Научная статья на тему 'Влияние аминокислот, составляющих пептид глицил-гистидил-лизин, на регенерацию кожных ран и функцию нейтрофилов'

Влияние аминокислот, составляющих пептид глицил-гистидил-лизин, на регенерацию кожных ран и функцию нейтрофилов Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

CC BY
1431
172
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
ГЛИЦИЛ-ГИСТИДИЛ-ЛИЗИН / ГЛИЦИН / ГИСТИДИН / РЕГЕНЕРАЦИЯ КОЖНЫХ РАН / ФУНКЦИЯ НЕЙТРОФИЛОВ КРОВИ / GLYCYL-HISTIDYL-LYSINE / GLYCINE / HISTIDINE / REGENERATION OF SKIN WOUNDS / FUNCTION OF BLOOD NEUTROPHILS

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Курцева А. А., Смахтин М. Ю., Иванов А. В., Беседин А. В.

В статье представлены результаты изучения репаративного и иммунотропного действия аминокислот, составляющих пептид глицил-гистидил-лизин (GHL), на модели кожных ран у крыс. Выявлено стимулирующее влияние как GHL, так и комбинации аминокислот (глицин + гистидин + лизин) и лизина на регенерацию кожи при их внутрибрюшинном введении. При этом комбинация аминокислот, лизин и глицин усиливали функцию нейтрофилов.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Курцева А. А., Смахтин М. Ю., Иванов А. В., Беседин А. В.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

The effects of amino acids components of Gly-His-Lys peptide on regeneration of skin wounds and neutrophil functions

In this article we present results of investigation of reparative and immune effects of the peptide glycyl-histidyl-lysine (GHL) and amino acids components of peptide on the model of skin wounds in rats. The stimulating action of GHL and combination of amino acids (glycine + histidine + lysine) and lysine on regeneration of skin wounds was found in intraperitoneal injection. The combination of amino acids, lysine and glycine stimulate function of neutrophils.

Текст научной работы на тему «Влияние аминокислот, составляющих пептид глицил-гистидил-лизин, на регенерацию кожных ран и функцию нейтрофилов»

УДК 616.5-001.41

ВЛИЯНИЕ АМИНОКИСЛОТ, СОСТАВЛЯЮЩИХ ПЕПТИД ГЛИЦИЛ-ГИСТИДИЛ-ЛИЗИН, НА РЕГЕНЕРАЦИЮ КОЖНЫХ РАН И ФУНКЦИЮ НЕЙТРОФИЛОВ

© Курцева А.А., Смахтин М.Ю., Иванов А.В., Беседин А.В.

Кафедра анатомии человека, кафедра биологической химии, кафедра гистологии, цитологии и эмбриологии, кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии Курского государственного медицинского университета, Курск

E-mail: konsna@yandex.ru

В статье представлены результаты изучения репаративного и иммунотропного действия аминокислот, составляющих пептид глицил-гистидил-лизин (GHL), на модели кожных ран у крыс. Выявлено стимулирующее влияние как GHL, так и комбинации аминокислот (глицин + гистидин + лизин) и лизина на регенерацию кожи при их внутрибрюшинном введении. При этом комбинация аминокислот, лизин и глицин усиливали функцию нейтрофилов.

Ключевые слова: глицил-гистидил-лизин, глицин, гистидин, лизин, регенерация кожных ран, функция нейтрофилов крови.

THE EFFECTS OF AMINO ACIDS - COMPONENTS OF GLY-HIS-LYS PEPTIDE ON REGENERATION OF SKIN WOUNDS AND NEUTROPHIL FUNCTIONS Kurtseva A.A., Smakhtin M. Yu., Ivanov A.V., Besedin A.V.

Human Anatomy Department, Biochemistry Department, Histology, Cytology & Embryology Department, Microbiology, Virology & Immunology Department of the Kursk State Medical University, Kursk

In this article we present results of investigation of reparative and immune effects of the peptide glycyl-histidyl-lysine (GHL) and amino acids - components of peptide on the model of skin wounds in rats. The stimulating action of GHL and combination of amino acids (glycine + histidine + lysine) and lysine on regeneration of skin wounds was found in intraperitoneal injection. The combination of amino acids, lysine and glycine stimulate function of neutrophils.

Key words: glycyl-histidyl-lysine, glycine, histidine, lysine, regeneration of skin wounds, function of blood neutrophils.

В настоящее время по-прежнему актуален поиск новых эффективных средств, стимулирующих заживление ран [3]. Известно, что при повреждении тканей нейроэндокринная и иммунная системы контролируют основные этапы регенерации с помощью регуляторных пептидов [1, 13].

Также было обнаружено стимулирующее влияние пептида NH2-Gly-L-His-L-Lys-COOH (GHL) на регенерацию клеток печени [11], рост волос [13], синтез коллагена фиб-робластами [10] и накопление межклеточного вещества соединительной ткани [10].

