CC BY
195
УДК 602.3:579.8
БИОСЕНСОРНАЯ ДЕТЕКЦИЯ БАКТЕРИЙ РОДА BACILLUS В МОЛОКЕ И МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТАХ ДЛЯ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ ИХ ПОРЧИ
Васильев Дмитрий Аркадьевич, доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ВСЭ»*
Золотухин Сергей Николаевич, доктор биологических наук, профессор кафедры «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ВСЭ»*
Феоктистова Наталья Александровна, кандидат биологических наук, доцент кафедры «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ВСЭ»*
Алешкин Андрей Владимирович, доктор биологических наук** ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина»* ФГУН МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского Роспотребнадзора** ava@gabri.ru
432017, г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1; тел.: 8(422)559547х e-maihfeokna@yandex.ru
Ключевые слова: Bacillus cereus, Bacillus mycoides, Bacullis subtilis, Bacillus mesentericus (pumilus), Bacillus megaterium, Bacillus coagulans бактериофаги, детекция, биосенсоры, индикация, идентификация, молоко, молочные продукты, порча.
Научные исследования проводятся при финансовой поддержке государства в лице Министерства образования и науки Российской Федерации в рамках реализации федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (соглашение от №8267 от 10.08.2012).
В статье представлены результаты исследований проб молока, искусственно кон-таминированных штаммами бактерий Bacillus mycoides, Bacullis subtilis, Bacillus mesentericus (pumilus), Bacillus megaterium в концентрации 103 КОЕ/мл, бактериологическим методом и методом РНФ с помощью сконструированных экспериментальных биопрепаратов на основе бациллярных бактериофагов. Установлено, что постановка РНФ при обнаружении данных бактерий показала значительную экономию времени (26 часов) в сравнении с бактериологическим методом исследования (96 часов), чувствительность которого не позволила обнаружить указанные бактерии в вышеназванной концентрации.
Введение
Одним из основных требований, предъявляемых к пищевым продуктам, является их безопасность для потребителя и стабильность состава. Основной причиной порчи продуктов и развития пищевых от-
равлений людей являются микроорганизмы. Особенно остро эта проблема касается портящихся продуктов - свежих фруктов, овощей, мясных и хлебобулочных изделий, соков, молочных продуктов [1,2].
Спорообразующие бактерии рода Bacillus (Bacillus cereus, Bacillus mycoides, Bac-ullis subtilis, Bacillus mesentericus (pumilus), Bacillus megaterium, Bacillus coagulans) являются одним из этиологических факторов биологического разрушения продуктов питания, в том числе молока. Наличие у бацилл спор препятствует инактивации этих микроорганизмов после кратковременного термического воздействия, а выраженная их протеолитическая активность приводит к различным порокам.
Результаты исследований, полученные ВНИИМС, показали, что бактерии рода Bacullis активно развиваются при различных температурах хранения, изменяя орга-нолептические характеристики продукта. При размножении в диапазоне температур 28-370С бациллярные факультативные анаэробы придают молоку и молочным продуктам специфический вяжущий вкус, запах порченых фруктов, дрожжевой привкус, полынную и хинную горечь и изменяют цвет. Установлено, что в условиях холодильного хранения процессы порчи идут аналогично, но значительно медленнее [3,4]
Анализ нормативно-технической документации (ГОСТов и СанПиНов) свидетельствует о том, что в настоящее время для молочных продуктов споровые факультативно-анаэробные микроорганизмы, которыми являются бациллы, не являются санитарно-показательными, поэтому их наличие не нормируется и не подлежит обязательному контролю в условиях производственных лабораторий. Однако при появлении ряда характерных пороков вкуса и внешнего вида у молочных продуктов для бактериологического контроля рекомендуется делать посевы 2-4-кратно разведенного продукта на наличие указанной неспецифической микрофлоры [5,6].
Основным источником контаминации молока являются объекты окружающей среды, корма и воздуха. Доказано, что пастеризация не снижает уровень контаминации, а анаэробные условия и низкие температуры хранения задерживают, но не предотвращают развитие бактерий рода Bacillus [7].
