CC BY
60
УДК 577.112.6:616.36-002
РЕПАРАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ ПЕПТИДОВ РАЗЛИЧНЫХ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ
ГРУПП ПРИ ГЕПАТОПАТИЯХ
© Смахтин М.Ю., Конопля А.И., Северьянова Л.А., Бобынцев И.И., Курцева А.А., Чердаков В.Ю.
Кафедра биологической химии Курского государственного медицинского университета
При гепатопатиях, как с повышенной активностью иммунной функции (тетрахлорметановая гепатопа-тия), так и со сниженной (гидразиновая гепатопатия), Gly-His-Lys активировал репаративную регенерацию гепатоцитов и снижал иммунную функцию вне зависимости от ее исходной активности. Он являлся более мощным стимулятором митотической активности гепатоцитов по сравнению с агонистом 5-опиатных рецепторов - пептидом DSLET и АКТГ4_ю. Направленность и выраженность эффектов DSLET и АКТГ4_ю была неодинакова в разных моделях токсических гепатопатий, что свидетельствовало о регуляторном влиянии этих лигандов. DSLET более выражено, чем АКТГ4_ю, активировал репаративную регенерацию печени и обладал модуляторной активностью в отношении иммунной функции.
Ключевые слова: Gly-His-Lys, DSLET, АКТГ4_ю, гепатопатии, репаративная регенерация гепатоцитов, иммунный ответ.
REPARATIVE ACTIVITY OF DIFFERENT FUNCTIONAL GROUP PEPTIDES IN HEPATOPATHIES
Smakhtin M. Yu., Konoplya A.I., Severyanova L.A., Bobyntsev I.I., Kurtseva A.A., Cherdakov V. Yu.
Biochemistry Department of the Kursk State Medical University
Gly-His-Lys activated hepatocyte reparative regeneration and decreased the immune function in hepatopathies, both with the increased immune function (tetrachloromethane hepatopathy), and with the reduced one (hydrazine hepatopathy). It was the most potent activator of the hepatocyte mitotic activity comparing to an agonist of 5-opiate receptors - peptide DSLET and ACTH4_i0. The direction and expression of DSLET and ACTH4_i0 effects were not the same in differet toxic hepatopathy models that proved the regulatory influence of these peptides. In comparison to ACTH4_i0, DSLET was more potent in activating the reparative liver regeneration and had the immunomodulatory activity.
Key words: Gly-His-Lys, DSLET, ACTH4.j0, hepatopathies, reparative hepatocyte regeneration, immune response.
Пептидные молекулы являются важнейшими компонентами регуляторных систем организма и играют ключевую роль в поддержании гомеостаза [1, 3, 5, 7], в регуляции которого также участвует и печень [2, 6]. Учитывая постоянный рост заболеваемости этого органа, выявление регуляторных механизмов ее регенерации по-прежнему актуально. В связи с этим представляли интерес изучение и анализ эффектов пептидов различных функциональных групп. Трипептид Gly-His-Lys (GHL) обладает прямым гепатотропным действием, поскольку известно, что он повышает выживаемость гепатоцитов in vitro [12]. В то же время адаптация к изменяющимся условиям среды контролируется гипо-таламо-гипофизарно-надпочечниковой сис-
темой, одним из основных компонентов которой служит АКТГ [1, 7]. Фрагмент его молекулы - АКТГ4.10, практически лишенный
стероидогеннои активности, оказывает выраженное нейротропное деИствие [7]. С другоИ стороны, выраженность адаптивной реакции зависит и от активности стресс-лимитирующей системы, компонентами которой являются опиоидные пептиды, чьи рецепторы обнаружены, в том числе, и на мембране гепатоцитов [3]. При этом некоторые физиологические функции печени регулируются энкефалинами, испытывающими наибольшее сродство к 5-опиатным рецепторам, селективным агонистом которых является синтетический аналог энкефалинов - пептид ББЬЕТ [3].
