CC BY
48
2014. Специальный выпуск
Материалы III Санкт-Петербургского международного экологического форума
тания бактериями Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Bacillus pumilus, Bacillus megaterium, Bacillus mycoides всех на этапах технологического процесса — это серьезная проблема пищевых производств. Пищевые токсикоинфекции, вызванные вышеназванными бактериями, характеризуются острым течением болезни и могут вызвать летальный исход.
С помощью специфичных фагов можно выявлять в пищевых продуктах вышеназванные бактерии. Доказано, что выделенные нами классическим методом бактерии Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Bacilluspumilus, Bacillus megaterium, Bacillus mycoides можно идентифицировать за 4 суток, используя схему выделения и дифференциации бацилл первой морфологической группы, применение методик фагоиндикации сокращает время исследования до 25 часов. Так, реакция нарастания титра фага позволяет менее чем за сутки обнаружить вышеназванные бактерии в объектах санитарного надзора жидкой и плотной консистенции в концентрации 100 и 1000 м.к. /г., соответственно.
Применение созданных нами фаговых бациллярных биопрепаратов позволит контролировать микробиологическую чистоту сырья растительного и животного происхождения при приемке на перерабатывающее предприятие, осуществлять контроль параметров технологического процесса производства продуктов питания, применяя фаговые биопрепараты в различных методиках (реакция нарастания титра фага, реакция адсорбции фагов, фаготетра-золовый метод, пробирочный метод, метод стекающей капли), анализировать качественный и количественный состав выделенных бацилл, являющихся причиной не только порчи продуктов питания, но и возбудителями пищевых токсикоинфекций, и разрабатывать контрольные меры для исключения рисков или уменьшения их возможности до приемлемого уровня (дополнительная тепловая обработка, установление гигиенического барьера и т.п.).
Т123 ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ СХЕМЫ ФАГОТИПИРОВАНИЯ БАКТЕРИЙ BACILLUS CEREUS
Н.А. Феоктистова1, А.И. Калдыркаев1, Д.А. Васильев1, С.Н. Золотухин1, А.В. Алешкин2
1ФГБОУ ВПО УГСХА им. П.А. Столыпина, Ульяновск, Россия 2ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского, Москва, Россия
Бактерии Bacillus cereus относятся к грамполо-жительным факультативно-анаэробным, подвижным, спорообразующим, палочковидным бактериям, широко распространенным в окружающей среде (почве, пресной и морской воде, кишечнике беспозвоночных, на растениях и т.д.) и имеющим фенотипические и генетические (16S рРНК) признаки, сходные с рядом других видов бактерий рода Bacillus: B. mycoides, B. pseudomycoides, B. thuringiensis и B. anthracis.
Селекционированные нами 57 фагов были разделены на 18 групп, на основе которых разработана схема фаготипирования, позволяющая типировать бактерии B. cereus на 18 фаговаров. Лизируемые культуры сравниваются со схемой фаготипирования и тестируемому штамму бацилл присваивается название группы фага, которой он лизируется (например, фаговар 1-Тип Вс — № штамма).
С учетом строгой родовой специфичности бактериофагов, была разработана схема ускоренной идентификации B. cereus в пробах пищевых продук-
тов с использованием набора специфичных фаговых биопрепаратов. Для оценки эффективности ускоренного диагностического алгоритма в процессе производственных испытаний, параллельно с ними осуществляли идентификацию B. cereus, используя традиционную схему по ГОСТ 1044.8-88 «Продукты пищевые. Методы определения Bacillus cereus».
Процедуру ускоренной идентификации проводили следующим образом: на поверхность МПА в чашках Петри пастеровской пипеткой наносили 18—24 часовую бульонную культуру исследуемых микроорганизмов. Чашки термостатировали в течение 15-20 минут для подсушивания, а затем, предварительно поделив на 7 секторов, на поверхность засеянной среды пастеровской пипеткой в размеченные сектора вносили поочередно 18 биопрепаратов с 1-Фаг ВсУГСХА по 18-Фаг ВсУГСХА. Для исследования 1 бактериальной культуры в опыте использовали 3 чашки Петри с МПА.
