CC BY
70
ный механизм действия, что подтверждается отсутствием дозозависимого эффекта. В основе же действия резвератрола, видимо, лежит его способность активировать конститутивный фермент - эндотелиальную N0-синтазу.
Для исследования возможности фармакологической коррекции гипоэстроген-индуцированной эндотелиальной дисфункции с помощью препаратов с доказанной эффективностью и их комбинаций с ДМ-05 и резвератролом, нами выбраны: ингибитор ан-гиотензинпревращающего фермента -эналаприл в дозе 0,5 мг/кг и блокатор АТ1 рецепторов - лозартан в дозе 6 мг/кг. В данных дозах, соответствующих минимальным суточным, наиболее эффективным оказался эналаприл, при применении которого происходило достоверное снижение коэффициента эндотелиальной дисфункции, предотвращение повышения адренореактивности и исчерпания миокардиального резерва.
Следует отметить тот факт, что все исследуемые препараты в изученных дозах проявляли эндотелио- и кардиопротективную активность, но не достигали целевых значений артериального давления.
Учитывая вышеизложенное, определилась необходимость в изучении сочетаний фуро-станоловых гликозидов из культуры клеток растения БюБсогеа Бе11»1ёеа - ДМ-05 и резвератрола с эналаприлом и лозартаном.
При проведении исследования обнаружено, что комбинированное использование ДМ-05 (1 мг/кг) и резвератрола (2 мг/кг) с эналаприлом 0,5 мг/кг оказывало выраженное эндотелиопротективное действие, что выражалось в снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД) до уровня, близкого к интактным животным. Важно подчеркнуть, что при этом достигались целевые цифры АД, что не выявлено при монотерапии отдельно ДМ-05, резвератролом и эналаприлом. Одновременно результаты нагрузочных проб выявили способность комбинаций предотвращать повышение адренореактивности и исчерпание миокардиального резерва у животных с гипоэстроген индуцированной патологией.
Сочетанное использование блокатора АТ1 рецептора лозартана с фуростаноловыми гли-козидами из культуры клеток растения Бь
oscorea Deltoidea (ДМ-05) и резвератролом по совокупности функциональных показателей, отражающих степень эндотелиальной дисфункции, уступает сочетанию эналаприла с ДМ-05 и резвератролом. Можно предположить, что наличие брадикининового компонента у эналаприла позволяет в большей степени проявить эффективность фитоэстрогенов в условиях моделирования гипоэстроген-индуцированной эндотелиальной дисфункции.
В результате исследования эндотелио- и кардиопротективных эффектов комбинаций ДМ-05 и резвератрола с эналаприлом, а также с лозартаном на модели гипоэстроген-индуцированной эндотелиальной дисфункции установлено, что указанные комбинации позволяют за счет патогенетически обоснованного воздействия на ренин-ангиотензиновую систему [7], коррекции утраченной эстроген-продуцирующей функции [6] и восстановления активности фермента eNOS рекомендовать данные комбинации к широкому клиническому изучению.
ЛИТЕРАТУРА
1. Галаган М.Е., Широколова А.В., Ванин А.Ф. Гипотензивное действие оксида азота, продуцируемого из экзо-и эндогенных источников // Вопр. мед. химии. - 1991. - Т. 37, № 1. -С.67-70.
2. Гурбанов К.К., Ковалев Г.В., Паперно А.А. Сравнительная оценка антиишемического действия верапамила на разных моделях ишемии миокарда // Фармакология и токсикология. - 1991. - Т. 54, № 4. - С. 21-23.
3. Кулаков В.И., Сметник В.П. Руководство по климактерию. - М.: Мед. информ. агентство, 2001. - С. 404-495.
4. Покровский М.В., Кочкаров В.И., Покровская Т.Г. и др. Новый взгляд на коррекцию эндотелиальной дисфункции // Российский журнал иммунологии. - 2006. - Т. 9. -С.60-61.
5. Сметник В.П., Тумилович Л.Г. Неоперативная гинекология: рук-во для врачей. - М.: Мед. информ. агентство, 1997. - 356 с.
6. Сметник В.П., Шестакова И.Г. Менопауза и сердечно-сосудистая система // Терапевтический арх. - 1999. - Т. 71, № 10. - С. 61-65.
