CC BY
22
Материалы III Санкт-Петербургского международного экологического форума
Инфекция и иммунитет
ствии ГОСТ 26669—85 «Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов».
Доказано, что увеличение титра фагов Bm—3 и Bm—8 серии УГСХА в 5 раз произошло при концентрации 103 м.к. бактерий Bacillus mesentericus в 1 г объектов исследований. Данная концентрация бактерий в пищевом сырье и продуктах питания считается пороговой для их отбраковки или вторичной переработки с использованием соответствующих технологий.
Создана схема ускоренной индикации бактерий Bacillus mesentericus методом реакции нарастания титра фага с использованием биопрепарата на основе фагов Bm—3 УГСХА и Bm—8 УГСХА, которая позволяет обнаружить бактерии в концентрации 103 м.к./г пищевого сырья и продуктов питания за 25 часов.
Применение бактериологического метода и реакции нарастания титра фага при проверке эффективности методики позволяет нам сделать вывод о том, что фагоиндикация экономически целесообразна, так как метод менее трудоемок и позволяет обнаружить искомый штамм бактерий без выделения чистой культуры.
Т125 БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БАКТЕРИОФАГОВ BACILLUS MYCOIDES
Н.А. Феоктистова1, Д.А. Макеев1, Д.А. Васильев1, А.В. Алешкин2
'ФГБОУ ВПО УГСХА им. П.А. Столыпина, Ульяновск, Россия 2ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского, Москва, Россия
Изучения литической активности селекционированных фагов Bacillus mycoides проводили методом агаровых слоев. Экспериментальным путем установлено, что литическая активность фагов колеблется в диапазоне от 106 до 10 12 БОЕ/мл. Для изучения спектра литического действия селекционированных фагов использовали 11 штаммов бактерий Bacillus mycoides, выделенных из проб пищевого сырья и продуктов питания и 1 штамм, полученный из музея НИИЦМиБ ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина». Исследования проводили методом нанесения фага на газон бактериальной культуры методом «стекающая капля». Доказано, что изучаемые бактериофаги имеют различный диапазон действия по отношению к 12 изучаемым штаммам Bacillus mycoides. Опыты демонстрируют, что наиболее широким спектром литического действия обладают штаммы фагов B.myc—3 и B.myc—5 серии УГСХА, совокупный процент лизиса которых составил 91,7 %.
Изучение специфичности 5 выделенных и селекционированных изолятов фагов Bacillus mycoides мы проводили на культурах гомологичного рода: бактериях Bacillus cereus и Bacillus thuringiensis, входящих в группу «Bacillus cereus», используя метод «стекаю -щая капля» Полученные результаты свидетельствуют, что все изучаемые бактериофаги, строго специфичны в пределах вида Bacillus mycoides и могут быть компонентами биопрепарата для индикации и идентификации бактерий Bacillus mycoides.
Для конструирования биопрепарата для фа-гоиндикации и фагоидентификации бактерий Bacillus mycoides нами было выбрано два фага B.myc—3 и B.myc—5 серии УГСХА, которые характеризовались высокими титрами литической активности и максимально широким совокупным спектром ли-
тического действия. Определено, что бактериофаги в течение 12 месяцев снижали показатели литиче-ской активности с 1012 до 107 БОЕ/мл. Известно, изменение литической активности фагов в диапазоне 107-109 не является критическим при конструировании биопрепарата и не отразится на его способности лизировать культуры в пищевом сырье и продуктах питания при проведении исследований по их индикации и идентификации.
Таким образом, нами впервые выделены из проб почвы и изучены по основным биологическим свойствам бактериофаги специфичные в отношении Bacillus mycoides. Созданный на базе производственно-перспективных штаммов бактериофагов Bm—3 УГСХА и Bm—5 УГСХА диагностический биопрепарата обладает высоким титром вирусных частиц, широким спектром литической активности и стабильностью при хранении в течение года.
