CC BY
49
УДК 616.36.-002.2:577.112.6
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕПАТОЦЕЛЛЮЛЯРНЫХ И ИММУНОТРОПНЫХ ЭФФЕКТОВ РЕГУЛЯТОРНЫХ ПЕПТИДОВ В УСЛОВИЯХ
ХРОНИЧЕСКОЙ ГЕПАТОПАТИИ
© Смахтин М.Ю., Чердаков В.Ю., Кононец Е.Н., Кремзукова Я.В.
Кафедра биологической химии Курского государственного медицинского университета, Курск
E-mail: m.yu.smakhtin@mail.ru
Для исследований была использована экспериментальная модель хронического токсического поражения печени, которую вызывали путем внутримышечного введения тетрахлорметана по 2 мл/кг массы тела в течение 12 недель с интервалом в 72 часа между введениями. В этих условиях наблюдалось развитие крупнокапельной жировой дистрофии гепатоцитов, сопровождающейся синдромами цитолиза, холестаза и воспаления, повышалось количество антителообразующих клеток в селезенке, усиливалась функция нейтро-филов в крови. В условиях этой модели АКТГ4-10 (в дозе 1,5 мкг/кг), а Gly-His-Lys и DSLET (в дозах 1,5 и 50 мкг/кг) при десятикратном внутрибрюшинном введении активировали репаративную регенерацию гепатоцитов, повышая число митозов. Gly-His-Lys (в дозе 1,5 мкг/кг, но не 50 мкг/кг ), а АКТГ4-10 и DSLET (в дозах 1,5 и 50 мкг/кг) проявляли гепатопротекторную активность, ослабляя выраженность синдромов цитолиза, холестаза и воспаления. Все пептиды оказывали иммуносупрессирующее действие, более выраженное при дозе (50 мкг/кг). Таким образом, пептиды Gly-His-Lys, DSLET и АКТГ4-10 проявляют разной степени выраженности, но корригирующей направленности активность в отношении функций печени и иммунной системы в условиях хронической тетрахлорметановой гепатопатии.
Ключевые слова: хроническая гепатопатия, Gly-His-Lys, DSLET, АКТГ4-10, репаративная регенерация гепатоцитов, иммунная функция.
THE COMPARATIVE CHARACTERISTICS OF REGULATORY PEPTIDE HEPATOCELLULAR AND IMMUNOTROPIC EFFECTS IN CHRONIC HEPATOPATHY
Smakhtin M.Yu., Cherdakov V.Yu., Kononets E.N., Kremzukova Ya.V.
Biochamistry Department of the Kursk State Medical University, Kursk
The experimental model of chronic toxic liver damage was used for investigations. It was induced by intramuscular injections of tetrachloromethane (2 ml/kg) with 72 hours interval between injections within 12 weeks. In these conditions the big-drop fatty dystrophy of hepatocytes was found out, which was accompanied with cytolysis, cholestasis and inflammatory syndromes, the increased level of antibody producing cells in spleen and enhanced blood neutrophil function. In this model the peptides ACTH4-10 (in the dose of 1,5 mcg/kg) but Gly-His-Lys and DSLET (in the doses of 1,5 and 50 mcg/kg), injected 10 times intraparenterally, activated the hepatocyte reparative regeneration by increasing mitosis. Gly-His-Lys (in the dose of 1,5 mcg/kg, but not in the dose of 50 mcg/kg), but ACTH4-10 and DSLET (in the doses of 1,5 and 50 mcg/kg) had hepatoprotective activities, decreasing the cytolisis, cholestasis and inflammatory syndrome activities. All peptides induced the immunosuppressive action, which was more expressed in the dose of 50 mcg/kg. Thus, the peptides have induced the corrective actions on liver functions and immune system in case of chronic tetrachloromethane hepatopathy.
Key words: chronic hepathopathy, Gly-His-Lys, DSLET, ACTH4-10, hepatocyte reparative regeneration, immune function.