В ранее проведенных исследованиях нами было показано различной степени выраженности стимулирующее влияние пептидов ОНЬ, ББЬЕТ и АКТГ4.10 в отношении физиологической регенерации гепатоцитов [8]. Отсутствие данных об эффектах этих пептидов
и подобных им лигандов в условиях патологии печени затрудняет дальнейшее изучение регуляторных механизмов ее регенерации, а также целенаправленный поиск новых гепа-топротекторных препаратов пептидной природы. Учитывая тот факт, что иммунная система участвует в контроле процессов регенерации печени [2], а эффекты опиоидных пептидов могут зависеть от исходной активности иммунной функции [3], мы определили целью проведенного исследования изучение гепато- и иммунотропного действия пептидов GHL, DSLET и АКТГ4.10 в условиях экспериментальных токсических гепатопатий, отличающихся исходным уровнем иммунной реактивности.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследования выполнены на мышах СВА массой 22-25 граммов с использованием экспериментальных моделей острых токсических гепатопатий, сопровождающихся как повышением иммунной реактивности (тетра-хлорметановая гепатопатия), так и ее снижением (гидразиновая гепатопатия) [9, 10]. Острое токсическое поражение печени вызывали внутрижелудочным введением 50% раствора тетрахлорметана в растительном масле по 3 мл/кг массы тела в течение 5 дней подряд или однократным внутрибрюшинным введением сернокислого гидразина (50 мг/кг). В экспериментах были использованы пептиды:
глицил-гистидил-лизин (GHL): H2N - Gly
- His - Lys - COOH
DSLET: H2N - Tyr - D-Ser - Gly - Phe - Leu
- Thr - COOH
АКТГ4-10 : H2N - Met - Glu - His - Phe - Arg
- Try - Gly - COOH
GHL был синтезирован в НИИ химии Санкт-Петербургского государственного
университета, АКТГ4-10 - в Институте молекулярной генетики РАН, а DSLET - в Кардиологическом научном центре РАМН. На основе ранее проведенных исследований ге-пато- и иммунотропных эффектов этих пептидов в физиологических условиях [8] были выбраны три дозы пептидов - 1,5, 50 и 150 мкг/кг массы, различающиеся по степени выраженности их эффектов. Навески растворяли в стерильном изотоническом растворе NaCl и
вводили внутрибрюшинно в объеме 0,1 мл десятикратно с интервалом в 24 часа между инъекциями - до, одновременно и после поступления гепатотропных ядов. ^нтрольные животные получали эквивалентные объемы физиологического раствора. На следующий день после последнего введения препарата животных забивали под эфирным наркозом и выделяли печень. ^сочки органов фиксировали в 10% нейтральном формалине на 0,1 М фосфатном буфере, рН = 7,2, и заливали в парафин по общепринятой методике. Парафиновые срезы печени окрашивали гематоксилином и эозином, после чего изучали общую морфологическую картину органа. Подсчитывали митотический индекс, отражающий активность клеточной формы регенерации, и индекс двуядерных гепатоцитов, показывающий выраженность ацитокинетической активности как формы внутриклеточной регенерации и резерва полиплоидизации [б]. Об интенсивности гуморального иммунного ответа судили по количеству антителообразующих клеток в селезенке на 5-й день после иммунизации эритроцитами барана [4]. Пептиды вводили до, одновременно и после иммунизации в течение десяти дней. Математическую обработку проводили, вычисляя M±m. Достоверность различий средних величин оценивали с помощью t критерия Стью-дента и U критерия Манна-Уитни.
РЕЗУЛЬTATbl ИССЛЕДOВAHИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Пятидневное введение тетрахлорметана вызывало развитие центролобулярных некрозов, выраженную жировую дистрофию гепа-тоцитов и компенсаторное усиление их репа-ративной регенерации. В этих условиях GHL в дозе 1,5 мкг/кг повышал митотическую активность гепатоцитов, не влияя на число дву-ядерных клеток (рис. 1). При повышении дозы пептида до 50 и 150 мкг/кг наблюдалась дальнейшая активация регенерации за счет ацитокинетических митозов. DSLET в тех же условиях при дозе 1,5 мкг/кг активировал репаративную регенерацию печени, повышая как число митозов, так и двуядерных гепато-цитов. Но при дозах 50 и 150 мкг/кг стимулирующий эффект пептида был менее выраженным, поскольку не происходило досто-
%
100
90
80
70
60
50
40
З0
20
10
0
Митотический индекс гепатоцитов
GHL
DSLET
AKTT4-10
1,5 мкг/кг
50 мкг/кг
150 мкг/кг
Рис. 1. Влияние GHL, DSLET и AKTF4_10 на репаративную регенерацию гепатоцитов в условиях острого отравления тетрахлорметаном.