7. Laursen J.B., Rajagopalan S., Galis Z. et al. Role of superoxide in angiotensin Il-induced but not catecholamine-induced hypertension // Circulation. - 1997. - Vol. 95. - P. 588-593.
УДК 616.5-001.41 РЕПАРАТИВНАЯ И ИММУНОТРОПНАЯ АКТИВНОСТЬ ПЕПТИДА GLY-HIS-LYS В УСЛОВИЯХ КОЖНЫХ РАН
© Курцева А.А., Смахтин М.Ю., Иванов А.В., Беседин А.В., Чердаков В.Ю.
Кафедра анатомии человека, кафедра биологической химии, кафедра гистологии, кафедра микробиологии Курского государственного медицинского университета
В статье представлены результаты изучения репаративного действия пептида глицил-гистидил-лизина (Gly-His-Lys) на модели кожных ран у крыс. Выявлено стимулирующее действие пептида на регенерацию кожи в дозах 0,5 и 1,5 мкг/кг при его внутрибрюшинном введении. При этом пептид оказывал преимущественно супрессивное влияние на кислородзависимые механизмы защиты нейтрофилов крови, снижая их функциональный резерв.
Ключевые слова: глицил-гистидил-лизин, регенерация кожных ран, функция нейтрофилов крови.
THE EFFECTS OF GLY-HIS-LYS PEPTIDE ON NEUTROPHIL FUNCTIONS AND ITS REGENERATIVE ACTIVITY IN SKIN WOUNDS Kurtseva A.A., Smakhtin M. Yu., Ivanov A.V., Besedin A.V., CherdakovV. Yu.
Human Anatomy Department, Biochemistry Department, Histology Department, Microbiology Department of the Kursk State Medical University
On the models of skin wounds in rats the reparative action of the peptide glycyl-histidyl-lysine (Gly-His-Lys) was found out in the doses of 0.5 and 1.5 mkg/kg in intraperitoneal injections. The peptide had mainly immuno-supressive effect on oxygen-dependent mechanism of blood neutrophils, decreasing their functional reserve.
Key words: glycyl-histidyl-lysine, regeneration of skin wounds, function of blood neutrophils.
В последние годы рост травматизма наблюдается во многих странах, в том числе и в России, где травмы вышли на 2-е место среди причин временной нетрудоспособности [6]. В связи с этим, по-прежнему, актуален поиск новых эффективных средств, стимулирующих заживление ран.
Ключевыми факторами, ответственными за поддержание гомеостаза в организме считаются нейроэндокринная и иммунная системы, которые тесно взаимосвязаны и имеют единый механизм химической регуляции [1]. При повреждении ткани (в том числе и кожной) данные системы контролируют основные этапы регенерации с помощью регуляторных пептидов [12]. Выявление их репара-тивных эффектов представляет не только теоретический, но и практический интерес.
Одним из пептидов, участвующих в регуляции процессов роста и дифференцировки клеток, является ростовой фактор NH2-Gly-L-His-L-Lys-COOH (GHL). Так как этот пептид повышал выживаемость гепатоцитов in vitro, то первоначально был назван фактором роста клеток печени [9]. Также известно стимули-
рующее влияние этого пептида на рост волос [10], синтез коллагена фибробластами [8] и накопление межклеточного вещества соединительной ткани. В то же время иммунотроп-ные и репаративные эффекты этого пептида требуют дальнейшего изучения.
Поскольку в процессе регенерации тканей непосредственное участие принимают нейтрофилы, было целесообразно выявить влияние ОНЬ на их функцию.
В связи с этим, целью проведенного нами экспериментального исследования было выявление эффектов различных доз глицил-гистидил-лизина на заживление кожных ран и активность нейтрофилов крови.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Опыты проводились на крысах Вистар массой 180-220 г, которым под эфирным наркозом на холке наносили кожные раны стандартного размера [3]. Нами был использован препарат ОНЬ, синтезированный в НИИ химии Санкт-Петербургского государ-
ственного университета, в дозах 0,15; 0,5; 1,5; 5,0 и
15 мкг/кг массы, который растворялся в 0,1 мл изотонического раствора хлорида натрия и вводился внутрибрюшинно, десятикратно, с интервалом в 24 часа между инъекциями. Введение пептида начиналось одновременно с нанесением кожных ран. Контролем служили животные, получавшие эквивалентный объем физиологического раствора (№01).