Пептидные молекулы являются важнейшими компонентами регуляторных систем организма и играют ключевую роль в поддержании гомеостаза [2]. Кроме того, такие пептидные препараты, как миелопид, семакс, тимоген, даларгин и другие, нашли применение в клинической практике, что свидетель-
ствует о важном практическом значении этих исследований.
Учитывая важную роль печени в регуляции гомеостаза и постоянный рост ее заболеваемости, обусловленный химизацией производства, быта и медицины [3], выявление оптимальных условий усиления регенерации печени является особенно актуальным.
Функциональная активность этого органа существенно влияет на состояние иммунной и эндокринной функций, через которые осуществляется регуляция регенерации печени [3]. Однако роль регуляторных пептидов во взаимосвязи репаративных процессов в печени с иммунной функцией остается мало изученной. При этом эффекты и механизмы гепатотропного влияния нейропептидов и других нейроэндокринных лигандов практически не известны. Такое положение затрудняет дальнейшее изучение регуляторных механизмов регенерации печени, а также целенаправленный поиск новых гепатопротектор-ных препаратов пептидной природы.
Учитывая тот факт, что в обеспечении восстановительных процессов принимают участие различные системы регуляции, особый интерес представляли изучение и анализ эффектов пептидов различных функциональных групп. Известно, что трипептид Gly-His-Lys (GHL) повышает выживаемость гепатоцитов in vitro [12, 13], что свидетельствует о его прямом гепатотропном эффекте. В то же время адаптация к изменяющимся условиям среды контролируется гипоталамо-гипофи-зарно-надпочечниковой системой, одним из основных компонентов которой служит АКТГ [2]. Фрагмент его молекулы - ЛКТГ4-10, практически лишенный стероидогенной активности, оказывает выраженное нейротроп-ное действие [8]. С другой стороны, выраженность адаптивной реакции зависит и от активности стресс-лимитирующей системы, компонентами которой являются опиоидные пептиды, их рецепторы обнаружены в том числе и на мембране гепатоцитов [3]. Установлено, что некоторые физиологические функции печени регулируются энкефалина-ми, испытывающими наибольшее сродство к 5-опиатным рецепторам [3], селективным агонистом которых является синтетический аналог энкефалинов - пептид DSLET ([D-Ser
2, D-leu5] энкефалин - Thr 6).
Все изложенные факты обусловили выбор пептидов, а изучение их гепатотропного влияния и сопряженного с этим изменения иммунной функции представляется актуальным как с позиций дальнейшего исследования их роли в организме, так и с целью поиска и доклинической апробации новых гепатотроп-ных препаратов.
Особый интерес представляет исследование эффектов пептидов различных функциональных групп в условиях модели хронической тетрахлорметановой гепатопатии (ХТГ), обладающей большим сходством механизма развития с клиническими формами хронических поражений печени у людей [3].
В связи с этим целью исследования было выявление гепатоцеллюлярных и иммуно-тропных эффектов пептидов GHL, DSLET и ЛКТГ4-10 при хронической токсической гепа-топатии.
МЛТЕРИЛЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследования проводились на крысах Ви-стар массой 180-220 г. Хроническое токсическое поражение печени (ХТГ) вызывали путем внутримышечного введения 50% раствора ТХМ по 2 мл/кг массы тела в течение 12 недель с интервалом в 72 часа между введениями. Раствор вводили в мышцу бедра, через день меняя лапки. В экспериментах были изучены гепато- и иммунотропные эффекты следующих пептидов:
Глицил-гистидил-лизин (GHL): NH2-Gly-His-Lys-COOH
DSLET: NH2 -Tyr - D - Ser - Gly - Phe -Leu - Thr - COOH
ЛКТГ4-10: H2N - Met - Glu - His - Phe -Arg - Try - Gly - COOH
GHL был синтезирован в НИИ химии Санкт-Петербургского государственного университета, ЛКТГ4-10 - в Институте молекулярной генетики АН РФ, а DSLET - в Кардиологическом научном центре РЛМН.