По результатам производственных испытаний было установлено, что новый диагностический метод позволяет идентифицировать бактерии B. cereus за 52 часа, в то время как по традиционной бактериологической схеме идентификации проводится в течение 96—120 часов. Таким образом, разработанный алгоритм диагностики бактерий B. cereus с помощью набора специфичных биопрепаратов бактериофагов, не только существенно сокращает время проведения процедуры идентификации, но и предполагает дополнительное типирование данного вида бацилл на фаговары.
Т124 АНАЛИЗ РАСПРОСТРАНЕННОСТИ BACILLUS SUBTILIS В ОБЪЕКТАХ САНИТАРНОГО НАДЗОРА БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИМ МЕТОДОМ И РЕАКЦИЕЙ НАРАСТАНИЯ ТИТРА ФАГА
Н.А. Феоктистова1, М.А. Лыдина1, Д.А. Васильев1, С.Н. Золотухин1, А.В. Алешкин 2
ФГБОУ ВПО УГСХА им. П.А. Столыпина, Ульяновск, Россия 2ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского, Москва, Россия
В период с 2010 по 2014 гг. было исследовано на наличие бактерий Bacillus mesentericus 25 проб хлеба из муки пшеничной высшего и первого сортов, 30 проб муки пшеничной высшего и первого сортов, 55 проб специй, приобретенных в Ульяновской и Самарской областях, 65 проб почвы различного хозяйственного значения. Выделение бактерий вида Bacillus mesentericus проводили по классической схеме выделения и идентификации бацилл первой морфологической группы, которую дополнили тестами на определение ферментативной активности выделенных бактерий по Сидорову (1995). Время исследования 107 часов. Обнаружено 55 культур бактерий вида Bacillus mesentericus при исследовании 175 проб объектов санитарного надзора. Уровень контаминации исследуемых пищевых продуктов бактериям Bacillus mesentericus составил 31%.
Для ускоренной индикации бактерий вида Bacillus mesentericus в пищевом сырье и продуктах питания без выделения чистой культуры, нами была разработана модель постановки реакции нарастания титра фага на пищевом сырье и продуктах питания, максимально подверженных контаминации вышеназванными бактериями. Использовали муку пшеничную высшего и первого сортов, персики, перец черный молотый, мясо — свинину.
Подготовку и посев проб пищевых продуктов, подлежащих исследованию, проводили в соответ-
Материалы III Санкт-Петербургского международного экологического форума
Инфекция и иммунитет
ствии ГОСТ 26669—85 «Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов».
Доказано, что увеличение титра фагов Bm—3 и Bm—8 серии УГСХА в 5 раз произошло при концентрации 103 м.к. бактерий Bacillus mesentericus в 1 г объектов исследований. Данная концентрация бактерий в пищевом сырье и продуктах питания считается пороговой для их отбраковки или вторичной переработки с использованием соответствующих технологий.
Создана схема ускоренной индикации бактерий Bacillus mesentericus методом реакции нарастания титра фага с использованием биопрепарата на основе фагов Bm—3 УГСХА и Bm—8 УГСХА, которая позволяет обнаружить бактерии в концентрации 103 м.к./г пищевого сырья и продуктов питания за 25 часов.
Применение бактериологического метода и реакции нарастания титра фага при проверке эффективности методики позволяет нам сделать вывод о том, что фагоиндикация экономически целесообразна, так как метод менее трудоемок и позволяет обнаружить искомый штамм бактерий без выделения чистой культуры.
Т125 БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БАКТЕРИОФАГОВ BACILLUS MYCOIDES
Н.А. Феоктистова1, Д.А. Макеев1, Д.А. Васильев1, А.В. Алешкин2
'ФГБОУ ВПО УГСХА им. П.А. Столыпина, Ульяновск, Россия 2ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского, Москва, Россия
Изучения литической активности селекционированных фагов Bacillus mycoides проводили методом агаровых слоев. Экспериментальным путем установлено, что литическая активность фагов колеблется в диапазоне от 106 до 10 12 БОЕ/мл. Для изучения спектра литического действия селекционированных фагов использовали 11 штаммов бактерий Bacillus mycoides, выделенных из проб пищевого сырья и продуктов питания и 1 штамм, полученный из музея НИИЦМиБ ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина». Исследования проводили методом нанесения фага на газон бактериальной культуры методом «стекающая капля». Доказано, что изучаемые бактериофаги имеют различный диапазон действия по отношению к 12 изучаемым штаммам Bacillus mycoides. Опыты демонстрируют, что наиболее широким спектром литического действия обладают штаммы фагов B.myc—3 и B.myc—5 серии УГСХА, совокупный процент лизиса которых составил 91,7 %.
