CC BY
42
УДК 57.083.133
Ле АнТуан, А. В. Канарский, С. К. Зарипова, Л. А. Иванова, И. В. Кручина-Богданов
ЭФФЕКТИВНОСТЬ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ДРОЖЖЕЙ
DEBARYOMYCESHANSENII И GUEHOMYCES PULLULANS
НА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ ИЗ СУЛЬФИТНЫХ ЩЕЛОКОВ
Ключевые слова: сульфитные щелока, психротолерантные дрожжи, культивирование, кинетические характеристики, выход
биомассы.
Показано, что скорость роста и выходпсихро- и осмотолерантных дрожжей DebaryomyceshanseniiH^s^ Guehomycespullulans КВ1-34при культивировании на питательных средах из сульфитных щелоков превышает аналогичные показатели дрожжей Candidatropicalis КБПУ-4883,используемых в производствах кормового белка на этих же средах. Установлено, что штамм дрожжей D.hansenii Н4651 при культивировании на питательных средах из сульфитных щелоков, содержащих концентрации РВ до 3%, при температуре 20оС перспективен для использования в промышленности.
Keywords: sulfite cellulose liquor, psychrotolerantyeast, fermentation, kinetic characteristics, biomass yield.
Osmo- and psychrotolerant yeast strains Debariomyceshansenii H4651 and Guehomyces pullulans KB1-34are demonstrated to have higher biomass yield and growth rate on sulfite spent liquor based media than yeast Candida tropicalis strain KBPU 4883 widely used in single cell protein industry. The strain D.hansenii H4651 was proved advantageous in further industrial applications.
Введение
Вторичные ресурсы переработки растительного сырья, в том числе отходы перерабатывающих производств агропромышленных, целлюлозно-бумажных, пищевых и химических предприятий, а также предприятий легкой промышленности можно рассматривать в качестве основных источников углерода питательных сред для крупнотоннажного биосинтеза. Применение вторичных ресурсов переработки растительного сырья в промышленности открывает, помимо всего прочего, возможность комплексного использования растительного сырья со снижением антропогенной нагрузки на окружающую среду.
Сульфитные щелока, получаемые при делигнификации однолетнего и многолетнего растительного сырья в производстве целлюлозы, представляют собой источник низкомолекулярных углеводов, которые образуются при гидролитическом распаде клетчатки. Эти гидролизаты растительного сырья представляют собой смесь различных органических соединений, в том
числеассимилируемых дрожжеподобными грибами: углеводов гексоз (глюкоза, фруктоза, манноза, галактоза), пентоз (ксилоза, арабиноза) и дезокси-гексоз (рамноза, фукоза), а также органических кислот (уксусная кислота, альдоновые и уроновые кислоты) — и уже доказали свою значимость в промышленности кормовых дрожжей [1—4].
Большинство известных в промышленной практике видов дрожжей способны усваивать только простые сахара (моно- и дисахариды) и не обладают способностью ассимилировать олигосахариды и тем более полисахариды, из-за чего последние теряются для производства, поступая при этом в сточные воды целлюлозно-бумажных предприятий. В связи с этим перспективным представляется подбор новых специализированных штаммов дрожжей, способных
наряду с простыми сахарами усваивать и олигомерные углеводы.
При этом на скорость накопления биомассы дрожжей большое влияние оказывает концентрация РВ в среде. В промышленных условиях при содержании РВ выше 1,8-2,0% происходит неполная утилизация углеводов и снижается интенсивность роста и размножения дрожжевой культуры. Представляет промышленный интерес поиск дрожжей, способных эффективно развиваться при концентрации РВ в сусле 3-5%. В данном случае следует ожидать повышения производительности аппаратов, сокращения объема сточных вод в производстве кормового продукта.
Ранее авторами показана эффективность культивирования психротолерантных дрожжей D.hansenii и G^ullulansm питательных средах с мелассой и целесообразность применения этих дрожжей для получения кормового белка из свекловичного жома [5,6].
Цель настоящих исследований - определение эффективности культивирования дрожжей психро-толерантных дрожжей D.hansenii и G. Pullulans на питательных средах из сульфитных щелоков.