Пептиды вводились в разовых дозах - 1,5 и 50 мкг/кг массы. Навески растворяли в стерильном изотоническом растворе NaCI и вводили внутрибрюшинно в объёме 0,1 мл в течение 12 недель с интервалом в 24 часа между инъекциями. Контрольные животные получали эквивалентные объемы физиологического раствора. На следующий день после последнего введения препарата животных забивали под эфирным наркозом и выделяли печень. Кусочки органов фиксировали в 10% нейтральном формалине на 0,1 М фосфатном буфере рН=7,2 и заливали в парафин по общепринятой методике. Парафиновые срезы печени окрашивали гематоксилином и эози-
ном, после чего изучали общую морфологическую картину органа. Подсчитывали митотический индекс (МИ), отражающий активность клеточной формы регенерации, и индекс двуядерных гепатоцитов (ИДГ), показывающий выраженность ацитокинетической активности как формы внутриклеточной регенерации и резерва полиплоидизации [7]. Также измеряли диаметр ядер (ДЯ) гепатоци-тов, указывающий на активность внутриядерного метаболизма [1]. Для оценки микро-структурной упорядоченности клеточного состава печени в процессе ее регенерации вычисляли относительную энтропию и коэффициент организованности органа [2]. В качестве значений вариационного ряда были взяты размеры диаметра ядер как наиболее стабильного и объективного морфометрического показателя, достаточно полно отражающего метаболические процессы, лежащие в основе клеточного деления.
В сыворотке крови крыс с патологией печени в качестве индикаторов синдрома цитолиза определяли активность аспартат- и ала-нинаминотрансфераз (с использованием набора реактивов "Лахема", Чехия), синдрома холестаза - концентрацию билирубина и Р-липопротеидов [6], синдрома воспаления -тимоловую пробу (с использованием набора реактивов "Лахема", Чехия).
Лктивность кислородзависимых механизмов защиты нейтрофилов крови оценивали в тесте восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест). В качестве стимулятора использовали зимозан. При микроскопии определяли количество (в %) диформазан-положительных клеток (5). Функциональный резерв нейтрофилов (ФРН) расчитывали как разность показателей стимулированного и спонтанного НСТ-теста. Интенсивность гуморального иммунного ответа определяли по количеству антителообразующих клеток в селезенке на 5-й день после иммунизации эритроцитами барана [5]. Пептиды вводили до, одновременно и после иммунизации в течение десяти дней. Математическую обработку проводили, вычисляя M±m. Достоверность различий средних величин оценивали с помощью критерия Манна-Уитни.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Хроническое введение ТХМ в течение 12 недель приводит к развитию выраженной крупнокапельной жировой дистрофии с некрозами гепатоцитов (рис. 1). В этих условиях восстановительные процессы в печени активируются преимущественно за счет митозов, в то время как пул двуядерных гепато-цитов, которые можно рассматривать как своеобразный резерв регенерации, снижается. Возможно, в этих условиях восстановление погибших клеток осуществляется как за счет повышения количества митозов, так и за счет деления двуядерных гепатоцитов. Кроме того, наблюдается выраженная гипертрофия ядер, что может быть следствием полиплои-дизации, которая позволяет повысить функциональную активность генетического аппарата клетки параллельно с усилением в ней специфической функции [7].
GHL стимулирует митотическую активность и снижает количество двуядерных ге-патоцитов (табл. 1) и таким образом сохраняет направленность изменений, присущих этой патологии. Аналогично эффектам GHL, пептиды DSLET и АКТГ4-10 также не меняют направленности изменений параметров репа-ративной регенерации, а лишь усиливают эти изменения без существенного влияния на диаметр ядер. Кроме того, АКТГ4-10 в дозе 50 мкг/кг не повышает митотический индекс гепатоцитов. GHL и АКТГ4-10 либо незначительно повышают (в дозе 1,5 мкг/кг), либо не влияют на организацию микроструктуры печени (в дозе 50 мкг/кг), тогда как DSLET в этих условиях и в тех же дозах нормализует микроструктурную организованность органа.
