CC BY
47
УДК 664.411:674.032.14:664.642
И. А. Галяутдинова, А. В. Канарский, З. А. Канарская, А. Г. Кузнецов
ЭФФЕКТИВНОСТЬ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ДРОЖЖЕЙ DEBARYOMYCES HANSENII
И GUEHOMYCES PULLULANS НА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ ИЗ АРАБИНОГАЛАКТАНА
Ключевые слова: арабиногалактан, психротолерантные дрожжи, культивирование, в-галактозидазная активность,
продуктивность.
Установлено, что дрожжи D. hansenii и G. pullulans наиболее продуктивны при культивировании на питательной среде из арабиногалактана при температуре культивирования 20 OC и проявляют /в-галактазидазную активность. Определено, что при культивировании на питательной среде из арабиногалактана при температуре 20 OC наибольшую в-галактазидазную активность и, соответственно, продуктивность проявляет штамм дрожжи G. pullulans KB ¡_34^
Keywords: arabinogalactan psychrotolerantyeast cultivation, в-galactosidase activity, productivity.
It is found that the yeast D. hansenii and G. pullulans most productive when cultured on a nutrient medium at a temperature of 200C arabinogalactan cultivation and в-galaktazidaznuyu exhibit activity. Determined that when cultured on a nutrient medium at a temperature of 200C arabinogalactan в-galaktazidaznuyu greatest activity and, accordingly, exhibits a productivity of the yeast strain G. pullulans KB 1-34.
Актуальность. Экономическая эффективность биотехнологического производства определяется прежде всего теплоэнергетическими затратами на приготовление питательных сред и культивирование микроорганизмов. Кислотный гидролиз
лигноцеллюлозного сырья для получения простых сахаров, используемых при приготовлении питательных сред для культивирования микроорганизмов, в частности, дрожжей, является экономически не эффективным. Следует отметить, что этот способ подготовки питательных сред весьма опасен и для окружающей среды.
В этой связи перспективным источником углерода для культивирования микроорганизмов в промышленности являются водорастворимые компоненты растительного сырья и, в частности, арабиногалактан древесины литвенницы.
Арабиногалактан - это полисахарид растительного происхождения, в основном содержится в древесине лиственницы, растворим в воде [1]. Разветвленная молекула арабиногалактана состоит из звеньев арабинозы и галактозы 1:6. химическая формула: [(С5Н8О4)(СбН10О5)6] древесины отличается. Цепочка арабиногалактана состоит из участков р-Э-галактопиранозы. Данный полисахарид является разветвленным. Участки р-Э-галактопиранозы арабиногалактана лиственницы соединены 1-3 гликозидными связями, к главной цепи присоеденены боковые участки а- и р-Ь-арабинофуранозы гликозидными связями 1-6.
Методом кислотного гидролиза с последующей хроматографией полученных моносахаридов на бумаге в тонком слое был подтвержден химический состав арабиногалактана и его физико-химические свойства. В продуктах гидролиза обнаружены галактоза и арабиноза, значение молекулярной массы арабиногалактана, полученного в промышленных условиях из щепы древесины лиственницы, составляет 42 кДа [2]. Макромолекулы арабиногалактаны благодаря низким значениям вязкости водных растворов
находятся в очень компактной сферической форме [3,4]. Арабиногалактан содержит гидроксильные, альдегидные, а также карбоксильные группы. Полифункциональная макромолекула
арабиногалактана проявляет полиэлектролитные свойства. Арабиногалактаны имеют высокую степень полидисперсности [5], по данным рентгенодифракционного анализа рабиногалактан древесины лиственницы сибирской - аморфное вещество, в макромолекуле которого отсутствуют структурированные области [6]. Находясь в свободном состоянии в древесине, арабиногалактан способен взаимодействовать с белками с образованием гликопротеинового комплекса, с лигнином - лигноуглеводного [7].
Физико-химические свойства арабиногалактана обусловливают биоконверсию этого природного полимера с получением соответствующих биологически активных веществ, применяемых в медицине, ветеринарии, сельском хозяйстве, пищевой промышленности, а также при кормлении животных [8].
Растворимость арабиногалактана является предпосылкой к применению этого углевода в питательных средах для культивирования микроорганизмов. Проведены исследования, результаты которых указывают на способность дрожжей Saccharomyces cerevisiae усваивать арабиногалактан древесины лиственницы сибирской [9]. Рассмотрены особенности биоконверсии арабиногалактана макромицетами и
микромицетами. Установлено, что внесение арабиногалактана в качестве стимулирующей биодобавки при биоконверсии остатков древесины макро- и микромицетами положительно влияет на их рост и развитие. Использование арабиногалактана в качестве источника углеводов при выращивании фитопатогенных микромицетов и посевного материала высших грибов позволяет сократить использование глюкозы в стандартных питательных средах [10].