При производстве ряда продуктов, в
технологическом процессе которых заложено концентрирование сухих веществ молока (сыры, сгущенные и сухие молочные продукты), происходит увеличение количества бактериальных клеток изучаемых споровых микроорганизмов за счет их концентрации. Для плавленых сыров и молокосодержащих продуктов, в рецептуре которых используются разнообразные молочные и немолочные компоненты и высокотемпературная обработка сырья (пастеризация или плавление), споровая микрофлора становится подавляющей. Так, в плавленых сырах ее количество может превышать 70% от общего количества микроорганизмов в продукте [8].
Своевременное качественное и количественное обнаружение этих микроорганизмов поможет предотвратить негативные процессы. Поэтому разработка методов детекции бактерий рода Bacillus в молоке и молочных продуктах является той практической задачей, которую необходимо решать в пищевой и перерабатывающей промышленности.
Использование для этих целей тест-систем ПЦР ограничено по нескольким причинам: отсутствие коммерческих прай-меров на многие виды рода Bacillus, дорогостоящие оборудование и расходные материалы, отсутствие квалифицированных специалистов [9]. Применение бактериологического метода исследований для этих целей затруднено в связи с отсутствием соответствующей современной нормативно-технической документации, позволяющей проводить идентификацию бацилл [10].
Цель и задачи исследования
Разработать метод биосенсорной детекции бактерий Bacillus mycoides, Bacullis subtilis, Bacillus mesentericus (pumilus), Bacillus megaterium с использованием фаговых биопрепаратов, который позволит в течение 25-26 часов определить бракеражную концентрацию вышеназванных бактерий (10 3 КОЕ/мл) в молоке-сырье [3].
Для достижения поставленной цели необходимо
- сконструировать экспериментальные биопрепараты на основе выделенных и се-
лекционированных специфических бактериофагов Bacillus mycoides, Bacullis subtilis, Bacillus mesentericus (pumilus), Bacillus megaterium;
- определить оптимальные параметры постановки реакции нарастания титра фага с экспериментальными биопрепаратами;
- разработать схему по постановки реакции нарастания титра фага с пробами молока с целью обнаружения разных видов бацилл.
Объекты и методы исследования
Штаммы бактерий Bacillus megaterium 182 и Bacillus megaterium 4, Bacillus mesentericus 66 и Bacillus mesentericus 2; Bacillus subtilis 26 и Bacillus subtilis 4, Bacillus mycoides 537 и Bacillus mycoides Н были полученные из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветери-нарно-санитарной экспертизы ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина». Штаммы бактериофагов: Phagum Bacillus megaterium Bm - 10 УГСХА-Деп и Phagum Bacillus megaterium Bm - 1 УГСХА-Деп; Phagum Bacillus subtilis Bs - 13 УГСХА-Деп и Phagum Bacillus subtilis Bs - 16 УГСХА-Деп; Phagum Bacillus mycoides B. myc - 3 УГСХА-Деп и Phagum Bacillus mycoides B.myc-5 УГСХА-Деп; Phagum Bacillus mesentericus (pumilus) Bm - 3 УГСХА-Деп и Phagum Bacillus mesentericus (pumilus) Bm - 8 УГСХА-Деп, выделены и изучены нами.
Объекты исследования - пробы молока.
Метод биосенсорной детекции бактерий Bacillus mycoides, Bacullis subtilis, Bacillus mesentericus (pumilus), Bacillus megaterium с использованием фагового биопрепарата разрабатывали на основе методики реакции нарастания титра фага [11, 12]. Выделение и идентификацию бактерий Bacillus mycoides, Bacullis subtilis, Bacillus mesentericus (pumilus), Bacillus megaterium проводили по методике Gordon [13, 14]. Статистическую обработку результатов исследований проводили с применением пакета прикладных программ Statistica 6.0. (for Windows; «Stat Soft Ins.», США), Microsoft Exsel 2003 (for Windows XP).