Изучение специфичности 5 выделенных и селекционированных изолятов фагов Bacillus mycoides мы проводили на культурах гомологичного рода: бактериях Bacillus cereus и Bacillus thuringiensis, входящих в группу «Bacillus cereus», используя метод «стекаю -щая капля» Полученные результаты свидетельствуют, что все изучаемые бактериофаги, строго специфичны в пределах вида Bacillus mycoides и могут быть компонентами биопрепарата для индикации и идентификации бактерий Bacillus mycoides.
Для конструирования биопрепарата для фа-гоиндикации и фагоидентификации бактерий Bacillus mycoides нами было выбрано два фага B.myc—3 и B.myc—5 серии УГСХА, которые характеризовались высокими титрами литической активности и максимально широким совокупным спектром ли-
тического действия. Определено, что бактериофаги в течение 12 месяцев снижали показатели литиче-ской активности с 1012 до 107 БОЕ/мл. Известно, изменение литической активности фагов в диапазоне 107-109 не является критическим при конструировании биопрепарата и не отразится на его способности лизировать культуры в пищевом сырье и продуктах питания при проведении исследований по их индикации и идентификации.
Таким образом, нами впервые выделены из проб почвы и изучены по основным биологическим свойствам бактериофаги специфичные в отношении Bacillus mycoides. Созданный на базе производственно-перспективных штаммов бактериофагов Bm—3 УГСХА и Bm—5 УГСХА диагностический биопрепарата обладает высоким титром вирусных частиц, широким спектром литической активности и стабильностью при хранении в течение года.
Т126 СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЭФФЕКТИВНОСТИ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО МЕТОДА И РЕАКЦИИ НАРАСТАНИЯ ТИТРА ФАГА ДЛЯ ИНДИКАЦИИ BACILLUS MYCOIDES В ОБЪЕКТАХ САНИТАРНОГО НАДЗОРА
Н.А. Феоктистова1, Д.А. Макеев1, Д.А. Васильев1, С.Н. Золотухин1, А.В. Алешкин2
'ФГБОУ ВПО УГСХА им. П.А. Столыпина, Ульяновск, Россия 2ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского, Москва, Россия
В результате исследования 537 образцов воды, пищевых продуктов, сельскохозяйственных растений и почвы обнаружен высокий уровень контаминации данных объектов санитарно-эпидемиологического надзора бактериями Bacillus mycoides достигающий 18,6%, требующий постоянного мониторинга со стороны Роспотребнадзора для предотвращения спорадических случаев и вспышек пищевых токсикоин-фекций.
Полученные штаммы по своим фенотипиче-ским характеристикам полностью соответствовали Bacillus mycoides: обладали положительными реакциями на казеин, желатин, каталазу, глюкозу и крахмал, отрицательной на лактозу и преобразовывали нитраты в газообразный азот, культивировались на агаре в анаэробных условиях при температуре 10— 400С и pH среды равном 5.7. Все выделенные штаммы бактерий были палочкообразной формы, образовывали споры, отмирающие при кипячении в течение не более 10 мин при 1000С, не формировали капсул. На МПА бациллы вырастали в виде корневидных колоний серо-белого цвета, напоминающие мицелий гриба. Время исследования по бактериологической схеме составило 107 часов.
В дальнейшем, мы использовали разработанную схему постановки реакции нарастания титра фага с применением фагового биопрепарата для индикации бактерий Bacillus mycoides на образцах пищевого сырья и продуктов питания, максимально подверженных заражению вышеназванными бактериями.
В качестве объектов исследования использовали пробы воды, специй (красный молотый перец, корица) и мяса (говядина и баранина). В результате проведенной серии экспериментов показано, что увеличение титра фагов Bm—3 и Bm—5 серии УГСХА в 10 раз происходило при уровне загрязнения объектов исследований бактериями Bacillus mycoides равном 104 БОЕ/г. Данная концентрация бактерий в пищевом сырье и продуктах питания считается пороговой