Анализ проведенных исследований показывает перспективность биоконверсии водорастворимового компонента древесины лиственницы
арабиногалактана психротолерантными дрожжами с получением белков и биологически активных веществ [11,12].
Цель исследований - определение эффективности культивирования психротолерантных дрожжей при низких температурах культивирования на питательных средах, приготовленных из арабиногалактана древесины лиственницы.
Для достижения указанной цели решались следующие задачи:
1. Определение влияния температуры культивирования психротолерантных дрожжей на кинетические характеристики и выход биомассы при культивировании на питательной среде из арабино галактана.
2. Определение ферментативной активности психротолерантных дрожжей при культивировании на питательной среде из арабиногалактана.
Методическая часть
В работе использовались психротолерантные дрожжи:
1. Базидиомицетовые дрожжи - штамм G. pullulans KB 1-34, который был предоставлен Московским государственным университетом им. М.В.Ломоносова, коллекция кафедры биологии почв.
2. Аскомицетовые дрожжи D. Hansenii штаммы:
- Н433, предоставленный ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии (г. Пушкин), Всероссийская коллекция непатогенных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения;
- Н4651 - предоставленный Московским государственным университетом пищевых производств, коллекция кафедры «Бионанотехнология и биоорганический синтез»;
- Н18-3 - предоставленный Московским государственным университетом им. М.В.Ломоносова, коллекция кафедры биологии почв. Штамм выделен 6.06.2011 из купола муравейника колонии муравьев Formica aquilonia в Новосибирской области.
Культивирование дрожжей проводили на питательной среде, приготовленной из арабиногалактана с концентрацией РВ 0,16 %. Арабиногалактан предоставлен Санкт-
Петербургским государственным университетом промышленных технологий и дизайна.
В питательные среды вносили минеральные вещества KH2PO4 и (NH4)2SO4. Количество вносимых солей рассчитывалось в соответствие с ожидаемым выходом биомассы дрожжей. Значение pH составило 5,8.
Условия культивирования дрожжей.
Культивирование осуществлялось в колбах Эрленмейера объемом 100 мл при 15±1 оС, 20±1оС и 25±1o C при непрерывном перемешивании на шейкере инкубатора ES-20, помещенном в
термостат, в течении 6 суток. Отбор проб проводили каждые 24 часа.
Редуцирующие вещества определяли по методике, приведенной в работе [13,14].
Определение биомассы дрожжей проводили фотометрическим методом с предварительным построением калибровочного графика. Оптическую плотность биомассы дрожжей определяли при длине волны 540 нм и ширине кюветы 5 мм [15].
Для определения количества дрожжевых клеток использовали камеру Горяева - Тома [16].
Определение кинетических характеристик и выхода биомассы проводили методами, принятыми в исследованиях [17].
Р-галактозидазную активность дрожжей определяли в трех повторностях по скорости ферментативной реакции гидролиза лактозы, которую устанавливали по количеству образовавшегося глюкозы в реакционной жидкости [18].
Примененный в работе метод определения глюкозы основан на окислении D-глюкозы глюкозооксидазой до глюкуроновой кислоты с образованием перекиси водорода, которая под действием пероксидазы реагирует с 4-аминоантипирином и фенолом с образованием соединения красного цвета. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации глюкозы в исследуемом образце и измеряется фотометрически при длине волны 540 нм [19].
Эксперименты проводились в трех повторностях, статистическая обработка результатов
экспериментов проводилась с помощью программы Excel Microsoft Office в соответствии с использованными в работе стандартами.
Результаты и обсуждение
Исследования показали, что рост числа клеток и количество биомассы дрожжей вида D. hansenii и G. pullulans KBj-34 зависит от штамма дрожжей и температуры культивирования на питательной среде из арабиногалактана. Оптимальной температурой культивирования для всех штаммов дрожжей на питательной среде из арабиногалактана является температура 20оС. Понижение температуры культивирования до 15оС и увеличение температуры культивирования до 25оС приводит к снижению удельной скорости роста культур и повышению продолжительности генерации. Закономерности изменения выхода биомассы дрожжей от температуры культивирования в общем случае не наблюдаются (табл. 1).
Наиболее продуктивен при температуре культивирования 20 С штамм дрожжей G. Pullulans KB1-34. По сравнению с другими штамма дрожжей в этих условиях культивирования для штамма дрожжей G. Pullulans KB1-34 наблюдается наибольшая удельная скорость роста, низкая продолжительность генерации и высокий выход биомассы.
