CC BY
84
12. Schwan H.P., Gartensen E.X., Li K. Heating of fat- thermy // Trans Leee. - 1953. - Vol. 72. - P. 483.
muscle layers by electromagnetic and ultrasonic dia-
Экспериментальная биология и медицина УДК 577.112:577.121.7] :612.753:616.001.5
СИНЕРГИЧНОЕ АНТИОКСИДАНТНОЕ И РЕПАРАТИВНОЕ ДЕЙСТВИЕ ТИМОГЕНА, ДАЛАРГИНА И ПЕПТИДА GLY-HIS-LYS ПРИ ПЕРЕЛОМЕ ТРУБЧАТЫХ КОСТЕЙ
© Чердаков В.Ю., Смахтин М.Ю., Дубровин Г.М., Дудка В.Т., БобынцевИ.И.
Кафедра биологической химии, кафедра травматологии, ортопедии и военно-полевой хирургии, кафедра патологической анатомии, кафедра патофизиологии Курского государственного медицинского университета, Курск
E-mail: cherdakov@rambler.ru
Установлено, что в условиях экспериментального перелома у крыс введение в эквимолярных дозах пептидов Gly-His-Lys (0,5 мкг/кг), даларгина (1,2 мкг/кг) и тимогена (0,5 мкг/кг) внутрибрюшинно, в течение 10 дней, сопровождалось проявлением ими антиоксидантной активности, о чем свидетельствовало снижение уровня малонового диальдегида и повышение активности каталазы в крови. Эффект тимогена в отношении малонового диальдегида был более выражен по сравнению с действием пептида Gly-His-Lys. Пептиды обладали синергичным антиоксидантным и репа-ративным действием, поскольку при комбинированном (парном) введении препаратов наблюдалось существенное усиление антиоксидантного (активность каталазы) и репаративного эффектов, по сравнению с использованием препаратов по отдельности. Более выраженные репаративные изменения были выявлены в группе комбинированного введения пептидов Gly-His-Lys + даларгин, что подтверждалось гистологическими и рентгенологическими исследованиями. У животных этой группы через 10 дней линия перелома практически не прослеживалась. Синергичное действие пептидов Gly-His-Lys, тимогена и даларгина может быть использовано для стимуляции репаративного остеогенеза.
Ключевые слова: тимоген, даларгин, пептид Gly-His-Lys, экспериментальный перелом, антиоксидантная активность, репаративный остеогенез.
SYNERGETIC ANTIOXIDANT AND REPARATIVE ACTION OF THYMOGEN, DALARGIN AND PEPTIDE
GLY-HIS-LYS IN TUBULAR BONE FRACTURES Cherdakov V. Yu., Smakhtin M. Yu., Dubrovin G.M., Dudka V. T., Bobyntsev I.I.
Biochemical Department, Traumatology, Orthopedics & Military Surgery Department, Pathanatomy Department, Pathophysiology Department of the Kursk State Medical University, Kursk It has been established, that in case of experimental rat bone fractures the intraperitoneally injections of peptides in equimolar doses - Gly-His-Lys (0.5 ^g/kg), dalargin (1.2 ^g/kg) and thymogen (0.5 ^g/kg) during 10 days result in their antioxidant actions testified by the decrease of malonic dialdehyde concentration and increase of catalase activity in blood. The effect of thymogen on the level of malonic dialdehyde was more expressed in comparison with Gly-His-Lys action. The peptides had synergetic and reparative action because in case of twin combined injections of these substances the essential amplification of antioxidant (catalase activity) and reparative effects was observed in comparison with individual injections of peptides. The more expressed reparative changes were found in the group of rats with peptide combined injection Gly-His-Lys + dalargin testifyed by histological and X-ray investigations. In animals of this group the line of bone fracture was not observed after 10 days practically. The synergetic action of peptides Gly-His-Lys, thymogen and dalargin may be used for stimulation of reparative osteogenesis.
Keywords: thymogen, dalargin, peptide Gly-His-Lys, experimental bone fracture, antioxidant activity, reparative osteogenesis.