В проведенных нами ранее исследованиях, были показаны выраженные репаратив-ные эффекты GHL в условиях кожных ран

[6]. В то же время до конца не ясно, связана ли его репаративная активность с аминокислотами, образующимися при его возможном протеолизе и какая из аминокислот

проявляет при этом максимальную активность. Также представляет интерес и выявление их иммунотропных эффектов, так как иммунная система принимает непосредственное участие в регенерации тканей [2].

В связи с этим целью проведенного исследования было выявление репаративных и иммунотропных эффектов аминокислот, входящих в состав глицил-гистидил-лизина.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Опыты проводились на крысах Вистар массой 180-220 г, которым под эфирным наркозом на холке наносили кожные раны стандартного размера (1 см ). Нами был использован препарат GHL, синтезированный в НИИ химии Санкт-Петербургского государственного университета, и аминокислоты -

глицин, L-гистидин и L-лизин ("Реахим", Россия). Навески соответствующих препаратов растворяли в стерильном изотоническом растворе хлорида натрия и вводили внутри-брюшинно в объеме 0,1 мл с интервалом в 24 часа между инъекциями, в течение 10 суток. GHL применяли в разовой дозе 0,5 мкг/кг массы, а аминокислоты - в дозах, соответствующих их эквимолярному содержанию в пептиде: глицин - 0,1 мкг/кг, гистидин -

0,2 мкг/кг, лизин - 0,2 мкг/кг. Введение препаратов начиналось сразу после моделирования раневого процесса. Последнее введение препаратов осуществляли за 12 часов до вывода животных из эксперимента. Контролем служили крысы, получавшие эквивалентный объем физиологического раствора (NaCl).

Скорость заживления ран определяли путем динамического измерения площади ран [3]. Сразу после моделирования раневого процесса, а также через пять и десять дней раны фотографировали цифровой фотокамерой Olympus SP-350 с применением миллиметровой сетки и с последующим измерением начальной (1 -е сутки), промежуточной (через 5 суток) и конечной (через 10 суток) площадей ран. Вычисление площадей ран производилось с помощью программы Image Tool. На основании полученных данных вычислялся коэффициент относительного рано-заживления (КР) по формуле: Y = So-St/So, где Y - коэффициент относительного заживления, So - начальная площадь раны, St - конечная площадь раны [3]. При вычислении первого коэффициента регенерации (КР1) за So была взята площадь ран на первые сутки, а за St - через пять суток. При вычислении второго коэффициента регенерации (КР2) за So была взята площадь ран через пять суток, а за St - через десять суток. При вычислении третьего коэффициента регенерации (КРЗ) за So была взята площадь ран на первые сутки, а за St - через десять суток.

Через 10 суток с момента нанесения ран проводились гистологические исследования раневых срезов. Кусочки кожи фиксировали в 10% растворе формалина, заливали в парафин, после чего изготавливали парафиновые срезы, которые окрашивали гематоксилином и эозином по стандартной методике.

Влияние препаратов на иммунную функцию оценивали по изменению активности

нейтрофилов крови. Фагоцитарную активность нейтрофилов определяли по уровням фагоцитарного индекса (ФИ) и фагоцитарного числа (ФЧ) после их инкубации с латексом

[7]. Активность кислородзависимых механизмов защиты в фагоцитах оценивали в тесте восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест), по уровням спонтанной (НСТ-сп.) и стимулированной (НСТ-инд.) реакций, при этом в качестве стимулятора использовали зимозан [10]. Функциональный резерв нейтрофилов (ФРН) рассчитывали как разность показателей стимулированного и спонтанного НСТ-теста.

Полученные цифровые данные обрабатывались с помощью встроенных алгоритмов пакета анализа приложения для персонального компьютера. Достоверность различий сравниваемых параметров между средними значениями контроля и других групп животных определяли по перекрытию областей интервалов при р<0,05 и с помощью критерия Манна-Уитни.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Установлено, что не только пептид GHL, но и комбинация составляющих его аминокислот (глицин + гистидин + лизин), стимулировали заживление кожных ран, о чем свидетельствовало повышение КР3 в 1,8 и 1,5 раз соответственно по сравнению с контролем (табл. 1). Причем стимулирующее действие как GHL, так и комбинации составляющих его аминокислот проявлялось в период с 6 по 10 сутки, о чем свидетельствовало повышение КР2 в 2,7 и 2 раза соответственно. Достоверных отличий КР1, отражающего ре-паративную активность начальной стадии раневого процесса (с 1 по 5 сутки), выявлено не было. При введении аминокислот по отдельности было установлено, что в использованных дозах глицин и гистидин не влияли на заживление кожных ран, тогда как введение лизина повышало КР2 и КР3 в 2,6 и 1,6 раза соответственно (табл. 1). Репаративное действие комбинации аминокислот и лизина подтверждалось морфологическими исследованиями раневых срезов. По сравнению с контрольной группой животных (рис. 1), у крыс, получавших комбинацию аминокислот