Штаммы дрожжей D. hansenii Н4651, D. hansenii Н433, D. hansenii Hj8-3 менее продуктивны, чем штамм G. Pullulans KBj-34. Кинетические
характеристики и выход биомассы этих штаммов дрожжей практически сопоставимы.
Для всех исследованных штаммов дрожжей в начальный период культивирования характерно увеличение содержания редуцирующих веществ в питательной среде из арабиногалактана (рис. 1). По истечении 24 часов культивирования рост содержания редуцирующих веществ в питательной среде прекращается и наблюдается потребление, соответствующее росту числа клеток и количеству биомассы.
Таблица 1 - Кинетические характеристики роста и выход дрожжей Б. hansenii и G. ри1Шат КВ1-34 при культивировании на питательной среде из арабиногалактана
Установленная закономерность указывает на проявление в рассматриваемых условиях культивирования дрожжей Б. hansenii и G. pullulans КВ1-34 ферментативной активности,
способствующей ферментативному гидролизу
арабиногалактана с образованием редуцирующих веществ.
Исследованиями установлено, что дрожжи Б. hansenii и G. ри11и1ат КВ1-34 проявляют Р-галактазидазной активностью, которая зависит от температуры культивирования. Наибольшая р-галактазидазная активность наблюдается у дрожжей штамм G. риПи1ат' КБ1-34 при температуре культивирования 20оС (табл. 2). Следует отметить, что для этого штамма дрожжей характерны и преимущества по кинетическим характеристикам и выходу биомассы дрожжей.
РВ, %
0,21
0,2 0,19
0 Продолжительность 6
культивирования, сут.
Рис. 1 - Влияние продолжительности культивирования штаммов дрожжей G. ри1Шат КВ 1-34 (1), D. hansenii Н (2), D. hansenii Н (3),
433 18-3
D. hansenii К4 (4) при температуре 20оС на
содержание редуцирующих веществ в питательной среде из арабиногалактана РВ
Таблица 2 - р-галактазидазная активность дрожжей G.pullulans и Б. hansenii при культивировании на питательной среде из арабиногалактана
Штамм дрожжей Температура культивирования, оС Р-галактозидазная активность, ед/см3
О. риШ1ат КБ 1-34 15 0,712
20 0,813
25 0,162
Б. Натеши Ню 15 0,162
20 0,405
25 0,162
Б. hansenii Н18-3 15 0,162
20 0,162
25 0,162
Б. hansenii Н4651 15 0,162
20 0,162
25 0,162
штамм Показатели * Температура культивирования, о С
15 20 25
О. риЫи1аш КБ 1_34 ч-1 0,027 ± 0,002 0,030 ± 0,001 0,025 ± 0,001
Q, ч 25,67 ± 1,02 23,10 ± 0,98 27,72 ± 1,12
В, % 8.9 ± 0,34 17,0 ± 0,56 13,0 ± 0,45
Б. НашеШ Н 433 ^ ч-1 0,027 ± 0,002 0,027 ± 0,001 0,024 ± 0,002
Q, ч 25,66 ± 1,21 25,66 ± 1,15 28,87 ± 1,37
В, % 7.2 ± 0,22 8.3 ± 0,31 10,0 ± 0,47
Б. hansenii Н 18-3 ^ ч-1 0,027 ± 0,002 0,028 ± 0,003 0,022 ± 0,001
Q, ч 25,67 ± 0,77 24,74 ± 0,62 31,50 ± 0,87
В, % 9,0 ± 0,20 8,0 ± 0,17 5.5 ± 0, 14
Б. НашеШ К 4651 ^ ч-1 0,028 ± 0,002 0,029 ± 0,003 0,026 ± 0,002
Q, ч 24,75 ± 0,65 23,89 ± 0,47 26,65 ± 0,36
В, % 6.5 ± 0,20 7.5 ± 0,18 10,0 ± 0,20
* удельная скорость роста; Q- продолжительность генерации; В - выход биомассы дрожжей
Выводы
1. Установлено, что дрожжи D. hansenii и G. pullulans KB1-34 наиболее продуктивны при культивировании на питательной среде из арабиногалактана при температуре культивирования 20 °C.
2. Показано, что дрожжи D. hansenii и G. pullulans KB1-34 проявляют в-галактазидазную активность при низкотемпературном культивировании на питательной среде из арабиногалактана.
3. Определено, что при культивировании на питательной среде из арабиногалактана при температуре 20 °C наибольшую в-галактазидазную активность и, соответственно, продуктивность проявляет штамм дрожжи G. pullulans KB 1-34.