Примечание: 1. Изменения показателей регенерации выражены в процентах по сравнению с контрольными группами (тетрахлорметан + NaCl); 2. * - p<0,05 по сравнению с этими группами.
верного увеличения числа двуядерных клеток. Кроме того, при введении пептида в дозах 50 и 150 мкг/кг митотическая активность не изменялась по сравнению с ее уровнем в группе, получавшей пептид в дозе 1,5 мкг/кг, тогда как в физиологических условиях более выраженный митотический эффект отмечался именно при дозах ББЬЕТ 50 и 150 мкг/кг [8]. АКТГ4-10 в малой дозе 1,5 мкг/кг активировал репаративную регенерацию гепатоцитов, повышая число митозов, но не количество двуядерных клеток. При повышении дозы пептида до 50 и 150 мкг/кг усиления репаративной регенерации не было выявлено, что могло быть обусловлено проявлением центрального модуляторного влияния АКТГ4-10, возможно, более выраженного в высоких дозах.
Введение тетрахлорметана сопровождалось активацией гуморального иммунного ответа, о чем свидетельствовало повышение числа антителообразующих клеток в селезенке отравленных животных (табл.). В этих условиях ББЬЕТ и АКТГ4-10 обладали более выраженным иммунокорригирующим эффектом по сравнению с ОНЬ. Во всех изученных дозах они нормализовали количество антителообразующих клеток, тогда как ОНЬ при дозе 1,5 мкг/кг снижал их число, но не до уровня контрольных животных, получавших
масло и изотонический раствор КаСІ. Таким образом, в условиях острой тетрахлорметано-вой гепатопатии выбранные пептиды, ускоряя репаративные процессы в печени, обладают одновременно корригирующим эффектом в отношении иммунных реакций. Но, в отличие от ОНЬ, увеличение дозы ББЬЕТ и АКТГ4-10 не усиливало их репаративную и иммуносупрессирующую активность, в то время как в физиологических условиях наблюдалось усиление этих эффектов по мере повышения вводимой дозы [8], что указывает на зависимость влияния ББЬЕТ и АКТГ4-10 от исходной активности компенсаторно-
приспособительных реакций.
В условиях гидразиновой гепатопатии с исходно сниженной активностью иммунной функции также наблюдалась выраженная центролобулярная жировая дистрофия гепа-тоцитов. При этом влияние ОНЬ было аналогично его эффектам в условиях отравления тетрахлорметаном (рис. 2). В дозе 1,5 мкг/кг пептид обладал одинаковой митотической активностью с дозами 50 и 150 мкг/кг, начиная с которых проявлялось его действие и на ацитокинетические митозы гепатоцитов. ББЬЕТ же не оказывал существенного влияния на митозы гепатоцитов, но повышал число двуядерных клеток с наибольшей выра-
Таблица
Влияние ОНЬ, ББЬЕТ и АКТГ4-10 на число антителообразующих клеток (М±т, п=9) в селезенке мышей, отравленных тетрахлорметаном или гидразином
Условия опыта GHL DSLET АКТГ4-10
АОК на селезенку 10
ТЕТРАХЛОРМЕТАНОВАЯ гепатопатия
1. Еонтроль (масло+ NaCl) ЗЗ,7±5,З 32,7 ±5,4 34,5 ±б,2
2. Tетрахлорметан + NaCl 88,2±11,2 *1 Вб,3±10,4*1 78,9 ±9,б*1
3. Tетрахлорметан + пептид (1,5 мкг/кг) б5,4±7,1*1,2 35,9 ±б,1*2 33,4 ±5,б*2
4. Tетрахлорметан + пептид (50 мкг/кг) 4З,2±б,5*2,3 43,5 ±б,8*2 41,9 ±б,7*2
5. Tетрахлорметан + пептид (150 мкг/кг) З9,9±б,1*2,3 34,3 ±5,9*2 Зб,9 ±б,4*2
ГИДРАЗИНОВАЯ гепатопатия
1. Еонтроль (NaCl) З5,4±5,З 30,2 ±5,8 29,4 ±5,2
2. Г идразин + NaCl 1В,З±2,2*1 15,4±2,б*1 17,5±2,1*1
3. Г идразин + пептид (1,5 мкг/кг) 12,2±1,б*1,2 10,В±2,1*1 17,4±2,2*1
4. Гидразин + пептид (50 мкг/кг) 8,1 ±1,2*1'3 2З,9±2,4*2,3 12,7±1,7*1-2
5. Гидразин + пептид ( 150мкг/ кг) 7,3 ±1,1*1-3 22,З±2,2*2,3 10,2±1,4*1-3
Примечание: 1. АОК - число антителообразующих клеток (10 на селезенку), 2. * - показывает достоверные отличия, р<0,05.