Лечение больных с посттравматическими нарушениями костной регенерации по-прежнему остается одной из главных проблем травматологии и ортопедии, высокая актуальность которой определяется ростом травматизма, вышедшим на четвертое место среди общей заболеваемости взрослого населения [6]. По мнению ряда авторов, для эффективного лечения, помимо обеспечения стабильной фиксации костных отломков, необходима разработка новых способов стимуляции репаративного остеогенеза [6].
Репарация костной ткани находится под контролем механизмов, в которых принимают участие основные регуляторные системы организма: нервная, эндокринная, иммунная. Компонентами
этих систем являются пептидные молекулы, осуществляющие их взаимодействие [1]. В связи с этим одним из перспективных направлений медицины считается использование регуляторных пептидов для стимуляции репаративной регенерации поврежденных тканей.
Трипептид 01у-№8-Ьу8 (GHL) непосредственно стимулирует процессы роста и дифференци-ровки клеток [10]. В то же время получены убедительные данные о существенном влиянии иммунной системы на восстановительные процессы опорно-двигательного аппарата [2]. В связи с этим целесообразно дальнейшее изучение эффектов и механизмов действия пептидного иммуномодулятора - тимогена ^1и-Гф).
В связи с наличием болевого синдрома при переломах представляется целесообразным выявление эффектов опиодных пептидов, являющихся компонентами стресс-лимитирующей системы организма. Опиатные рецепторы для энкефалинов обнаружены в большинстве органов и тканей [5]. Эти факты обусловили выбор для исследования аналога нативного лейэнкефалина - даларгина.
В то же время в нейроэндокринной регуляции значительный интерес представляют вопросы потенцирования или ослабления эффектов регуляторных пептидов [1], в связи с чем также целесообразно изучение эффектов комбинированного введения пептидных субстанций.
Целью настоящего исследования было выявление репаративных и антиоксидантных эффектов регуляторных пептидов - тимогена, даларги-на, Gly-His-Lys и их комбинаций в условиях экспериментального перелома бедренной кости.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Опыты проводились на крысах Вистар массой 180-220 г, которым под хлоралгидратным наркозом производился закрытый перелом правой бедренной кости с последующей интрамедуллярной фиксацией ее спицей [8]. Соответствующую навеску пептида растворяли в 0,1 мл физиологического раствора и в течение 10 дней со дня перелома вводили животным внутрибрюшинно, в эк-вимолярных дозах GHL - 0,5 мкг (синтезирован в НИИ химии Санкт-Петербургского государственного университета), Даларгин - 1,2 мкг (Микроген НПО ФГУП, Россия) и Тимоген - 0,5 мкг (МБНПК ЦИТОМЕД ЗАО, Россия) на 1 кг массы тела соответственно. Крысам контрольной группы вводили физиологический раствор в эквивалентном объеме в течение того же периода времени. Животных выводили из эксперимента через 10 суток после перелома.
Интенсивность перекисного окисления липидов определяли по уровню малонового диальдегида (МДА) с использованием набора реактивов для определения ТБК-активных продуктов ("Агат", Россия) по общепринятому методу [9] с помощью спектрофотометра «DU-65» («Beckman», Великобритания). Состояние анти-оксидантной защиты определяли по активности каталазы крови [4].
Процесс консолидации переломов оценивали рентгенологически и гистологически. Лапы крыс фиксировали в 10% нейтральном формалине на 0,1 М фосфатном буфере рН=7,2. Затем изготовляли парафиновые срезы, окрашивали гематоксилином и эозином (Г+Э), после чего изучали мор-
фологическую картину наружной костной мозоли.
Полученные цифровые данные обрабатывались с помощью встроенных алгоритмов пакета анализа приложения для персонального компьютера. Достоверность различий сравниваемых параметров между средними значениями контроля и других групп животных определяли по перекрытию областей интервалов при р<0,05 и с помощью критерия Манна-Уитни.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Установлено, что в условиях экспериментального перелома введение всех выбранных для исследования пептидов по отдельности сопровождалось проявлением антиоксидантной активности, о чем свидетельствовало снижение уровня МДА и повышение активности каталазы крови (табл. 1). Причём эффект тимогена в отношении МДА был более выражен по сравнению с действием пептида GHL.
