CC BY
132
УДК 577.112:615.37] :616.001.5
ПРИМЕНЕНИЕ РЕГУЛЯТОРНЫХ ПЕПТИДОВ: ТИМОГЕНА, ДАЛАРГИНА, ГЛИЦИЛ-ГИСТИДИЛ-ЛИЗИНА И ИХ КОМБИНАЦИЙ ДЛЯ КОРРЕКЦИИ НЕЙТРОФИЛЬНОГО ЗВЕНА АНТИИНФЕКЦИОННОГО ИММУНИТЕТА ПРИ ПЕРЕЛОМЕ БЕДРЕННОЙ КОСТИ
© Чердаков В.Ю., Смахтин М.Ю., Дубровин Г.М., Бобынцев И.И.
Кафедра биологической химии, кафедра травматологии, ортопедии и военно-полевой хирургии, кафедра патофизиологии Курского государственного медицинского университета, Курск
E-mail: vic.cherdakov@rambler.ru
При переломах бедренной кости у лабораторных крыс выявлено снижение функциональной активности нейтро-филов крови. Введение в эквимолярных дозах пептидов Gly-His-Lys (0,5 мкг/кг), даларгина (1,2 мкг/кг) и тимогена (0,5 мкг/кг) внутрибрюшинно, в течение 10 дней, сопровождалось стимулирующим действием на функцию нейтрофи-лов крови, более выраженным у тимогена. Пептиды обладали синергичным иммуностимулирующим и репаративным действием, поскольку при комбинированном введении препаратов наблюдалась более выраженная активация функции нейтрофилов и репаративной регенерации костей по сравнению с использованием препаратов по отдельности. Комбинация Gly-His-Lys + даларгин корригировала как поглотительную стадию фагоцитоза нейтрофилов, так и их кислородзависимую активность, что сопровождалось выраженной активацией восстановительных процессов. Синергичное действие пептидов Gly-His-Lys, тимогена и даларгина может быть использовано для стимуляции репаративно-го остеогенеза.
Ключевые слова: тимоген, даларгин, пептид Gly-His-Lys, экспериментальный перелом, функция нейтрофилов, репаративный остеогенез.
THE APPLICATION OF REGULATORY PEPTIDES: THYMOGEN, DALARGIN, GLYCYL-HISTIDYL-LYSINE AND THEIR COMBINATIONS FOR CORRECTION OF NEUTROPHIL LINK OF ANTIINFECTION IMMUNITY IN TUBULAR BONE FRACTURE Cherdakov V. Yu., Smakhtin M. Yu., Dubrovin G.M., Bobyntsev I.I.
Biochemistry Department, Traumatology, Orthopedic & Military Surgery Department, Pathophysiology Department
of Kursk State Medical University, Kursk
The decreased functional activity of blood neutrophils has been established in experimental bone fracture in rats. The intraperitoneal injections of peptides in equimolar doses - Gly-His-Lys (0.5 ^g/kg), dalargin (1.2 ^g/kg) and thymogen (0.5 ^g/kg) during 10 days resulted in their immunostimulating action on the blood neutrophil activities with the more expressed action in thymogen. The peptides had synergetic immunostimulating and reparative actions because in case of twin combined injections of these substances the essential amplification of immune (neutrophil activity) and reparative effects was observed in comparison with the individual injections of peptides. The peptide combined injection Gly-His-Lys + dalargin corrected both the intake stage of neutrophil phagocytosis and their oxidative activity that resulted in the expressed activation of reparative processes. The synergetic action of peptides Gly-His-Lys, thymogen and dalargin might be used for stimulation of reparative osteogenesis.
Keywords: thymogen, dalargin, peptide Gly-His-Lys, experimental bone fracture, function of neutrophils, reparative osteogenesis.
В последние годы проблема регенерации костной ткани остается по-прежнему актуальной. Это обусловлено ростом травматизма за счет увлечения экстремальными видами спорта и туризма, повышением количества дорожнотранспортных происшествий и случаев производственной травмы [3].
При травмах наблюдаются существенные изменения в иммунной системе: неспецифическая активация иммунной системы в период первичных реакций на травму и ранних осложнений, посттравматическая иммуносупрессия в период последствий первичных реакций и шока, вторичные иммунодефициты в период поздних осложнений травмы [2, 3]. В то же время получены убе-
дительные данные о существенном влиянии иммунной системы на восстановительные процессы опорно-двигательного аппарата [3, 8]. При этом известно, что нейтрофилы первые из фагоцитов приходят в очаг воспаления и от их активности существенно зависит вероятность нагноения и длительность патологического процесса [11].