Для достижения цели решались следующие задачи:
1. Определение влияния температуры культивирования и концентрации РВ в питательных средах из сульфитных щелоков на кинетические характеристики роста и выход биомассы психротолерантных дрожжей D. Hansenii и G.pullulans
2. Сравнение эффективности культивирования психротолерантных дрожжей D.hansenii и G.pullulans при культивировании на питательных средах из сульфитных щелоков с эффективностью культивирования дрожжей Candida.
Методическая часть
В работе использованы штаммы аскомицетовых дрожжей D.hansenii:
- Н433, предоставленный Всероссийской коллекцией непатогенных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии (г. Пушкин).
- Н465Ь предоставленный коллекцией кафедры «Бионанотехнология и биоорганический синтез» Московского государственного университета пищевых производств
- Н18-3, предоставленный коллекцией кафедры биологии почв Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова.
Штамм базидиомицетовых дрожжей G.pullulans KB1-34 предоставлен коллекцией кафедры биологии почв Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова.
Культура дрожжей С.tropicalis КБПУ-4883 предоставлены лабораторией биотехнологии МГУ.
Культуры дрожжей хранились на питательной среде Сабуро. Посевной материал готовили на жидкой питательной среде из промышленных сульфитных щелоков (Выборгский ЦБК), содержащих 3,5% редуцирующих веществ. При этом подготовка субстрата предусматривала предварительную отдувку газообразных соединений серы и летучих ингибиторов при нагревании щелока. Содержание РВ в питательной среде нормализовали разбавлением питьевой водой, pH составлял 5,5. В питательную среду вносили минеральные соли (NH4)2SO4 и KH2PO4 из расчетана 50% выход биомассы дрожжей от содержания РВ.
Стерилизация питательных сред проводилась в автоклаве при 115°С в течении 60 минут.
В дальнейших экспериментах культивирование дрожжей осуществлялось в колбах Эрленмейера объемом 250 мл при непрерывном механическом перемешивании на шейкере инкубатора ES-20 при 120 мин1. Температура культивирования штамма С.tropicalis КБПУ-4883 составляла 36°С (оптимум роста), дрожжей D. hansenii и G. Pullulans - от 15 до 25°С.
Также периодическое культивирование дрожжей проводилив биореакторе Sartorius Stedim Biotech при объеме питательной среды 2 л, температура культивирования для дрожжей D.hansenii и G.pullulans 20°С, для дрожжей С.tropicalis KBnY-4883 - 36°С, при непрерывном перемешивании 60 об/мин. и подаче стерильного воздуха 2 л/мин/л среды. pH культуральной жидкости поддерживалась при помощи подачи аммонийной воды и уксусной кислоты.
Определение редуцирующих веществ в питательной среде и культуральной жидкости проводили по методике, приведенной в работе [7].
Определение количества дрожжевых клеток, удельной скорости роста, продолжительность генерации, выход биомассы дрожжей проводили принятыми в биотехнологии методами исследований [8].
Статистическую обработку результатов экспериментов, полученных не менее чем в трех повторах, проводили по программе Microsoft Excel, а также в соответствии требованиями стандартов на использованные в работе методы исследования.
Результаты и обсуждение
Исследования показали, что скорость прироста числа клеток и выход биомассы дрожжей вида D.hansenii и G.pullulans зависят от температуры культивирования и концентрации редуцирующих веществ в питательной среде из сульфитных щелоков. Наиболее продуктивен в рассматриваемых условиях штамм дрожжей D.hansenii Н4651 при температуре культивирования 20оС (табл. 1,2).