Изучение биохимических показателей сыворотки крови показывает, что хроническое отравление ТХМ вызывает развитие синдромов цитолиза, холестаза и воспаления, о чем свидетельствует повышение активности в сыворотке крови аланин- и аспартатамино-трансфераз, уровня билирубина, (3-
липопротеидов, а также тимоловой пробы (табл. 2). При этом наблюдается существенное повышение как функциональной активности нейтрофилов, так и антиген-
специфического иммунитета (табл. 3), что связано с выходом лизосомальных ферментов
Рис. 1. Крупнокапельная жировая дистрофия гепатоцитов при хроническом введении тетрах-лорметана (12 недель) и десятидневном введении изотонического раствора. Окраска гематоксилином и эозином. Микрофото. Увеличение х 200.
Таблица 1
Влияние GHL, DSLET и АКТГ4_ю на репаративную регенерацию гепатоцитов (М±ш, п=8) в условиях хронической тетрахлорметановой гепатопатии (ХТГ)
Условия опыта МИ ИДГ ДЯ
Интактные животные 3,4±0,7 189,6±13,4 7,26±0,16
Контроль (масло + NaCl) 3,6±0,8 214,9+14,8 6,99+0,14
ХТГ + NaCl 18,2+3,6*и 166,9+12,6*2 8,56+0,24*1'2
ХТГ + GHL (1,5 мкг/кг) 32,3±5,7*1_3 70,2+7, I*1"3 7,71±0,20*1_3
ХТГ + GHL (50 мкг/кг) 35,216л*1'3 112,6+11^^1'4 8,32+0,21*1'2'4
ХТГ + DSLET (1,5 мкг/кг) 37,8+6,4*1'3 96,2+9,8*1"3 8,33+0,22*1Д4
ХТГ + DSLET (50 мкг/кг) 35,7+6,2*1"3 106,2+10,4*1"3 8,64+0,24*1'2'4
ХТГ+АКТГ4-10 (1,5 мкг/кг) 45,1±7,2*1'3 98,4+10,I*1"3 8,94±0,26*1-2'4
ХТГ+АКТГ 4-10 (50 мкг/кг) 23,3±5,4*1Д8 96,7+9,7*1"3 8,62±0,26*1Д4
Примечание: 1. МИ - митотический индекс (%о); 2. ИДГ - индекс двуядерных гепатоцитов (%о); 3. ДЯ - диаметр ядер гепатоцитов (мкм); 4. * - р< 0,05, рядом стоящая цифра - номера групп сравнения.
из гепатоцитов, которые, воздействуя на макрофаги и эритроциты, модифицируют их мембраны, в результате чего усиливается выделение интерлейкина-1 [10].
В этих условиях GHL нормализует только концентрацию Р-липопротеидов и уровень тимоловой пробы при введении в дозе
1,5 мкг/кг, что свидетельствует о корригирующем эффекте пептида на проявления воспаления и частично холестаза (табл. 2). Доза же пептида 50 мкг/кг гепатопротекторным дей-
ствием не обладает. DSLET и АКТГ4-10 проявили более выраженное влияние на биохимические симптомы поражения печени: они нормализуют уровень тимоловой пробы и в равной степени снижают активность аланин-и аспартатаминотрансфераз, концентрацию билирубина и бета-липопротеидов, что свидетельствует об ослаблении выраженности синдромов цитолиза и холестаза и о корригирующем влиянии пептидов на процесс воспаления.
Таблица 2
Влияние GHL, DSLET и АКТГ4-10 на биохимические показатели сыворотки крыс в условиях
хронической токсической гепатопатии
Условия опыта Ферменты, мккат/л Билирубин, мкмоль/л Бета-липопро-теиды, г/л Тимоловая проба, Ед. мутн.