Литература
1. С.А. Кузнецова, А.Г. Михайлов, Г.П. Скворцова. Химия растительного сырья. 1. С. 53-58. (2005).
2. А.М. Бочек, Н.М. Забивалова, Л.Г. Махотина. Инновационные технологии в российском лесном секторе: путь к «зеленой» экономике. Материалы конференции "Лиственница - проблемы комплексной переработки" (6 окт. 2011, СПб ГТУРП). - Нью-Йорк, Женева. С. 39-47. (2012).
3. С.М. Grieshop, E.A. Flickinger, G.C. Fahey. Journal of Nutrition. Vol. 132, №. 3. Pp. 478-482. (2002).
4. R.R. Robinson, J. Feirtag, J.L. Slavin. Journal of the American College of Nutrition. Vol. 20, №. 4. Pp. 279-285. (2001).
5. R.R. Robinson, J. Feirtag, J.L. Slavin. Journal of the American College of Nutrition. Vol.20, № 4. Pp. 279-285. (2001).
6. Б.А. Фадеев, М.Г. Мутовина, Т.А. Бондарева Целлюлоза. Бумага. Картон. №2. С. 64-69. (2009).
7. Антонова, Г.Ф. Химия древесины. №4. С. 97-100. (1977).
8. Г.ВМитина, С.В.Сокорнова, Л.Г.Махотина. Вестник защиты растений.- № 3. С.28 -32. (2012).
9. Неверова Н.А., Медведева Л.А., Беловежец Е.Н., Бабкин В.А. Химия растительного сырья. № 4 С. 57-62. (2010).
10. Митина Г. В., Сокорнова С. В., Титова Ю. А., Махотина Л. Г., Кузнецов А. Г., Первушин А. Л. Известия Российского государственного педагогического университета имени А.И. Герцена. СПб., № 163. С. 69-79. (2013).
11. Ле Ань Туан, Банницына Т.Е., Канарский А.В., Качалкин А.В., Максимова И.А. Вестник технол. уни-та. № 15. с. 243-248. (2015).
12. Ле Ань Туан, Канарский А.В., Щербаков А.В., Чеботарь В.К. Казан. технол. уни-та. Т. 18, № 13. С. 218-222. (2015).
13. Ю.А. Морозова, Е. В. Скворцов, Ф. К. Алимова, А. В. Канарский, Казан. технол. уни-та. Т 15, № 19, с. 120-122. (2012).
14. J. Konig, R. Grasser, H. Pikor, K. Vogel, Anal Bioanal Chem., 5, 8, 80-87. (2002).
15. Б.А. Чакчир, Г. М. Алексеева, Фотометрические методы анализа: Методические указания. СПХФА. СПб. 44 с. (2002).
16. Е.А. Скиба. БТИ. Бийск: Изд. Алт. гос. техн. ун-та.. 121 с. (2010).
17. А.И. Нетрусов, М.А. Егорова, Л.М. Захарчук. Практикум по микробиологии: Учеб пособие для студ. высш. учеб. заведений. Издательский центр "Академия", Москва. 608 с. (2005).
18. Г.В. Полыгалина, В.С. Чередниченко, Л.В. Римарева, Определение активности ферментов. ДеЛи принт. М. 375 с. (2003).
19. Инструкция по применению набора реагентов для определения глюкозы в биологических жидкостях глюкозооксидазным методом ООО «Агат-Мед». М. 4 с. 2000
© И. А. Галяутдинова - магистр, каф. пищевой биотехнологии, КНИТУ, [email protected]; А. В. Канарский - проф., д.т.н., каф. пищевой биотехнологии, КНИТУ, [email protected]; З. А. Канарская - доцент, каф. пищевой биотехнологии, КНИТУ, [email protected]; А. Г. Кузнецов - к.т.н., науч. сотрудник каф. "Технологии целлюлозы и композиционных материалов", Высшая школа технологии и энергетики. Санкт-Петербургского гос. унив. промышленных технологий и дизайна, [email protected].
© I. А. Galyautdinova - Master, Department of Food Biotechnology, KNRTU, [email protected]; A. V. Kanarskiy - Dr. Sci. (Tech.), Prof., Department of Food Biotechnology, KNRTU,[email protected]; Z. A. Kanarskaya - Ph.D, Associate Professor, Department of Food Biotechnology, KNITU, [email protected]; A. G. Kuznetsov - PhD, Assoc. Prof., Senior researcher at Pulp and Composites Technology department, Higher School of Technology and Energy of Saint Petersburg State University of Industrial Technology and Design, [email protected].