Т126 СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЭФФЕКТИВНОСТИ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО МЕТОДА И РЕАКЦИИ НАРАСТАНИЯ ТИТРА ФАГА ДЛЯ ИНДИКАЦИИ BACILLUS MYCOIDES В ОБЪЕКТАХ САНИТАРНОГО НАДЗОРА
Н.А. Феоктистова1, Д.А. Макеев1, Д.А. Васильев1, С.Н. Золотухин1, А.В. Алешкин2
'ФГБОУ ВПО УГСХА им. П.А. Столыпина, Ульяновск, Россия 2ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского, Москва, Россия
В результате исследования 537 образцов воды, пищевых продуктов, сельскохозяйственных растений и почвы обнаружен высокий уровень контаминации данных объектов санитарно-эпидемиологического надзора бактериями Bacillus mycoides достигающий 18,6%, требующий постоянного мониторинга со стороны Роспотребнадзора для предотвращения спорадических случаев и вспышек пищевых токсикоин-фекций.
Полученные штаммы по своим фенотипиче-ским характеристикам полностью соответствовали Bacillus mycoides: обладали положительными реакциями на казеин, желатин, каталазу, глюкозу и крахмал, отрицательной на лактозу и преобразовывали нитраты в газообразный азот, культивировались на агаре в анаэробных условиях при температуре 10— 400С и pH среды равном 5.7. Все выделенные штаммы бактерий были палочкообразной формы, образовывали споры, отмирающие при кипячении в течение не более 10 мин при 1000С, не формировали капсул. На МПА бациллы вырастали в виде корневидных колоний серо-белого цвета, напоминающие мицелий гриба. Время исследования по бактериологической схеме составило 107 часов.
В дальнейшем, мы использовали разработанную схему постановки реакции нарастания титра фага с применением фагового биопрепарата для индикации бактерий Bacillus mycoides на образцах пищевого сырья и продуктов питания, максимально подверженных заражению вышеназванными бактериями.
В качестве объектов исследования использовали пробы воды, специй (красный молотый перец, корица) и мяса (говядина и баранина). В результате проведенной серии экспериментов показано, что увеличение титра фагов Bm—3 и Bm—5 серии УГСХА в 10 раз происходило при уровне загрязнения объектов исследований бактериями Bacillus mycoides равном 104 БОЕ/г. Данная концентрация бактерий в пищевом сырье и продуктах питания считается пороговой
2014. Специальный выпуск
Материалы III Санкт-Петербургского международного экологического форума
для их отбраковки или вторичной переработки с использованием соответствующих технологий. Время исследования 25 часов.
Разработана схема идентификации бактерий Bacillus mycoides с помощью сконструированного биопрепарата, позволяющая идентифицировать ми-крооганизмы за 32 часа, что более чем в три раза сокращает срок бактериологического исследования по традиционной схеме выделения и дифференциации бацилл первой морфологической группы.
Т127 РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ФАГОИНДИКАЦИИ BACILLUS MEGATERIUM В МЯСНЫХ И РЫБНЫХ ТОВАРАХ
Н.А. Феоктистова1, Н.А. Петрукова1, Д.А. Васильев1, С.Н. Золотухин1, А.В. Алешкин2
ФГБОУ ВПО УГСХА им. П.А. Столыпина, Ульяновск, Россия 2ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского, Москва, Россия
В Российской Федерации на сегодняшний день отсутствуют данные о созданных фаговых биопрепаратов, в том числе диагностических, специфичных в отношении бактерий Bacillus megaterium. Разработка бактериофаговой тест-системы позволит не только ускорить процедуру по идентификации вышеназванных бактерий в продуктах питания и клинических образцах, но и даст возможность дифференцировать бациллы фаговары и фаготипы
Метод фагоиндикации бактерий Bacillus mega-terium с использованием фагового биопрепарата разрабатывался на основе методики реакции нарастания титра фага. Первоначально, для конструирования биопрепаратов для биосенсорной детекции бактерий Bacillus megaterium было отобрано два фага E.meg — 1 и E.meg — 10 серии УГСХА, которые характеризовались высокими показателями лити-ческой активности и максимально широким совместным спектром литического действия. Очистка фагов от бактериальных клеток осуществлялась методом фильтрации с использованием мембранных фильтров фирмы Millipore (filter type: 0,22 ^m GV). Были проведены эксперименты постановки реакции нарастания титра фага на мясо-пептон-ном бульоне (МПБ), контаминированном 18-часовой индикаторной культурой (Bacillus megaterium 4, Bacillus megaterium 182) в концентрации 103 КОЕ/мл.