Результаты исследований
Первым этапом конструирования био-
1!
£ & ES SS »1
Si
р Ü ш Sä Hi H ■ i
са s!
препаратов для биосенсорной детекции бактерий рода Bacillus нами был осуществлен подбор фагов, специфичных в пределах каждого вида (для Bacillus mycoides -Phagum Bacillus mycoides B.myc. серии УГСХА; для Bacullis subtilis - Phagum Bacullis subtilis B.s. серии УГСХА; для Bacillus mesentericus (pumilus) - Phagum Bacillus mesentericus (pumilus) Bm. серии УГСХА); для Bacillus megaterium - Phagum Bacillus megaterium B.meg. серии УГСХА. Отобранные фаги характеризовались высокими показателями литической активности и максимально широким совместным спектром литического действия в пределах гомологичного вида [15, 16,17,18].
Экспериментальные биопрепараты готовили на основе коммерческого питательного бульона при температуре 37°C.
В результате проведенных исследований нами было определено оптимальное соотношение бактериофага и индикаторной культуры - 1:1, т.е. 0,2 мл фага и 0,2 мл индикаторной культуры (для фагов Bacullis subtilis, Bacillus mesentericus (pumilus), Bacillus megaterium), 1:5 (для фагов Bacillus mycoides), время пассажа составило 6-7 часов.
Очистку готовых фаговых препаратов от бактериальных клеток производили методом фильтрации с использованием мембранных фильтров фирмы Millipore (filter type: 0,22 |am GV). Разлитый во флаконы фаг подвергали контролю на чистоту, стерильность и литическую активность. Биопрепараты на основе фагов Bacillus представляют собой флаконы с прозрачной жидкостью желтого цвета (цвет засеянной среды) без посторонних примесей и наличия осадка. Литическая активность на плотных питательных средах составила 109 БОЕ/мл. Дата изготовления серии бактериофагов исчисляется со дня закупорки флаконов. Экспериментальным путем установлено, что срок годности биопрепаратов на основе бациллярных фагов при температуре 2-4 °С составляет 12 месяцев (срок наблюдения).
На втором этапе были проведены исследования по постановке реакции нарастания титра фага с МПБ, искусственно кон-
Таблица 1
Концентрация бактерий, определяемая в пробе молока при постановке РНФ на бактериофагах рода Bacillus серии УГСХА
Объект исследования - контамини-рованное бактериями рода Bacillus молоко в дозе (КОЕ, мл) Контроль индикаторного фага Контроль свободного фага Опыт Увеличение (раз)
Количество негативных колоний фага
Bacillus megaterium
103 39 ± 2 - 273 ± 14 7
102 39 ± 2 - 195± 8 5
101 39 ± 2 - 41 ± 6 1
Bacillus subtilis
103 24 ± 3,2 - 144 ± 12 6
102 24 ± 3,2 - 72 ± 5 3
101 24 ± 3,2 - 24 ± 9 1
Bacillus mycoides
103 56 ± 3,7 - 280 ± 11 5
102 56 ± 3,7 - 168 ± 6 3
101 56 ± 3,7 - 56 ± 7 1
Bacillus mesentericus (pumilus)
103 38 ± 4,4 - 228 ± 5 6
102 38 ± 4,4 - 152 ± 6 4
101 38 ± 4,4 - 76 ± 3 2
таминированными 18 часовыми индикаторными культурами бацилл каждого вида в концентрации 103 КОЕ/мл. В качестве контроля применяли стерильный МПБ. Для каждого бациллярного бактериофага в эксперименте использовали по три комплекта из 3 пробирок. В пробирки № 1 и № 2 вносили исследуемый материал (в данном случае это МПБ, контаминированный 18-часовой индикаторной культурой) объемом 9 мл. В пробирку № 3 вносили 9 мл стерильного МПБ. Затем в пробирки № 1 и № 3 добавляли по 1 мл бактериофага в концентрации 104 БОЕ/мл, в пробирку № 2 вносили 1 мл стерильного МПБ и помещали в термостат (37 0С) на 7 часов. После подращивания исследуемого материала вместе с бактериофагом из каждой пробирки брали по 0,25 мл и вносили в пробирки с 4,5 мл МПБ. Содержимое всех пробирок фильтровали и подвергали дальнейшему исследованию методом агаровых слоев по Грациа.