Таблица 1

Влияние пептида GHL и составляющих его аминокислот на заживление (М± т, п=8) кожных ран

у крыс

Коэффициент Коэффициент Коэффициент

№ Условия опыта ранозаживления (КР1) ранозаживления (КР2) ранозаживления (КР3)

1. Контроль (NaCl) 0,42±0,03 0,34±0,07 0,51±0,12

2. Введение пептида GHL 0,54±0,23 0,83±0,05* 0,92±0,09*

3. Введение комбинации аминокислот (глицин + гистидин + лизин) 0,38±0,11 0,63±0,18* 0,78±0,09*

4. Введение глицина 0,24±0,08 0,59±0,21 0,69±0,14

5. Введение гистидина 0,36±0,07 0,53±0,38 0,67±0,24

6. Введение лизина 0,27±0,09 0,79±0,05* 0,84±0,03*

Примечание. * - p<0,05 по сравнению с контролем, n - количество животных в группе.

Рис. 1. Срез раны через 10 суток с момента формирования ран. Введение физиологического раствора.

Примечание. Увеличение х 40. Окраска гематоксилин-эозином.

Рис. 2. Срез раны через 10 суток с момента формирования ран. Введение комбинации аминокислот (глицин + гистидин + лизин).

Примечание. Увеличение х 40. Окраска гематоксилин-эозином.

Рис. 3. Срез раны через 10 суток с момента формирования ран. Введение лизина. Примечание. Увеличение х 40. Окраска гематоксилин-эозином.

и лизин (рис. 2, 3), отмечается уменьшение отека в области раны, выраженное снижение плотности клеточного инфильтрата за счет меньшего количества лимфоцитов и макрофагов, а также преобладание зрелых фиб-робластов над незрелыми, что свидетельствует о более благоприятном течении процессов регенерации под влиянием комбинации аминокислот и лизина.

Полученные данные показывают, что ре-паративные эффекты GHL могут быть связаны с лизином, образующимся в результате возможного протеолиза пептида.

При изучении нейтрофильного звена ан-тиинфекционной защиты было установлено, что в использованной дозе (0,5 мкг/кг) GHL не влиял на их активность, тогда как комбинация составляющих его аминокислот стимулировала фагоцитарную активность нейтро-филов, о чем свидетельствовало повышение ФЧ в 2,1 раза по сравнению с контролем (табл. 2). При этом не было выявлено влияния на показатели кислородзависимой активности нейтрофилов.

При исследовании иммунотропных эффектов аминокислот, введенных по отдельности, установлено, что гистидин не влиял на функцию нейтрофилов по большинству изученных показателей, но при этом наблюдалось снижение ФИ в 1,3 раза, тогда как глицин и лизин оказывали стимулирующее действие (табл. 2). Введение глицина приводило к повышению ФИ в 1,5 раза, а ФЧ - в 1,6 раза по сравнению с животными, получавшими

физиологический раствор. Также наблюдалось повышение уровня стимулированной реакции НСТ-теста в и ФРН в 1,3 раза. Введение лизина сопровождалось усилением поглотительной способности нейтрофилов, о чем свидетельствовало повышение ФЧ в 1,8 раза по сравнению с контролем.

Вероятно, в результате суммации стимулирующих и супрессирующих эффектов отдельных аминокислот выраженность иммуностимулирующего действия их комбинации (глицин + гистидин + лизин) проявлялась в меньшей степени по сравнению с эффектами глицина, иммуностимулирующее действие которого могло быть связано с нейромедиа-торной функцией [5]. Также можно предположить, что активирующее действие лизина в отношении поглотительной стадии фагоцитоза связано с его стресс-лимитирующим влиянием [4], а эффекты гистидина могут зависеть от образующегося из него гистамина [5].

Несмотря на то что аминокислоты, входящие в структуру пептида GHL, оказывали влияние на функцию нейтрофилов, репара-тивной активностью в отношении кожных ран обладала только одна аминокислота - лизин. Он не только стимулировал заживление кожных ран, но и усиливал при этом поглотительную способность нейтрофилов. Тогда как глицин, оказывавший более выраженное стимулирующее действие на функцию нейтрофилов, не влиял на заживление кожных ран.