Пептидные молекулы являются компонентами регуляторных систем организма: нервной, эндокринной, иммунной, которые осуществляют их взаимодействие [1]. В связи с этим одним из перспективных направлений медицины считается использование регуляторных пептидов для стимуляции репаративной регенерации поврежденных тканей. Известен пептид, непосредственно
стимулирующий процессы роста и дифференци-ровки клеток - глицил-гистидил-лизин (Gly-His-Lys) [14].
Учитывая существенное влияние иммунной системы на восстановительные процессы, также актуально дальнейшее изучение эффектов и механизмов действия пептидного иммуномодулятора тимогена (Glu-Trp), а в связи с наличием выраженного болевого синдрома при переломах, представляется целесообразным и выявление эффектов пептидных компонентов стресс-лимитирующей системы организма. Принимая во внимание тот факт, что опиатные рецепторы для энкефалинов обнаружены в большинстве органов и тканей [5], выявление эффектов аналога нативного лейэнкефалина - даларгина по-прежнему актуально.
Поскольку в нейроэндокринной регуляции значительный интерес представляют вопросы потенцирования или ослабления эффектов регуляторных пептидов [1], также целесообразно изучение эффектов комбинированного введения пептидных субстанций.
В связи с этим целью настоящего исследования было выявление эффектов регуляторных пептидов - тимогена, даларгина, Gly-His-Lys и их комбинаций на функцию нейтрофилов крови, а также их репаративной активности в условиях экспериментального перелома бедренной кости.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Опыты проводились на крысах Вистар массой 180-220 граммов, которым под хлоралгидратным наркозом производился закрытый перелом правой бедренной кости с последующей интрамедулляр-ной фиксацией её спицей [10]. Соответствующую навеску пептида растворяли в 0,1 мл физиологического раствора и в течение 10 дней со дня перелома вводили животным внутрибрюшинно, в эк-вимолярных дозах Gly-His-Lys (GHL) - 0,5 мкг (синтезирован в НИИ химии Санкт-Петербургского государственного университета), Даларгин - 1,2 мкг (Микроген НПО ФГУП, Россия) и Тимоген - 0,5 мкг (МБНПК ЦИТОМЕД ЗАО, Россия) на 1 кг массы тела соответственно. Крысы контрольной группы получали физиологический раствор в эквивалентном объеме в течение того же периода времени. Животных выводили из эксперимента через 10 суток после перелома.
Фагоцитарную активность нейтрофилов крови исследовали после их инкубации с латексом [6, 12]. Для оценки фагоцитарной активности нейтрофилов использовали фагоцитарный индекс (ФИ) и фагоцитарное число (ФЧ). ФИ (процент
нейтрофилов, участвующих в фагоцитозе) и ФЧ (среднее количество поглощенных частиц латекса на один фагоцит) определяли в мазках, окрашенных по Романовскому [6, 12]. В каждом мазке просчитывали 100 нейтрофилов. Вычислялся индекс активности фагоцитов (ИАФ) (число фагоцитированных частиц латекса, умноженное на процент фагоцитирующих клеток и разделенное на число подсчитанных клеток) [12].
Кислородзависимую активность нейтрофилов определяли по реакции восстановления нитроси-него тетразолия (НСТ-тест) с использованием Multiscan MC 400 (Labsystems, Финляндия) [4]. В качестве стимулятора использовали зимозан. Функциональный резерв нейтрофилов (ФРН) рассчитывали как отношение показателей стимулированного и спонтанного НСТ-теста [4, 12].
Процесс консолидации переломов оценивали рентгенологически с использованием диагностического комплекса Dixion Redikom (Россия).
Полученные цифровые данные обрабатывались с помощью встроенных алгоритмов пакета анализа приложения для персонального компьютера. Достоверность различий сравниваемых параметров между средними значениями контроля и других групп животных определяли по перекрытию областей интервалов при р<0,05 и с помощью критерия Манна-Уитни.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Установлено, что при экспериментальном переломе наблюдалось существенное снижение показателей ФИ, ФЧ и ИАФ, что свидетельствовало об ослаблении фагоцитарной активности нейтро-филов крови (рис. 1). В этих условиях все пептиды, введенные по отдельности, повышали процент участвующих в фагоцитозе нейтрофилов ФИ, а также ФЧ и ИАФ по сравнению с контрольной группой, получавшей инъекции физиологического раствора. При этом наибольшей стимулирующей активностью обладал тимоген, о чем свидетельствовало более выраженное повышение ФИ и ИАФ по сравнению с другими пептидами.