В результате опытов нами установлено, что при положительной реакции количество бляшкообразующих единиц в опыте превышало более чем в 5 раз количество
бляшкообразующих единиц в контроле [19].
Время, затраченное на детекцию бацилл с помощью изготовленных фаговых препаратов, составило 26 часов (0,5 часа -подготовка реакции + 7 часов - время экспозиции субстрата с фагом + 0,5 часа - время, затрачиваемое на постановку эксперимента + 18 часов - время термостатирования посевов).
Третьим этапом наших исследований стала разработка схемы постановки РНФ для биосенсорной детекции выше перечисленных бацилл с использованием фаговых биопрепаратов в молоке-сырье. Для постановки эксперимента было исследовано 3 пробы молока.
Первая проба молока была использована для определения концентрации бактерий рода Bacillus, которую возможно определить в молоке, используя РНФ с применением гомологичных бактериофагов. Пробу молока в объеме 10 мл вносили в колбу со МПБ (соотношение 1:10) и искусственно контаминировали 18-часовым штаммом Bacillus каждого вида в концентрации 103 КОЕ/мл. Схема проведения эксперимента
Таблица 2
Результаты использования РНФ для детекции бацилл в пробах молока, искусственно контаминированного бактериями Bacillus разных видов в концентрации 103 КОЕ/мл
Количе- Количе- Результат
№ № фага ство не- ство не- Увеличе- Результат РНФ бактериологических
про бы гативных колоний в контроле гативных колоний в опыте ние титра фага, раз (время исследования 26 часов) исследований (время исследования 96 часов)
Bacillus megaterium
1 B.meg - 10 39 ± 2 280 ± 13 7,2 Положительный Отрицательный
B.meg - 1 43 ± 4 296 ± 9 6,9 Положительный при выявлении
2 B.meg - 10 39 ± 2 273 ± 11 7,0 Положительный концентрации 103
B.meg - 1 43 ± 4 233 ± 8 7,3 Положительный КОЕ/мл молока при
3 B.meg - 10 39 ± 2 288 ± 12 7,4 Положительный использовании схе-
B.meg - 1 43 ± 4 305 ± 6 7,1 Положительный мы Gordon (1973
Bacillus subtilis
1 Bs-13 Bs-16 24 ± 3,2 38 ± 4,4 166 ± 14 266 ± 9 6,9 7,0 Положительный Отрицательный при выявлении
2 Bs-13 Bs-16 24 ± 3,2 38 ± 4,4 151 ± 8 274 ± 11 6,3 7,2 Положительный концентрации 103 КОЕ/мл молока при
3 Bs-13 Bs-16 24 ± 3,2 38 ± 4,4 158 ± 6 277 ± 12 6,6 7,3 Положительный использовании схемы Gordon (1973
Bacillus mycoides
1 B.myc-3 56 ± 3,7 364 ± 12 6,5 Положительный Отрицательный
B.myc-5 39 ± 4,6 199 ±5 5,1 Положительный при выявлении
2 B.myc-3 56 ± 3,7 347 ± 11 6,2 Положительный концентрации 103
B.myc-5 39 ± 4,6 218 ± 9 5,6 Положительный КОЕ/мл молока при
3 B.myc-3 56 ± 3,7 367 ± 6 6,6 Положительный использовании схе-
B.myc-5 39 ± 4,6 230 ± 10 5,9 Положительный мы Gordon (1973
Bacillus mesentericus (pumilus)
1 Bm-3 36±1,4 245 ± 13 6,8 Положительный Отрицательный
Bm-8 22±2,3 156 ± 6 7,1 Положительный при выявлении
2 Bm-3 36±1,4 209 ± 11 5,8 Положительный концентрации 103
Bm-8 22±2,3 150 ± 9 6,8 Положительный КОЕ/мл молока при
3 Bm-3 36±1,4 241 ± 14 6,7 Положительный использовании схе-
Bm-8 22±2,3 141 ± 6 6,4 Положительный мы Gordon (1973
гов (I) в сравнении со схемой выделения и дифференциации бацилл первой морфологической группы, изложенной в «Определителе бактерий Берджи» (1993) (II) [20].