Было выявлено усиление активности каталазы при сочетанном применении пептидов. При этом наиболее выраженная активность каталазы в крови наблюдалась при использовании комбинации пептидов GHL+тимоген. В то же время концентрация МДА в этой группе была на уровне контроля. Также не было выявлено усиления эффекта в отношении МДА при использовании комбинаций GHL+даларгин и тимоген+даларгин.
Таким образом, при совместном применении пептидов GHL, тимогена и даларгина наблюдалось их синергичное стимулирующее действие на активность каталазы, но не на уровень МДА в крови. Предположительно, это могло быть связано с более выраженной активацией кислородза-висимого метаболизма нейтрофилов крови при сочетанном применении пептидов и, соответственно, более активным образованием свободных радикалов, стимулирующих оксидантные процессы в организме. Наиболее вероятен такой механизм при использовании тимогена, как известно, стимулирующего функции фагоцитов [7].
В результате проведенных рентгенологических исследований, было выявлено, что в группах животных, получавших пептиды по отдельности, и особенно у крыс, получавших комбинации пептидов, линия перелома была менее выражена по сравнению с контролем (рис. 1). Более выраженный репаративный эффект наблюдался в группе животных, получавших комбинацию GHL + дала-ргин, у которых линия перелома практически не прослеживалась.
Таблица
Влияние пептидов GHL, тимогена и даларгина, а также их комбинаций на антиоксидантные показатели крови (М±m, п=8) при экспериментальном переломе у крыс
№ группы Условия опыта МДА, мкмоль/л Каталаза, кат/л
1. Введение физиологического раствора (контроль) 5,47±0,24 1291,37±64,17
2. Введение GHL 4,09±0,22*1 1597,60±91,37*1
3. Введение даларгина 3,26±0,21*1 1530,15±93,82*1
4. Введение тимогена 2,68±0,16*1,2 1497,00±85,43*1
5. Введение комбинации GHL+даларгин 3,90±0,26*1,4 1811,33±101,53*1-4
6. Введение комбинации GHL+тимоген 5,50±0,21*234 2966,86±391,0*1"5
7. Введение комбинации тимоген+даларгин 3,66±0,41*16 1978,35± 196,60*1-4
Примечание: * - достоверность отличий (р<0,05), цифры рядом со звездочкой показывают, по отношению к показателю какой группы эти различия достоверны, п - количество животных в группах.
Д Е Ж
Рис. 1. Фотографии рентгенограмм бедренных костей лабораторных крыс через 10 суток после моделирования перелома.
А - Введение физиологического раствора (контроль), Б - введение пептида GHL, В - введение даларгина, Г - введение тимогена, Д - введение комбинации пептидов тимоген + GHL, Е - введение комбинации пептидов тимоген + даларгин, Ж - введение комбинации пептидов GHL + даларгин (линия перелома практически не прослеживается).
Выявленная закономерность также подтверждалась гистологическими исследованиями. Так, у животных, получавших физиологический раствор (контроль), гистологически костная мозоль над местом перелома была представлена массивной зоной пролиферирующих остеогенных клеток, в толще которой в неваскуляризированных местах обнаруживались крупные скопления клеток хрящевой ткани (рис. 2, слева). В дистально расположенных от места перелома отделах костная мозоль была образована васкуляризирован-ной тканью из остеогенных клеток, в глубине которой в непосредственной близости с сохранившей жизнеспособность тканью костных отломков обнаруживались новообразованные остеобластами костные трабекулы (рис. 2, справа).
У животных получавших пептид GHL, в области перелома в краях костных отломков наблюдалась активная резорбция остеокластами погибшей костной ткани. Над костными отломками располагался широкий слой, представленный множеством мелких сосудистых полостей и интенсивно пролиферирующими остеогенными клетками (многочисленные митозы клеток), среди остеогенных клеток встречались мелкие очаговые скопления хондроцитов. В костной мозоли, расположенной дистальнее от места перелома, наблюдалось интенсивное новообразование костных трабекул, имеющих непосредственную связь с сохранившей жизнеспособность тканью костных отломков, с формированием губчатой костной ткани (рис. 3).
