CC BY
47
УДК: 57.083.133
А. К. Яковлева, З. А. Канарекая, А. В. Канарский
ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ДРОЖЖЕЙ DEBARYOMYCES HANSENII, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ СЫРА
Ключевые слова: меласса, хлорид натрия, галотолерантные дрожжи, культивирование, ферментативная активность.
Показано, что удельную скорость роста, время генерации и прирост биомассы дрожжей влияет концентрация хлорида натрия. Установлено, что максимальная fi-фруктофуранозидазная активность проявляется у дрожжей D.hansenii КБП при культивировании на питательной среде из мелассы, содержащей 10 % хлорида натрия. в-фруктофуранозидазная активность дрожжей D.hansenii КБП обусловливает увеличение содержания редуцирующих веществ в питательной среде в период культивирования и способствует физиологической активности культуры
Keywords: molasses, sodium chloride, halotolerant yeast, cultivation, enzymatic activity.
It is shown that the specific growth rate, generation time and growth of yeast biomass are affected by the concentration of sodium chloride. It was found that the maximum в-fructofuranosidase activity is manifested in D. hansenii KBP yeast when cultivated on nutrient medium from molasses containing 10% sodium chloride. в-fructofuranosidase activity of yeast D.hansenii KBP causes an increase in the content of reducing substances in the nutrient medium during the cultivation period and promotes the physiological activity of the culture
Актуальность
Дрожжи Debaryomyces hansenii являются одним из наиболее распространенных видов аскомицето-вых дрожжей. Это телеоморфные аскоспоровые дрожжи. Данный вид дрожжей легко диагностируется по характерным морфологическим признакам: круглые клетки с множественным почкованием, аски с одной круглой аскоспорой [1]. Так как дрожжи D. hansenii способны расти в среде с содержанием №С1 от 15 % и выше, то их относят к экстремальным галотолерантным формам и объединяют под общим названием галофилы. Дрожжи D. han-&епи относят к умеренно алкотолерантным видам, т.к. некоторые штаммы способны расти при рН 10 и более.
Дрожжи D. hansenii - эврибионтный вид, который встречается во многих природных местообитаниях, таких как морская вода, почва, гнезда муравьев [1, 2]. Часто их можно обнаружить в консервированных мясных продуктах и соленьях [3], а также в продуктах с высоким содержанием сахара [4].
D. hansenii встречаются во всех видах сыров, в том числе в мягких сырах и рассолах, в полутвердых и твердых сырах. D. hansenii используют в качестве компонента заквасок при производстве сыров, так как они способны размножаться в сыре, усваивают лактат, лактозу и галактозу [5].
Цель работы: проверить влияние разных концентраций хлористого натрия на физиологическую активность дрожжей D. hansenii, выделенных из сыра сулугуни, при культивировании их на питательной среде из мелассы.
Методическая часть
В работе был использован штамм дрожжей D. hansenii КБП, выделенный из сыра сулугуни на кафедре биологии почв Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова и идентифицированный на основании анализа нуклеотидных
последовательностей региона ITS1-5.8S-ITS2 и D1/D2 домена 26S (LSU) рДНК по методике описанной ранее [6]. Амплификацию регионов рДНК проводили с использованием праймеров ITSlf (5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTA), NL4 (5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG). Для секвенирования использовали те же праймеры. Секвенирование ам-плифицированных регионов проводили на секвена-торе Applied Biosystems 3130xl Genetic Analyzer в Научно-производственной компании «Синтол» (Москва). Идентификацию по полученным результатов проводили, используя данные генбанка NCBI (ncbi.nlm.nih.gov) и базу CBS (www.cbs.knaw.nl).
Культивирование дрожжей D. hansenii КБП проводили на стерильной питательной среде из мелассы с начальным содержанием редуцирующих веществ 0,23% и сахарозы 8,70% [7].