При использовании комбинаций пептидов наблюдалось усиление эффекта. При этом коррекция изучаемых показателей наблюдалась в группах животных, получавших комбинацию пептидов GHL + тимоген и GHL + даларгин.
При переломе бедренной кости также наблюдалось снижение показателей кислородзависимой бактерицидной активности нейтрофилов и сопровождалось угнетением их функционального резерва (рис. 1). Раздельное введение даларгина и
тимогена усиливало кислородзависимую активность нейтрофилов.
При комбинированном введении тимогена или даларгина с пептидом GHL, усиление эффекта наблюдалось только в группе животных, получавших комбинацию GHL+даларгин и сопровождалось коррекцией функционального резерва нейтрофилов (рис. 1).
Таким образом, при переломах трубчатых костей комбинация GHL+даларгин корригировала как поглотительную стадию фагоцитоза нейтро-филов, так и их кислородзависимую активность, тогда как комбинация GHL + тимоген проявляла иммунокорригирующее действие только в отношении поглотительной стадии фагоцитоза нейтрофилов крови.
Функциональн 4 5 ый резерв
В результате проведенных рентгенологических исследований было выявлено, что в группах животных, получавших пептиды по отдельности,
и, особенно, у крыс, получавших комбинации пептидов, линия перелома была менее выражена по сравнению с контролем (рис. 2). Более выраженный репаративный эффект наблюдался в группе животных, получавших комбинацию GHL + даларгин, у которых линия перелома практически не прослеживалась. Выявленная закономерность также подтверждалась ранее проведенными гистологическими исследованиями [13].
Травма вызывает существенные изменения в процессах иммунной защиты организма. Известно, что при стрессорных воздействиях уменьшается масса тимуса преимущественно вследствие
3.5 з
2.5 2
1.5 1
0,5
0
нейтрофилов 4 -(коэффициент кАо)
1
2
з
4
5
б
7
Рис. 1. Влияние регуляторных пептидов GHL, тимогена и даларгина, а также их комбинаций на уровень функционального резерва (М±ш, n=8) нейтрофилов крови при экспериментальном переломе у крыс.
Обозначения: --------------- линия - уровень интактных животных .
Столбики - животные с экспериментальным переломом.
1. Введение физиологического раствора (контроль). 2. Введение GHL. З. Введение даларгина. 4. Введение тимогена. 5. Введение GHL+даларгин.
б. Введение GHL+тимоген. 7. Введение тимоген+даларгин.
Примечание: * - р<0,05, различия достоверны по отношению к группе контроля
п
А Б В Г Д Е Ж
Рис. 2. Фотографии рентгенограмм бедренных костей лабораторных крыс через 10 суток после моделирования перелома.
А - Введение физиологического раствора (контроль), Б - введение пептида GHL, В - введение даларгина, Г - введение тимогена, Д - введение комбинации пептидов тимоген + GHL, Е - введение комбинации пептидов тимоген + даларгин, Ж - введение комбинации пептидов GHL + даларгин (линия перелома практически не прослеживается).
опустошения лимфоидных структур его коркового слоя [3]. В связи с этим целесообразно применение тимогена в этих условиях, обладающего тимомиметическими иммуномодулирующими свойствами [9]. По-видимому, его комбинация с такими репарантами, как даларгин и пептид GHL, усиливает репаративную активность благодаря сочетанию непрямого репаративного действия (через иммунную систему) с непосредственным воздействием на клетки костной ткани.
При переломах длинных трубчатых костей отмечается угнетение клеточного и гуморального иммунитета [3, 7]. При этом в условиях сниженной иммунной функции активность репаративных процессов также, как правило, снижается [2]. В то же время показано, что стимуляция иммунитета ускоряет сращение переломов [3, 7]. В связи с этим, коррекция иммунной функции целесообразна в комплексной терапии многих патологических процессов, в том числе и при переломах [9]. Наличие иммунокорригирующей активности у препарата или фармакологического сочетания, как правило, позитивным образом сказывается на их репаративном действии.