В группе животных, получавших даларгин, видимых морфологических различий с крысами, которым вводили пептид GHL, не было выявле-
но. Наблюдались репаративные изменения, сопоставимые с теми, которые отмечались у животных, получавших пептид GHL. Наименее выраженные репаративные изменения наблюдались в группе животных, получавших тимоген.
При сочетанном применении пептидов наблюдалось усиление репаративной активности с максимальной выраженностью в группе крыс, получавших комбинацию GHL + даларгин. Наружная костная мозоль у этих животных в области места перелома была представлена двумя слоями: над костными отломками в тесной связи с их тканью слой новообразованных остеобластами костных трабекул, кнаружи - покрытый фиброзным слоем надкостницы слой остеогенных клеток с мелкими очаговыми скоплениями хон-дроцитов, (рис. 4, слева). В дистальных от линии перелома отделах костной мозоли обнаруживалась в тесной связи с тканью костного отломка новообразованная костная ткань с надкостницей и с явлениями перестройки в компактную кость (рис. 4, справа).
Учитывая вышеперечисленное, можно заключить, что выбранные для исследования пептиды при экспериментальном переломе обладали синергичным антиоксидантным и репаративным действием, поскольку при комбинированном введении препаратов наблюдалось существенное усиление антиоксидантного (активность катала-зы) и репаративного эффектов по сравнению с использованием препаратов по отдельности. При этом более выраженные репаративные изменения были выявлены в группе комбинированного введения пептидов GHL + даларгин.
Рис. 2. Фотографии гистологических срезов наружной костной мозоли лабораторных крыс, получавших физиологический раствор (контроль) через 10 суток после перелома бедренной кости (фото).
Слева - крупное скопление хрящевых клеток, кнаружи от которого - слой остеогенных клеток (микрофото, окраска гематоксилин + эозин (Г+Э), х200); справа - новообразованные костные трабекулы, непосредственно связанные с костным отломком (микрофото, Г+Э, х140).
Рис. 3. Гистология наружной костной мозоли у животных, получавших пептид GHL, через 10 суток после перелома бедренной кости (фото).
Слева - новообразование костных трабекул, кнаружи - слой из остеогенных клеток (микрофото, Г+Э, х200); справа - новообразованные костные трабекулы, формирование губчатой кости (микрофото, Г+Э, х200).
Рис. 4. Гистологическая картина наружной костной мозоли у животных, получавших комбинацию пептидов Gly-His-Lys +даларгин, через 10 суток после перелома бедренной кости (фото).
Слева - над костными отломками в тесной связи с их тканью слой новообразованных остеобластами костных трабекул, кнаружи - слой остеогенных клеток, покрытый фиброзным слоем надкостницы (микрофото, Г+Э, х140); справа - в тесной связи с тканью костного отломка новообразованная костная ткань с надкостницей и с явлениями перестройки в компактную кость (микрофото, Г+Э, х200).
Известно, что при большинстве острых и хронических заболеваний, интоксикациях, ожогах, в том числе и при травмах костей, наблюдается активация свободнорадикальных реакций, что сопровождается перекисным окислением липидов биологических мембран, снижением их прочности и разрушением [3]. В результате этого снижается активность ферментных систем, расположенных в мембранах, и, как следствие, наблюдается ослабление синтеза макроэргических соединений, что приводит к торможению процессов синтеза белков, нуклеиновых кислот, и в конеч-
ном счете к замедлению процессов регенерации. В связи с этим снижение активности свободнорадикальных реакций и активация антиоксидантной системы целесообразно в комплексной терапии многих патологических процессов, в том числе и при переломах [3]. В связи с этим наличие анти-оксидантной активности у препарата или фармакологического сочетания, как правило, позитивным образом сказывается на их репаративном действии.
Поэтому выраженная репаративная активность комбинации GHL + даларгин могла быть
