy - Dr. Sci. (Tech.), Prof., Department of food engineering in small enterprises, KNRTU alb46@mail.ru; A. V. Kachalkin, Lomonosov Moscow State University, kachalkin_a@mail.ru; I. A. Maximova, Lomonosov Moscow State University, maximova.irina@gmail.com.