Таблица 1 - Кинетические характеристики роста и выход биомассы дрожжей D.hanseniiu G.pullulansпри культивировании на питательной среде из сульфитного щелока*. Начальная концентрация РВ 1,25%
Характеры стики роста и выход биомассы D. hanseniiH465 1 D. hansenii Н433 D. hansenii Н18-3 G.pullulans КВ1-34
Удельная скорость роста ц, ч-1 0,065 ± 0,002 0,071 ± 0,003 0,069 ± 0,003 0,050 ± 0,002 0,057 ± 0,003 0,039 ± 0,002 0,045 ± 0,003 0,055 ± 0,003 0,047 ± 0,002 0,042 ± 0,001 0,059 ± 0,002 0,051 ± 0,001
Время генерации Q, ч 10,66 ± 0,42 9,76 ± 0,37 10,04 ± 0,51 13,86 ± 0,57 12,15 ± 0,52 17,76 ±0,73 15,40 ± 0,67 12,60 ± 0,55 14,74 ± 0,43 16,50 ± 0,73 11,74 ± 0,48 13,58 ± 0,76
Выход биомассы от РВ,% 44,45 ± 2,11 49,25 ± 1,67 43,50 ± 2,03 31,48 ± 1,81 34,25 ± 1,48 33,33 ± 2,12 36,36 ± 2,54 38,09 ± 2,01 33,87 ± 1,93 35,00 ± 1,98 45,61 ± 2,02 41,16 ± 1,67
*— Температура культивирования:в верхней строке 15оС, в средней части 20оС, в нижней строкепри 25оС.
Для данного штамма дрожжей наблюдается наибольшая удельная скорость роста, меньшая продолжительность генерации и высокий выход биомассы. Эти закономерности и, прежде всего, высокая продуктивность, характерны при культивировании этого штамма дрожжей как при концентрации РВ 1,25%, так и при содержании РВ в питательной среде 3,48%.
Штамм дрожжей G.pullulans KBj-34 оказался менее продуктивен, чем штамм дрожжей D.hansenii Н465Ь и эффективность культивирования этих дрожжей практически находится на уровне других исследованных штаммов дрожжей D.hansenii.
Что касается штаммов, используемых обычно на этом субстрате, то при культивировании штамма C. tropicalis KEnY-4883 при оптимальном температурном режиме повышение содержания редуцирующих веществ в питательной среде приводит к снижению скорости прироста числа клеток, увеличению продолжительности генерации и снижению выхода массы дрожжей (табл. 3).
При этом наблюдается некоторое увеличение потребления редуцирующих веществ. Для этой культуры при увеличении концентрации РВ в питательной среде от 1,25 % до 3,48 % продолжительность периода достижения максимального прироста биомассы и количества
клеток увеличивается от 40 до 80 час. Изменение интенсивности потребления РВ также происходит в эти же периоды культивирования.
Таблица 2 - Кинетические характеристики роста и выход биомассы дрожжей D.hanseniiи G.puUulansпри культивировании на питательной среде из сульфитного щелока*. Начальная концентрация РВ 3,48%
Характерист икроста и выход биомассы D.hanseniiH4 651 D.hanseniiH4 33 D.hanseniiH18-3 G.pullulans KB 1-34
Удельная скорость роста ц, ч-1 0,063 ± 0,003 0,065 ± 0,003 0,060 ± 0,004 0,053± 0,003 0,057 ± 0,002 0,054 ± 0,003 0,054 ± 0,002 0,056 ± 0,002 0,057 ± 0,003 0,047 ± 0,002 0,057 ± 0,002 0,051 ± 0,002
Время генерацииQ, ч 11,00 ± 0,55 10,66 ± 0,51 11,55 ± 0,64 12,60 ± 0,77 12,15 ± 0,72 12,83 ± 0,63 12,83 ± 0,58 12,37 ± 0,55 12,15 ± 0,69 14,74 ± 0,81 12,15 ± 0,72 13,58 ± 0,67
Выход биомассыот РВ,% 43,58 ± 2,15 51,80 ± 2,71 47,60 ± 2,26 38,23 ± 2,68 40,53 ± 2,19 37,18 ± 1,83 35,17 ± 2,03 37,12 ± 1,47 36,24 ± 1,92 40,05 ± 1,62 44,31 ± 2,18 42,57 ± 2,73
*— Температура культивирования: в верхней строке 15оС, в средней части 20оС, в нижней строкепри 25оС.