Учет результатов проводили согласно оценке, предложенной В.Я. Ганюшкиным (1988). Если увеличение количества корпускул бактериофага Bacillus megaterium в опытной пробе по отношению к количеству корпускул бактериофага в контроле составляло менее 5 раз, то реакция считалась положительной, если менее, то сомнительной. Экспериментальным путем нами установлено, что количество бляшкоо-бразующих единиц в опыте, более чем в 5 раз превышает количество бляшкообразующих единиц в контроле.
Результаты эксперимента свидетельствуют, что 26 часов — это оптимальный временной параметр постановки (РНФ): 0,5 часа — подготовка реакции + 7 часов — время экспозиции субстрата с фагом + 0,5 часа — время, затрачиваемое на постановку эксперимента + 18 часов — время термостатирования посевов).
По результатам проведенной серии опытов установлено, что увеличение титра фагов в 5 раз произошло при концентрации 103 м.к. бактерий Bacillus megaterium — в 1 г говядины и баранины, скумбрии и сельди.
Доказана возможность применения РНФ с целью обнаружения бактерий Bacillus megaterium в объектах санитарного надзора, позволяющая сократить время исследования, уменьшить расход питательных сред и лабораторной посуды, повысить эффективность обнаружения картофельной палочки.
Т128 СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ УСТОЙЧИВЫХ К РИФАМПИЦИНУ, ИЗОНИАЗИДУ И ПИРАЗИНАМИДУ ИЗОЛЯТОВ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
М.Л. Филипенко1, М.А. Дымова1
'Институт Химической Биологии и Фундаментальной Медицины СО РАН
Антибиотикоустойчивость у микобактерий туберкулезного комплекса — достаточно хорошо изученное явление с точки зрения молекулярно-генетических механизмов. В данной работе предлагается способ выявления устойчивых к рифампицину, изониазиду и пиразинамиду изолятов M.tuberculosis, путем определения мутаций в гене rpoB, katG, pncA, ассоциированных с формированием устойчивости к рифампи-цину, изониазиду и пиразинамиду, соответственно. В частности, используется ПЦР в режиме «реального времени» с последующим HRM-анализом. В процессе амплификации формируются «искусственные» ге-теродуплексы за счет одновременной коамплифика-ции ДНК дикого типа и тестируемой ДНК, что может увеличить надежность анализа. HRM-анализ выполняют с помощью «Precision Melt AnalysisTM Software» («Bio-Rad», США). Специфичность реакции амплификации подтверждают по отсутствию дополнительных пиков на кривой плавления, и дополнительных бэндов на электрофореграмме. Разработанный способ выявления мутаций в указанных генах обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Стоит отметить, что разработанный подход к анализу точковых мутаций может подходить и для анализа других нуклеотидных замен, представляющих научный и практический интерес.
Т129 ПИТАНИЕ И ИНТЕЛЛЕКТ, ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНЕНИЯ ПРОБИОТИКОВ
А.В. Шабров1, Ю.П. Успенский2
'ФГБУ«НИИ экспериментальной медицины» СЗО РАМН, Санкт-Петербург, Россия
2ГБОУВПО «ПСПбГМУим. И.П. Павлова», Санкт-Петербург, Россия
Принято считать, что интеллект на 70% является биологически обусловленным и на 30% определяется влиянием факторов окружающей среды. Существуют биологические основы наследственной функции интеллекта, к которым относятся дефектность передачи информации на синаптическом уровне, нарушения в строении миелиновых оболочек нейронов и др.
Известно, что умственный процесс является энергоемким, подтверждением чего служит увеличение потребления глюкозы с 12 до 59%. Мозг человека отличается по потребностям в аминокислотах, многие из которых являются предшественниками медиаторов ЦНС, активно участвуя не только в обусловленности синаптической активности клеток ЦНС, но и способствуя обеспечению оптимальных условий роста нейрона за счет формирования микроокружения. По мнению разработчика доктрины интеллекта Г.Ю. Айзенка попытки повлиять на