Мелассу предварительно разбавили в дистиллированной воде и простерилизовали в автоклаве в течение 30 мин при температуре 115 °С. Далее в стерильный раствор мелассы вносили (NH4)2SO4 и KH2PO4 исходя из начального содержания редуцирующих веществ и выхода дрожжей. В подготовленную питательную среду вносили хлорид натрия, содержание которого в питательной среде составляло 10, 20, 30 и 40 %.
Культивирование дрожжей D. hansenii КБП осуществляли в колбах объемом 100 мл при температуре 20±1°С, при непрерывном перемешивании на шейкере в течение 9 суток.
Для определения количества дрожжевых клеток в культуральной жидкости использовали камеру Горяева-Тома [8]. Биомассу дрожжей определяли фотометрическим методом при длине волны 540 нм и ширине кюветы 5 мм [9]. ß-фруктофуранозидазная активность дрожжей D. hansenii КБП определялась по скорости ферментативной реакции гидролиза сахарозы, которую устанавливали по количеству образовавшегося ин-верта в реакционной жидкости [10].
Результаты и обсуждение
На рисунке 1 представлены результаты, отражающие скорость роста дрожжей Б. hansenii КБП, в зависимости от продолжительности культивирования и содержания хлорида натрия в питательной среде.
1,4
«1,2
<
о
О ОТ И | 1СТ1 "-
0 50 100 150 200 250 Время, ч
Рис. 1 - Влияние содержания хлористого натрия и температуры культивирования на дрожжи Б. hansenii КБП
Максимальная скорость роста дрожжей Б. hansenii КБП установлена при содержании хлористого натрия 10%.
В таблице 1 представлены кинетические и экономические факторы культивирования дрожжей Б. hansenii КБП.
Таблица 1 - Кинетические и экономические факторы культивирования дрожжей Б. hansenii КБП
Показатели Содержание №С1 в питательной среде, %
10 20 30 40
Удельная скорость роста д, ч-1 0,24 0,19 0,17 0,17
Продолжительность генерации 0, ч-1 2,88 3,64 4,07 4,07
Прирост биомассы на конец культивирования, г/л 23,54 9,16 8,38 8,38
Наибольшая удельная скорость роста наблюдается у дрожжей Б. hansenii КБП при содержании хлористого натрия в питательной среде 10 %. Продолжительность генерации дрожжей Б. hansenii КБП при содержании хлористого натрия в пита-
тельной среде 10 % ниже, чем при росте на средах с более высокими концентрациями №С1. Наибольший выход биомассы наблюдается у дрожжей Б^атепи КБП также при 10%-ном содержании хлористого натрия в питательной среде.
На рисунке 2 представлены результаты, отражающие изменение содержания редуцирующих веществ в питательной среде при культивировании дрожжей Б. hansenii КБП в зависимости от продолжительности культивирования и концентрации хлорида натрия в питательной среде.
7
О -,-,-,-,-
О 50 100 150 200 250
Время, ч
Рис. 2 - Изменение содержания редуцирующих веществ в питательной среде при культивировании дрожжей Б. ИамнсмИ КБП
На рис. 2 наблюдается общая тенденция увеличения содержания РВ в культуральной среде, а затем снижения этого показателя при культивировании дрожжей Б. hansenii КБП при содержании в питательной среде хлорида натрия 20, 30 и 40%. При этом, достижение максимального значения РВ в культуральной жидкости происходит через 190 часов культивирования дрожжей Б. hansenii КБП на питательной среде, содержащей 10 % хлорида натрия. При содержании хлорида натрия 20, 30 и 40 % в питательной среде концентрация редуцирующих веществ существенно ниже и практически не изменяется в ходе эксперимента.
Увеличение РВ в культуральной жидкости объясняется синтезом дрожжами внеклеточного фермента в-фруктофуранозидаза, гидролизующего сахарозу в питательной среде. Наибольшая активность в-фруктофуранозидазы проявляется у дрожжей Б. hansenii КБП при культивировании на питательной среде с содержанием хлористого натрия 10 %.
В таблице 2 представлена в-фруктофуранозидазная активность дрожжей Б. hansenii КБП при культивировании на питательной среде из мелассы.