При этом выраженная репаративная активность комбинации GHL + даларгин могла быть обусловлена не только непосредственным действием двух пептидов-репарантов [5, 14] на клетки костной ткани, но и сочетанием синергичной иммунокорригирующей активности, а также проявлением стресс-лимитирующего действия далар-гина [5].
Учитывая вышеперечисленное, можно заключить, что выбранные для исследования пептиды при экспериментальном переломе обладали синергичным иммуностимулирующим и репаратив-ным действием, поскольку при комбинированном введении препаратов наблюдалось существенное усиление активности нейтрофилов крови и репа-ративного действия, по сравнению с использованием препаратов по отдельности. При этом более выраженный иммунокорригирующий эффект в отношении функции нейтрофилов крови и, соответственно, более выраженное репаративное действие было выявлено в группе комбинированного введения пептидов GHL + даларгин. Более выраженный репаративный эффект этой комбинации может быть связан с её иммунокорригирующим действием, а именно с более выраженным влиянием на восстановительные процессы, осуществляемым через иммунную систему.
Таким образом, при переломах трубчатых костей комбинация GHL+даларгин корригирует как поглотительную стадию фагоцитоза нейтрофи-лов, так и их кислородзависимую активность, что
сопровождается выраженной активацией восстановительных процессов и может быть использовано для стимуляции репаративного остеогенеза.
ЛИТЕРАТУРА
1. Акмаев И.Г. Современные представления о взаимодействиях регулирующих систем: нервной, эндокринной и иммунной // Успехи физиол. наук. -1996. - Т. 27, № 1. - С. 3-20.
2. Алексеева И.Н., Брызгина Т.М., Павлович С.И., Ильчевич Н.В. Печень и иммунологическая реактивность. - Киев, 1991. - 168 с.
3. Бердюгина О.В. Иммунологическое прогнозирование в травматологии и ортопедии. - Екатеринбург: ИздатНаукаСервис, 2009. - 251 с.
4. Зинкин В.Ю., Годков М.А. Способ количественной оценки кислородзависимого метаболизма нейтро-фильных гранулоцитов человека // Клин. лаб. диагност. - 2004. - № 8. - С. 26-29.
5. Максакова Е.В. Даларгин в лечении травматических повреждений роговицы // Офтальмолог. журнал. - 2000. - № 6. - С. 95-97.
6. Медведев А.Н. Способ исследования поглотительной фазы фагоцитоза // Лаб. дело. - 1991. - № 2. -С. 19-20.
7. Осадчий О.Е. Нейротензин: физиологические
свойства и роль в регуляции функций организма // Успехи физиолог. наук. - 2004. - Т. 35, № 2. -С. 3-21.
8. Склянчук Е.Д., Зоря В.И., Гурьев В.В., Васильев А.П. Остеогенные потенции нативного аутогенного костного мозга, индуцированного кристаллическим химотрипсином, при лечении посттравма-тических нарушений костной регенерации // Травматолог. и ортопед. России. - 2009. - № 1. - С. 1521.
9. Смирнов В.С. Клиническая фармакология тимогена. - СПб: Ред., 2004. - 106 с.
10. Файтельсон А.В., Дубровин Г.М., Гудырев О.С. и др. Фармакологическая коррекция экспериментального остеопороза и переломов на его фоне // Вестник травматолог. и ортопед. им. Н.Н. Приорова. - 2010. - № 3 . - С. 47-51.
11. Фрейдлин И.С. Базофилы и тучные клетки // Клетки иммунной системы, Т. 4. - СПб.: Наука, 2001. -308 с.
12. Фримель Г. Иммунологические методы. - М.: Медицина, 1987. - 472 с.
13. Чердаков В.Ю., Смахтин М.Ю., Дубровин Г.М. и др. Синергичное антиоксидантное и репаративное действие тимогена, даларгина и пептида gly-his-lys при переломе трубчатых костей // Курский науч.-практ. вест. «Человек и его здоровье». - 2010. -№ 4. - С. 15-20.
14. Trackhy R.E., Fors T.D., Pickart L., Uno H. The hair follicle-stimulating properties of peptide copper complexes. Results in C3H mice // Ann. N.-Y. Acad. Sci. - 1991. - Vol. 642, N 10. - P. 468-469.