Фагоцитарную активность нейтрофилов крови оценивали по уровням фагоцитарного индекса (ФИ) и фагоцитарного числа (ФЧ), после их инкубации с латексом [5], определяли завершенность фагоцитоза (ЗФ) [4]. Активность кислородзависимых механизмов защиты в фагоцитах оценивали в тесте восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест) по уровням спонтанной (НСТ-сп.) и стимулированной (НСТ-инд.) реакций, при этом в качестве стимулятора использовали зимозан [7]. Функциональный резерв нейтро-филов (ФРН) рассчитывали как разность показателей стимулированного и спонтанного НСТ-теста. Скорость заживления ран определяли путем динамического измерения площади раны. Для оценки степени заживления раны использовали специальный показатель -величину относительного заживления (У), определяемую по формуле: У= Бо-Б! / Бо, где Бо - начальная площадь раны, Б! - её площадь в день выведения из эксперимента (на десятый день после нанесения раны) [3]. Через 10 суток с момента нанесения ран проводились гистологические исследования раневых срезов. Кусочки кожи фиксировали в 10% растворе формалина, заливали в парафин, после чего изготавливали парафиновые
срезы, которые окрашивали гематоксилином и эозином по стандартной методике. Статистическую обработку проводили, вычисляя М±т. Достоверность различий средних величин оценивали с помощью критерия Манна-Уитни.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
ОНЬ в наименьшей использованной дозе - 0,15 мкг/кг не влиял на заживление кожных ран, тогда как использование пептида в дозах 0,5 и 1,5 мкг/кг обладало стимулирующим действием (табл. 1). Причем наибольшую ранозаживляющую активность пептид проявлял в дозе 0,5 мкг/кг, о чем свидетельствовало сокращение конечной площади раны в 3,5 раза и повышение коэффициента относительного заживления в 1,7 раза, по сравнению с контрольной группой животных, получавших физиологический раствор. При использовании пептида в дозе 1,5 мкг/кг площадь кожных ран сокращалась ко дню выведения из эксперимента в 1,6 раза, а величина относительного заживления возрастала в 1,4 раза, по сравнению с контролем. Повышение дозы пептида до 5 или 15 мкг/кг приводило к исчезновению ранозаживляющей активности (табл. 1).
Репаративное действие ОНЬ подтверждалось морфологическими исследованиями раневых срезов. По сравнению с контрольной группой животных (рис. 1), у крыс, получавших пептид в дозе 0,5 мкг/кг (рис. 2), отмечается уменьшение отека в области раны, выраженное снижение плотности клеточного инфильтрата за счет меньшего количества лимфоцитов и макрофагов, а также преобла-
Таблица 1
Влияние пептида ОІу-НІБ-Ьув на заживление (М±т) кожных ран у крыс
№ Условия опыта Начальная площадь раны, мм2 Площадь раны в день выведения из эксперимента, мм2 Относительное заживление раны
1. Введение изотонического раствора хлорида натрия (контроль) 105,2± 17,2 43,2±8,2 0,54±0,08
2. Введение пептида в дозе 0,15 мкг/кг 104,6± 15,6 36,7±8,6 0,65±0,07
3. Введение пептида в дозе 0,5 мкг/кг 100,2±21,9 12,4±4,2* 0,91±0,09*
4. Введение пептида в дозе 1,5 мкг/кг 107,8±21,9 26,6±5,2* 0,74±0,07*
5. Введение пептида в дозе 5 мкг/кг 103,8±23,5 55,3±6,2 0,46±0,09
6. Введение пептида дозе 15 мкг/кг 117,5± 19,4 75,3±13,7* 0,37±0,08*
Рис. 1. Срез раны через 10 суток с момента формирования ран.
Введение физиологического раствора. Увеличение х 40. Окраска гематоксилин-эозином.
Рис. 2. Срез раны через10 суток с момента формирования ран.
Введение пептида Gly-His-Lys в дозе 0,5 мкг/кг. Увеличение х 40. Окраска гематоксилин-эозином.
дание зрелых фибробластов над незрелыми, что свидетельствует о более благоприятном течении процессов регенерации под влиянием пептида.