Следует отметить, что при исследованиях роста дрожжей нами использовались сульфитные щелока, взятые непосредственно после отделения от целлюлозы. Эти сульфитные щелока не проходили подготовку для биохимической переработки. Из них не отделялись вредные вещества: фурфурол, цимол и летучие вещества, содержащие серу. Эти вредные вещества оказывают отрицательное влияние на рост и развитие используемых в промышленности дрожжей рода Candida, что и подтверждают полученные результаты культивирования этих дрожжей на питательной среде из сульфитных щелоков при механическом перемешивании.
Таблица 3 - Кинетические характеристики роста и выход биомассы штамма дрожжей C.tropicalis КБПY-4883 при культивировании на питательной среде из сульфитного щелока*
Удельная скорость роста ч-1 0,073 ± 0,004 0,062 ± 0,004
Время генераций, ч 9,49 ± 0,37 11,17 ± 0,45
Выход биомассы от РВ,% 25,80 ± 1,61 13,76 ± 1,55
* Начальная концентрация PB %,в числителе— 1,25 %, в знаменателе — 3,48%, Температура культивирования 36оС.
Кинетические характеристики и выход биомассы штаммов дрожжей D.hansenii H465i и G.pullulans KB1-34 при культивировании на питательной среде из сульфитных щелоков превосходят кинетические характеристики и выход биомассы использованного в экспериментах штамма C.tropicalis КБПУ-4883. Особенно это характерно для штамма дрожжей D.hansenii Н4651 при культивировании при 20оС. Полученные результаты показывают, что дрожжи вида D.hansenim G.pullulans более устойчивы к повышению концентрации РВ в субстрате по
сравнению с использованными в экспериментах штамма C.tropicalis КБПУ-4883. Следует отметить, что и ингибиторы дрожжей рода Candida, содержащиеся в сульфитных щелоках (фурфурол, цимол и сернистые соединения), оказали меньшее влияние в экспериментах на жизнедеятельность дрожжей вида D.hansenim G.pullulans.
При механическом перемешивании достаточного насыщения культуральной среды кислородом воздуха не происходит, что лимитирует рост и синтез биомассы дрожжей. Аэрация при культивировании дрожжей на среде из сульфитных щелоков имеет дополнительный положительный фактор. Поступающий в биореактор воздух уносит из биореактора газовоздушные смеси, удаляя из культуральной среды вредные для дрожжей вещества.
На рисунке 1 и в таблице 4 представлены наиболее характерные результаты исследований, отражающие влияние аэрации на продуктивность штаммов дрожжей D.hansenii H4651 и G.pullulans KB1-34, а также дрожжей C.tropicalis КБПУ-4883 при культивировании на питательной среде из сульфитных щелоков.
Таблица 4 - Кинетические характеристики роста и выход биомассы дрожжей D.hansenii H4651, G.pullulans KB1-34 и C.tropicalis КБПУ - 4883 при культивировании на питательной среде из сульфитного щелока *
Характеристики ростаи выход биомассы D.hansen ¿¿H4651 G. pullu-lansKB1-34 C. tropicalis КБПУ -4883
Удельная скорость роста ц, ч-1 0,182 ± 0,006 0,117 ± 0,005 0,112 ± 0,005
Время генерациир, ч 3,80 ± 0,09 5,92 ± 0,17 6,19±0,27
Выход биомассы от РВ,% 50,43 ± 1,29 47,70±2,1 4 37,60 ± 1,71
*Температура культивирования дрожжей D.hansenii H4651, G.pullulans KB1-3420 оС, дрожжей C.tropicalis КБПУ-4883— 36оС. Расход воздуха 2 л/мин/л культуральной жидкости, pH 5.5 Начальная концентрация РВ 3,05 %
Анализ представленных результатов показывает, что наиболее продуктивным штаммом является D.hansenii H4651, менее продуктивным - штамм G.pullulans KB1-34. Штамм дрожжей C.tropicalis КБПУ-4883 при культивировании на питательной среде из сульфитных щелоков при концентрации РВ 3,05% наименее продуктивен: выход биомассы дрожжей составляет 37,6%.