При этом же содержании хлорида натрия в культуральной жидкости наблюдается и максимальной количество клеток дрожжей продуцентов в-фруктофуранозидазы. Максимальное количество клеток накапливается у дрожжей Б. hansenii КБП при содержании хлористого натрия 10 %.
Таблица 2 - в-фруктофуранозидазная активность дрожжей Б. hansenii КБП при культивировании на питательной среде из мелассы*
Содержание NaCl
Показатели** в питательной среде, %
10 20 30 40
***Содержание редуцирующих веществ в культураль- 6,00 0,33 0,33 0,43
ной жидкости, %
ß-фруктофуранозидазная активность, мкмоль/мл 16 0,27 0,27 0,55
культуральной жидкости
*температура культивирования 20±1 оС, "показатели определялись по завершению культивирования дрожжей - 190 час.
***начальное содержание редуцирующих веществ в питательной среде - 0,23 %
Таким образом, максимальная р-фруктофуранозидазная активность проявляется у дрожжей D.hansenii КБП при культивировании на питательной среде из мелассы, содержащей 10 % хлорида натрия. По-видимому, именно Р-фруктофуранозидазная активность обусловливает увеличение содержания редуцирующих веществ в питательной среде в период культивирования и способствует росту дрожжевых клеток.
Литература
1. Чернов, И.Ю. Дрожжи в природе / И.Ю. Чернов. -Москва: Товарищество научных изданий КМК, 2013. -336 с.
2. Глушакова, А.М. Устойчивость дрожжей разных экологических групп к длительному хранению в высушенном состоянии / А. М. Глушакова, А. В. Качалкин, Т. М. Желтикова, И. Ю. Чернов // Микробиология. - 2015. -№ 3. - С. 379-385.
3. Бабьева, И.П. Биология дрожжей / И.П. Бабьева, И.Ю. Чернов. - М.: Изд-во МГУ, 2004, - с 239.
4. Рябцева С.А. Дрожжи в молочной отрасли: классификация, свойства, применение // Молочная промышленность. - 2013. - № 4. - с. 64-66.
5. U. Breuer, H. Harms. Debaryomyces hansenii — an ex-tremophilic yeast with biotechnological potential // Yeast. -2006. Vol.23. - Pp. 415-437.
6. Глушакова А.М., Качалкин А.В., Чернов И.Ю. Особенности динамики эпифитных и почвенных дрожжевых сообществ в зарослях недотроги железистой на пе-регнойно-глеевой почве // Почвоведение. 2011. № 8. С. 966-972.
7. Морозова Ю.А., Скворцов Е.В., Алимова Ф.К., Канарский А.В. Вестник Казан. технол. унив. Т. 15. № 19. С. 120-122. (2012).
8. Нетрусов А.И., Егорова М.А., Захарчук Л.М. и др.: Практикум по микробиологии: учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений. М.: Издательский центр «Академия». 608 с. (2005).
9. Chakchir B.A., Alekseeva G.M. Photometricheskie meto-dy analiza [Photometric methods of analysis]. Saint-Petersburg, Publishing house SPHFA, 2002 . 44 p. (In Russ.).
10. Polygalina G.V., Cherednichenko V.S., Rimareva L.V. Opredelenie aktivnosti fermentov [Determination of activity enzymes]. M. DeLee print. 375 p. (2003).
© А. К. Яковлева, магистрант кафедры пищевой биотехнологии (ПищБТ) КНИТУ, [email protected]; З. А. Канарская, к.т.н., доцент кафедры ПищБТ КНИТУ, [email protected]; А. В. Канарский, д.т.н., профессор каф. ПищБТ КНИТУ, [email protected].
© A. K. Yakovleva, graduate student, dep. Food biotechnology KNRTU , [email protected]; Z. A. Kanarskaya -Ph.D. tech. sci., docent dep. Food biotechnology KNRTU, [email protected]; A. V. Kanarskiy, Dr. Tech. Sci., professor, Department of Food Biotechnology, Kazan National Research Technological University, [email protected].