Результаты проведенных исследований по детекции бактерий рода Bacillus в искусственно контаминированных пробах молока свидетельствуют о том, что постановка РНФ для обнаружения данных бактерий показала значительную экономию времени (26 часов)
отражена на рис. 1. Результаты исследований представлены в табл. 1.
В табл. 2 приведены сравнительные результаты индикации бактерий рода Bacillus с применением специфических бактериофагов при применении бактериологического метода и метода РНФ.
На рис. 2 отражена схема ускоренной идентификации на примере бактерий Bacillus subtilis и Bacillus cereus с помощью селекционированных нами бактериофа-
Рис. 1 - Схема постановки реакции нарастания титра фага с использованием экспериментального биопрепарата на основе бактериофагов изучаемых видов бактерий рода Bacillus
в сравнении с бактериологическим методом исследования (96 часов), чувствительность которого не позволяет обнаружить бациллы всех
вышеперечисленных видов. Выводы
Исходя из выше изложенного и учиты-
1! Sä
es
»1
s«
р ll
и Л
■ ■ 1 8|
■■■ äl
BS SS
I
II
Исследуемый материал
п=1= Прогревание в
течение 45 мин.
при 70°С
Подращивание в условиях термостата в течение 6 часов
при 37°С ♦
Посев на чашки с МПА газоном
Исследуемый материал
5
Среда Гаузе№2 Среда Громыко
Фагоидентификация бактерий при помощи бактериофагов Bs-13 и Bs-16; Вс-4 и
Вс-8 серии УГСХА /\
Выделение чистой культуры по методу Дригальского
I
Пересев на МПБ
J
ш о и га т
СО
}
го о го 3"
Среда Кларка, 1% глюкозный агар, картофельный агар, МПБ с мочевиной, мясо-пептонный желатин, МПБ с яичным желтком, МПБ с нитратами в анаэростате
m о о га
положительным бактерии вида Bacillus subtilis Bacillus cereus
/\
отрицательный
положительный бактерии вида Bacillus subtilis, Bacillus cereus
Итого: 25 часов Итого: 96 часов (4 суток)
Рис. 2 - Схема ускоренной идентификации бактерий Bacillus subtilis и Bacillus cereus с помощью селекционированных нами бактериофагов (I) в сравнении со схемой выделения и дифференциации бацилл первой морфологической группы, изложенной в «Определителе бактерий Берджи» (II)
вая результаты исследовании, полученных нами ранее, разработанный метод биосенсорной детекции Bacillus megaterium, Bacillus mycoides, Bacullis subtilis, Bacillus mesentericus (pumilus) с применением выделенных и селекционированных специфических в пределах вида бактериофагов, может быть с успехом использован на этапе приемочного контроля качества молока-сырья.
Библиографический список
1. Джей, Дж.М. Современная пищевая
микробиология / Дж. М. Джей, М. Дж. Лесснер, Д.А. Гольден. - М.: БИНОМ Лаборатория знаний, 2011. - 887 с.
2. Васильев, Д.А. Бактериофаги микроорганизмов, значимых для животных, растений и человека / Д.А. Васильев, Н.А. Феоктистова, А.И. Калдыркаев. - Ульяновск: УГСХА ООО «Колор-Принт», 2013. -226 с.
3. Свириденко, Г., Комарова Т. Споровые аэробы рода Bacillus -значимые микроорганизмы порчи для молочных продуктов // Продовольственный торгово-промышленный портал - режим доступа - URL: http://www.produkt.by/ Journal.
4. Rasko, DA. Genomics of the Bacillus cereus group of organisms / D.A. Rasko, M.R. Altherr, C.S. Han, J. Ravel // FEMS Microbiol Rev. - 2005. - № 29. - Р.303-329.