АЛТ АСТ
Интактные крысы 0,З4±0,04 0,1З±0,01 19,7±1,7 З,З±0,З 2,2±0,2
Масло + изотонический раствор 0,З8±0,05 0,15±0,02 20,1±2,0 З,6±0,4 2,З±0,2
ХТГ + изотонический раствор 1,24±0,11 *1,2 0,46±0,05*1,2 46,7±4,8*1,2 7,8±0,7*1,2 4,7±0,4*1,2
ХТГ+ GHL (1,5 мкг/кг) 1,0З±0,08*12 0,З9±0,04*1,2 З8,2±З,6*1,2 4,8±0,4*3 З,0±0,З*3
ХТГ+ GHL (50 мкг/кг) 1,27±0,10*124 0,З7±0,04*1,2 47,7±4,6*1,2,4 6,5±0,7*1,2,4 5,0±0,5*1,2,4
ХТГ+ DSLET (1,5 мкг/кг) 0,68±0,06*1-3 0,28±0,0З*1-3 З7,З±З,5*1-3 5,6±0,6*1-3 2,7±0,З*3
ХТГ+ DSLET (50 мкг/кг) 0,62±0,06*1-3 0,24±0,02*1-3 З6,9±2,5*1-3 5,2±0,5*1-3 2,4±0,З*3
ХТГ + АКТГ4-10 (1,5 мкг/кг) 0,57±0,05*1-3 0,26±0,02*1-3 З6,8±2,4*1-3 5,4±0,5*1-3 2,5±0,2*3
ХТГ + АКТГ4-10 (50 мкг/кг) 0,62±0,05*1-3 0,28±0,0З*1-3 З7,1±2,6*1-3 5,8±0,6*1-3 2,7±0,З*3
Примечание: * - показывает достоверные отличия, р<0,05. Цифры рядом со звездочкой означают номера групп, с какими сравнивались различия.
Таблица З
Влияние GHL, DSLET и АКТГ4_ю на число антителообразующих клеток (М±ш, п=9) в селезенке крыс в условиях хронической тетрахлорметановой гепатопатии
Условия опыта GHL DSLET АКТГ4-10
АОК на селезенку (103)
Контроль (масло + NaCl) 21,8+3,1 21,8+3,1 21,8+3,1
Тетрахлорметан + NaCl 74,1±9,2*1 74,1±9,2*1 74,1+9,2*1
Тетрахлорметан + пептид (1,5 мкг/кг) 53,2±6,4*и 63,6+7,8*1’2 48,8+5,6*1’2
Тетрахлорметан + пептид (50 мкг/кг) 38,4±4,3*1_3 51,3+6,I*1’2 37,8+5,7*1'3
чия, р<0,05. Цифры рядом со звездочкой означают номера групп, с какими сравнивались различия.
Анализируя выявленные эффекты, можно заключить, что в условиях хронического токсического поражения печени GHL стимулирует репаративную регенерацию гепатоцитов, улучшая организацию их микроструктуры и проявляя при дозе 1,5 мкг/кг слабую гепато-протекторную активность. АКТГ4-10 в дозе
1,5 мкг/кг стимулирует репаративную регенерацию гепатоцитов за счет усиления их ми-
тотической активности, а в дозах 1,5 и 50 мкг/кг обладает гепатопротекторным эффектом. DSLET же стимулирует репаративную регенерацию гепатоцитов и обладает гепато-протекторным эффектом в обеих дозах (1,5 и 50 мкг/кг).
В условиях ХТГ повышается уровень гуморального иммунного ответа и функциональная активность нейтрофилов (табл. 3).
ФРН
□ 1,5 мкг/кг Q 50 мкг/кг
GHL
DSLET
АКТГ Доза
Рис. 2. Влияние GHL, DSLET и AKTTYio на функциональную активность (М±ш) нейтрофилов периферической крови в условиях хронической токсической гепатопатии.
Примечание: - группа контроля (тетрахлорметан + NaCl); * - p<0,05 по сравнению с группой контроля.