Следует отметить, что аэрация культуральной среды и, соответственно, унос из среды газообразных вредных веществ, не позволяют получить преимущества при культивировании штамма дрожжей C.tropicalis КБПУ-4883 перед штаммами дрожжей D. Hansenii Н4651 и G. Pullulans KB1-34.
12 16 20 24
Время, ч
Время, ч
с
Рис. 1 - Влияние продолжительности культивирования дрожжей на питательной среде из сульфитных щелоков на рост числа клеток и синтез биомассы
Температура культивирования дрожжей D.hansenii H4651 (а), G.pullulans KB1-34 (в) 20 оС, дрожжей C.tropicalis КБПУ-4883 (с) - 36оС. Расход воздуха 2 л/мин/л культуральной жидкости,рН 5.5. Начальная концентрация РВ 3,05 %.
Выводы
1. Продуктивный штамм дрожжей D. hanseniiH4651 при культивировании на питательной среде из сульфитных щелоков, содержащих высокие концентрации РВ, при температуре 20оС перспективен для промышленности.
2. При использовании штамм дрожжей D. hanseniiН4651следует ожидать:
- сокращения водопотребления и потребления электроэнергии для культивирования и концентрирования биомассы дрожжей,
- увеличенияпроизводительности флотаторов и сепараторов, используемых в производстве кормового белка из дрожжей,
- при поготовке питательной среды возможно исключение отдувки из сульфитных щелоков вредных для дрожжей газообразных веществ.
Литература
1. Новожилов Е.В.ДВУЗ, «Лесной журнал», № 2-3, с. 179-188, (1999),
2. Шарков В.И., Лесная промышленность, 1973. - 408 с.
3. Marques A.P., Evtuguin D.V., Magina S., Amado F.M.L., Prates A., Journal of Wood Chemistry and Technology. 29, №4.С.322-336 (2009),
4. АвдюшеваО.И., ПоповаВ.Л., Созыкина М.П. Бум. промышленность. № 3. С.16-18.(1989),
5. Ле Ань Туан, Банницына Т.Е., Канарский А.В., Качалкин А.В., Максимова И.А., Вестник Казан. тех-нол. университета. №15. C. 243-248.(2015),
6. Ле Ань Туан,Канарский А.В., Щербаков А.В., Чеботарь В.К.,Вестник Казан. технол. университета. Т.18. №13. С. 218-222.(2015).
7. Морозова Ю.А., Скворцов Е. В., Алимова Ф. К., Канарский А.В., Вестник Казан. технол. университета. T.15. №.19. C. 120-122.(2012).
8. Шлегель Г. Общая микробиология: Пер. с нем. - М.: Мир, 567 с.С.190-199.(1987).
© Ле Ань Туан, аспирант каф. пищевой биотехнологии КНИТУ, letuan.tnvn@gmail.com, А. В. Канарский, д.т.н., профессор, каф. пищевой биотехнологии, КНИТУ, alb46@mail.ru, С. К. Зарипова, к.б.н., доц.каф. пищевой биотехнологии КНИТУ, zsania@mail.ru, Л. А. Иванова, профессор, д.т.н., Московский государственный университет пищевой промышленности, факультет биотехнологии и биогорганического синтеза, biotech@mgupp.ru, И, В. Кручина-Богданов, к.х.н., ООО "АМТ" (СПб, РФ), igogo011@gmail.com.
© Le Anh Tuan, graduate student of Food Biotechnology, Kazan National Research Technological University. letuan.tnvn@gmail.com, A. V. Kanarskiy, Dr. Tech. Sci., professor, Department of Food Biotechnology, Kazan National Research Technological University, alb46@mail.ru, S. K. Zaripova, PhD, docent of Dptm. of Food Biotechnology KNRNU, zsania@mail.ru , L. A.Ivanova, Dr.Sci.,Professor. Moscow State of Food Production, Moscow, Russia. Moscow State University of Food Production, Department of «Biotechnology and Technology of bioorganic synthesis»,biotech@mgupp.ru, I. V. Kruchina-Bogdanov, PhD, AMT, Ltd. (St.Petersburg, Russia), igogo011@gmail.com.
а
б