5. Техэксперт (электронный фонд правовой и нормативно-технической документации) - режим доступа - URL: http:// docs.cntd.ru/document.
6.Законы России: справочник по законодательству - режим доступа - URL: http:// zakonrus.ru/gost.
7. Васильев, Д.А. Бактериофаги рода Bacillus / Д.А. Васильев, Н.А. Феоктистова, С.Н. Золотухин, А.В. Алешкин. - Ульяновск: УГСХА, 2013. - 78 с.
8. Портал Foodinnovation.ru - режим доступа - URL: http://foodinnovation.ru/ news/prom_news/3621.html.
9. Феоктистова, Н.А. Роль Bacillus subtilis в обсеменении пищевых продуктов
отрицательный
и
SEIS es »1
Si
р Ü ш SS Hi н ■ i
00 s!
/ Н.А. Феоктистова, А.И. Мустафин, Д.А. Васильев // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Вклад молодых ученых в отраслевую науку с учетом современных тенденций развития АПК». -Москва, 2009. - Т.2. - С. 70-72.
10. Калдыркаев, А.И. Разработка системы фаговаров бактерий Bacillus cereus для идентификации и мониторинга данного микроорганизма: автореф. дис. ...канд. биол. наук / Калдыркаев Андрей Иванович.
- Саратов, 2013. - С. 17.
11. Каттер, Э. Бактериофаги. Биология и практическое применение / Э. Каттер, А. Сулаквелидзе. - М.: Научный мир, 2012. -636 с.
12. Юдина, М.А. Разработка параметров постановки реакции нарастания титра фага для индикации бактерий Bacillus mesentericus в объектах санитарного надзора / М.А. Юдина, Н.А. Феоктистова, Д.А. Васильев // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии.
- 2012. - № 3 (19). - С.69-73.
13. Васильев, Д.А. Идентификация бактерий Bacillus cereus на основе их фенотипи-ческой характеристики / Д.А. Васильев, Н.А. Феоктистова, А.И. Калдыркаев. - Ульяновск, ООО «Колор-Принт», 2013. - 48 с.
14. Васильев, Д.А. Методы частной бактериологии / Д.А. Васильев, А.А. Щербаков, С.Н. Золотухин . - Ульяновск: УГСХА, 2004. - 234 с.
15. Феоктистова, Н.А. Диагностика картофельной болезни хлеба, вызываемой бактериями видов Bacillus subtilis и Bacillus
mesentericus / Н.А. Феоктистова, А.И. Мустафин, Д.А. Васильев // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. - 2011. - № 3 (15). - С.61-68.
16. Феоктистова, Н.А. Биоиндикация бактерий Bacillus mycoides в объектах санитарного надзора / Н.А. Феоктистова, Д.А. Васильев, С.Н. Золотухин // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. - 2013. - № 3 (23). - С.43-49.
17. Феоктистова, Н.А. Методика выделения фагов бактерий видов Bacillus cereus и Bacillus subtilis, перспективы их применения / Н.А. Феоктистова, А.И. Мустафин, Д.А. Васильев // Естественные и технические науки. - 2011. - №2 (52). - С. 83-86.
18. Феоктистова, Н.А. Разработка схемы исследования материала с целью выделения и ускоренной идентификации бактерий видов Bacillus cereus и Bacillus subtilis / Н.А. Феоктистова, А.И. Мустафин, А.И. Калдыркаев // Известия Оренбургского государственного аграрного университета. -2011. - № 4(32). - С. 288-291.
19. Золотухин, С.Н. Создание и разработка схем применения диагностических биопрепаратов на основе выделенных и изученных бактериофагов энтеробактерий: автореф. дис. ...докт. биол. наук: / Золотухин Сергей Николаевич. - Ульяновск, 2007. - С.32.
20. Bergey's manual of determinative bacteriology. - Baltimore: Williams and Wilkins Co, - 1993. - 9th ed. - P.1258.