Таблица 2

Влияние пептида GHL и составляющих его аминокислот на функциональную активность

(М± т, п=8) нейтрофилов крови

№ Условия опыта ФИ, % ФЧ, абс. НСТ-сп., % НСТ-инд., % ФРН, %

1. Контроль (ШО) 4S,0±2,9 1,б±0,1 32,2±2,б 55,0±1,8 24,0±1,4

2 Введение пептида GHL 43,S±1,7 1,7±0,1 30,S±2,4 5,4±2,0 24,б±2,7

3. Введение комбинации аминокислот (глицин + гистидин + лизин) 44,5±4,б 3,3±0,б* 30,6±4,S 5б,2±5,5 25,б±3,5

4. Введение глицина 70,3±10,б* 2,5±0,1* 37,5±2,9 б9,5±3,0* 32,0±2,S*

5. Введение гистидина 3S,4±2,3* 1,9±0,1 30,2±1,7 57,3±3,2 27,0±3,4

6. Введение лизина 41,9±4,5 2,9±0,S* 32,S±4,3 54,S±4,5 21,9±3,7

Примечание. НСТ-сп. - % формазан-положительных клеток в спонтанной реакции НСТ-теста; НСТ-инд. - % формазан-положительных клеток в стимулированной зимозаном реакции НСТ-теста; * - показывает достоверные отличия, p<0,05; п - количество животных в группе.

Учитывая эти факты, можно заключить, что главной физиологически активной аминокислотой, которой могут опосредоваться эффекты GHL при его возможном протеоли-зе, является лизин. Хотелось бы подчеркнуть, что протеолиз является основным механизмом инактивации регуляторных пептидов и белково-пептидных гормонов [8]. В связи с этим репаративные эффекты лизина, образующегося при расщеплении GHL, вероятно, усиливают и пролонгируют ранозаживляющую активность пептида.

Таким образом, в условиях кожных ран проявление репаративных и иммунотропных эффектов глицил-гистидил-лизина, очевидно, связано не только с самим пептидом, но и с эффектами составляющих его аминокислот, которые могут образовываться в результате его протеолиза. При этом ранозаживляющая активность глицил-гистидил-лизина может быть опосредована лизином.

ЛИТЕРАТУРА

1. Акмаев И.Г. Современные представления о взаимодействиях регулирующих систем: нервной, эндокринной и иммунной // Успехи физиол. наук. - 1996. - Т. 27, № 1. - С. 3-20.

2. Алексеева И.Н., Брызгина Т.М., Павлович С.И., Ильчевич Н.В. Печень и иммунологическая реактивность. - Киев, 1991. - 168 с.

3. Амирасланов Ю.А., Матасов В.М., Хоти-нян В.Ф. Лечение ран в управляемой абакте-риальной среде. - М., 1981. - 157 с.

4. Бобынцев И.И., Долгинцев М.Е., Крюков А.А., Северьянова Л.А. Влияние L-лизина на разви-

тие гуморального иммунного ответа и активность нейтрофилов в исходном состоянии и в условиях эмоционально-болевого стресса // Вестн. новых медицинских технологий. -2007. - Т. XIV, № 1. - С. 135-137.

5. Корнева Е.А., Шхинек Э.С. Стресс и функция иммунной системы // Успехи физиол. наук. -1989. - Т. 20, № 3. - С. 3-20.

6. Курцева А.А., Смахтин М.Ю., Иванов А.В., Беседин А.В. Репаративная и иммунотропная активность глицил-гистидил-лизина в условиях кожных ран // Курский научн.-практич. вестн. "Человек и его здоровье". - 2008. -№ 1. - С. 3б-40.

7. Медведев А.Н. Способ исследования поглотительной фазы фагоцитоза // Лаб. дело. -1991. - № 2. - С. 19-20.

8. Розен В.Б. Основы эндокринологии. - М.: Изд-во МГУ, 1994. - 3S4 с.

9. Щербаков В.И. Применение НСТ-теста для оценки чувствительности нейтрофилов к стимуляторам // Лаб. дело. - 1989. - № 1. -С.30-33.

10. Maquart F.X., Pickart L., Laurent M. et al. Stimulation of collagen synthesis in fibroblast cultures by the tripeptide-copper complex glycyl-L-histidyl-L-lysine-Cu2+ // FEBS Lett. - 1988. -Vol. 23S, № 2. - Р. 343-346.

11. Pickart L. A synthetic tripeptide which increases survival of normal liver cells, and stimulates growth in hepatoma cells // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1973. - Vol. 54, № 2. -P.562-566.

12. Trackhy R.E., Fors T.D., Pickart L., Uno H. The hair follicle-stimulating properties of peptide copper complexes. Results in C3H mice // Ann. N.-Y. Acad. Sci. - 1991. - Vol. б42, № 10. -P. 468-469.

13. Wang Y., Wang X.M., Han J.S. Inhibition of the expression of delta opioid receptor mRNA by long-term exposure of NG-108-15 cell line to

delta opioid agonists // Sheng Li Xue Bao. -1998. - Vol. 50, № 2. - P. 217-221.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.