Полученные данные свидетельствуют о том, что проявление репаративного эффекта ОНЬ зависит от его дозы. Тот факт, что повышение дозы ОНЬ не только не усиливало эффекты пептида, но даже ослабляло их, мо-
жет быть следствием механизма обратной отрицательной связи. Результатом этого может быть существенное снижение экспрессии рецепторов сигнальных молекул при длительном воздействии их агонистов [11]. ОНЬ в дозах 0,15 и 0,5 мкг/кг не оказывал существенного влияния на функцию нейтрофилов крови (табл. 2).
Введение пептида в дозе 1,5 мкг/кг при- снижалась стимулированная реакция НСТ-
водило к повышению ФИ и ЗФ, но при этом
Таблица 2
Влияние ОНЬ на функциональную активность (М±т) нейтрофилов крови
№ Условия опыта Фагоцитарный индекс, % Фагоцитарное число, абс. Завершенность фагоцитоза, % НСТ-сп., % НСТ-инд., % Функциональный резерв, %
1. Контроль (ШС1) 39,7±2,4 1,6±G,2 59,5±4,6 26,3±2,5 62,2±5,4 36,2±3,1
2. Введение ОНЬ в дозе 0,15 мкг/кг 4G,2±3,4 1,5±G,2 61,8±3,4 25,8±2,1 58,1±5,1 32,1±2,8
3. Введение GHL в дозе 0,5 мкг/кг 41,2±3,7 1,7±G,2 63,6±3,6 26,4±2,2 57,2±4,8 3G,3±2,6
4. Введение GHL в дозе 1,5 мкг/кг 54,4±3,8*1,2 1,4±G,2 72,8±3,3*1,2 31,6±3,G 49,6±4,2*1 2G,5±1,3*1,2
5. Введение GHL в дозе 5,0 мкг/кг 38,8±2,9 1,4±G,1 55,8±4,8 3G,7±3,8 58,5±4,6 26,1±1,1*1
6. Введение GHL в дозе 15 мкг/кг 36,8±1,6 1,4±G,1 54,8±4,6 31,3±3,5 56,8±5,4 25,4±1,9*1
Примечание: 1. НСТ-сп. - % формазан-положительных клеток в спонтанной реакции НСТ-теста, 2. НСТ-инд. - % формазан-положительных клеток в стимулированной зимозаном реакции НСТ-теста, 3. * - показывает достоверные отличия, р<0,05, а рядом стоящая цифра - номера групп сравнения.
теста и соответственно ФРН. Повышение ФИ могло быть связано с активацией компенсаторных механизмов в ответ на снижение активности кислородзависимых механизмов защиты. При более высоких концентрациях пептида (5 и 15 мкг/кг) также наблюдалось снижение ФРН, но при этом не было выявлено стимулирующего влияния пептида на показатели их фагоцитарной активности, что свидетельствовало о супрессирующем влиянии пептида в этих дозах на функцию нейтрофилов крови.
Таким образом, GHL обладал преимущественно иммуносупрессорным действием на функцию нейтрофилов, что могло ослабить восстановление поврежденной ткани, так как известно, что в условиях сниженной иммунной функции активность репаративных процессов также, как правило, снижается [2].
Учитывая тот факт, что по большинству показателей выраженной иммуностимулирующей активности GHL в условиях кожных ран не выявлено, можно предположить, что
его репаративные эффекты реализуются не через иммунную систему, а, скорее всего, связаны с непосредственным действием пептида на клетки кожи и проявляются преимущественно в малых дозах (0,5 и 1,5 мкг/кг).
Хотелось бы подчеркнуть, что точно такая же последовательность аминокислот, как и в GHL, обнаружена в молекуле коллагена [8]. В связи с этим, можно предположить, что этот пептид образуется под влиянием протеаз в месте повреждения и стимулирует восстановительные процессы, что, очевидно, и является его физиологической функцией [8]. Подобный механизм действия характерен для периферических пептидов, образующихся в результате частичного протеолиза соответствующих белков и осуществляющих ауто-кринную или паракринную регуляцию [1].
Таким образом, использование пептида Gly-His-Lys в дозах 0,5 и 1,5 мкг/кг стимулировало заживление кожных ран у крыс. Возможно, что после соответствующей апробации ранозаживляющая активность пептида