Иммунотропные эффекты изученных пептидов в условиях ХТГ были супрессирующими как в отношении функциональной активности нейтрофилов, так и в отношении антиген-специфичного иммунного ответа (табл. 3, рис. 2). Пептиды снижали повышенную иммунологическую реактивность, при которой может наблюдаться ухудшение патологического процесса и нарушение биотрансформации ксенобиотиков [9].
Также известно, что в стадии хронического воспаления секреция провоспалительных цитокинов стимулирует пролиферацию фиб-робластов и синтез коллагена, что приводит к замещению клеток органа фиброзной тканью [1], не обладающей функциями гепатоцитов. В связи с этим ослабление повышенной иммунологической реактивности и воспалительной реакции под влиянием изученных пептидов, а также их активирующее действие на митозы гепатоцитов, скорее всего, можно расценивать как позитивное влияние, направленное на восстановление первоначальной структуры органа, что подтверждается ослаблением выраженности биохимических синдромов поражения печени в этих условиях (табл. 2).
Таким образом, при хронической гепато-патии изученные пептиды активируют репа-ративную регенерацию гепатоцитов, не изменяя направленности клеточной и внутриклеточной форм регенерации. При этом пептиды
обладают гепатопротекторной активностью и снижают повышенную в этих условиях иммунную реактивность, что свидетельствует о корригирующем влиянии в отношении функций печени и иммунной системы.
ЛИТЕРАТУРА
1. Автандилов Г.Г. Медицинская морфомет-рия. - М.: Медицина, 1990. - 383 с.
2. Акмаев И.Г., Гриневич В.В. От нейроэндокринологии к нейроиммуноэндокринологии // Бюл. эксперим. биологии и медицины. -2001. - Т. 131, № 1. - С. 22-32.
3. Алексеева И.Н., Брызгина Т.М., Павлович С.И., Ильчевич Н.В. Печень и иммунологическая реактивность. - Киев, 1991. - 168 с.
4. Зозуля А.А., Пшеничкин С.Ф. Опиоиды и иммунитет // Итоги науки и техники: Сер. "Иммунология". - 1990. - Т. 25. - С. 48-120.
5. Иммунологические методы: Пер. с нем. / Под ред. Г. Фримеля. - М.: Мир, 1987. - 472 с.
6. Меньшиков В.В. Лабораторные методы исследования в клинике. - М.: Медицина, 1987. -365 с.
7. Саркисов Д.С. Структурные основы адаптации и компенсации нарушенных функций. -М., 1987. - 240 с.
8. Северьянова Л.А. Влияние адаптивных гормонов на интегративную деятельность мозга -М.: Наука, 1988. - 124 с.
9. Сибиряк С.В., Сергеева С.А. Цитокины и мик-росомальное окисление // Эксперим. и кли-нич. фармакология. - 1998. - Т. 61, № 5. -С. 75-80.
10. Смахтин М.Ю., Конопля А.И., Северья-нова Л.А., Швейнов И.А. Фармакологическая коррекция пептидом GLY-HIS-LYS иммуно-метаболических нарушений в условиях поражения печени тетрахлорметаном // Патолог. физиология и эксперим. терапия. - 2003. -№ 2.- С. 19-21.
10. Фрейдлин И.С. Паракринные и аутокринные механизмы цитокиновой иммунорегуляции // Иммунология. - 2001. - № 5. - C. 4-7.
11. Maquart F.X., Pickart L., Laurent M. et al. Stimulation of collagen synthesis in fibroblast cultures by the tripeptide-copper complex glycyl-L-histidyl-L-lysine-Cu2+ // FEBS Lett. - 1988. -Vol. 238, N 2. - P. 343-346.
12. Maquart F.X., Bellon G., Chaqour B. et al. In vivo stimulation of connective tissue accumulation by the tripeptide-copper complex glycyl-L-histidyl-L-lysine-Cu2+ in rat experimental wounds // J. Clin. Invest. - 1993. - Vol. 92, N 5. - P. 2368-2376.