Цифры рядом со звездочкой означают номера групп, с какими сравнивались различия.
Рис. 2. Влияние GHL, DSLET и AKTF4_10 на репаративную регенерацию гепатоцитов в условиях острого отравления гидразином.
Примечание: 1. Изменения показателей регенерации выражены в процентах по сравнению с контрольными группами (гидразин + NaCl); 2. * - p<0,05 по сравнению с этими группами; 3? - p<0,05 по сравнению с данными при дозе 1,5 мкг/кг.
женностью эффекта при введении в дозах 50 и 150 мкг/кг, что обусловливает усиление функции печени при сохранении числа функционирующих клеток [6]. Тогда как АКТГ4-10 не только не проявлял стимулирующего эффекта, но даже ослаблял репаративную регенерацию, снижая количество двуядерных клеток. Поскольку регенераторные эффекты АКТГ4-10 в этой модели противоположны его эффектам в условиях гепатопатии, вызванной тетрахлор-метаном, можно предположить, что изменение направленности репаративных эффектов пептида зависит от механизма развития или тяжести гепатопатии.
Введение гидразина сопровождалось супрессией гуморального иммунного ответа, о чем свидетельствовало снижение числа антителообразующих клеток в селезенке отравленных животных (табл.). В этих условиях ОНЬ и АКТГ4-10 иммунокорригирующим эффектом не обладали, а напротив, усиливали супрессию иммунной функции, более выражено при дозах 50 и 150 мкг/кг. В отличие от них ББЬЕТ в тех же дозах нормализовал уровень гуморального иммунного ответа, о чем свидетельствовало повышение количества антителообразующих клеток в селезенке до их уровня у здоровых животных. Таким образом, в условиях гепатопатии, сопровождавшейся изначально сниженной иммунной функцией, в отличие от ОНЬ и АКТГ4-10, ББЬЕТ не только не проявлял иммуносупрес-сирующего влияния, но даже менял направленность эффекта в сторону повышения и нормализации иммунной реактивности, осуществляя тем самым иммуномодуляторную активность.
Необходимо подчеркнуть, что использованные модели гепатопатий значительно отличаются по состоянию иммунной функции. Так, пятикратное введение тетрахлорметана сопровождается более выраженным синдромом цитолиза, выходом протеаз, их воздействием на макрофаги и эритроциты, что приводит к усилению секреции иммуностимулирующих цитокинов (преимущественно интерлейкина-1), с чем, видимо, и связано повышение иммунной реактивности в этой модели [2, 9]. В экспериментальной модели с использованием гидразина даже его однократное введение приводит к развитию вторичного иммунодефицитного состояния, вы-
званного иммунотоксическим действием ге-патотропного яда и выделением иммуносу-прессирующих субстанций [2, 10]. Исходя из однонаправленности гепатотропных и имму-носупрессирующих эффектов ОНЬ, возможно предположить, что в разных моделях поражения печени этот пептид обладает сходным механизмом их реализации. При этом он является наиболее мощным стимулятором митотической активности гепатоцитов по сравнению с другими изученными пептидами. Во всех моделях экспериментальных гепатопа-тий наблюдаются иммуносупрессирующие эффекты этого пептида вне зависимости от изначального состояния иммунной функции. Учитывая это, можно предположить, что основные эффекты ОНЬ реализуются не на "центральном", а на "периферическом" уровне, в частности на уровне печени и иммунной системы. В пользу этого свидетельствует тот факт, что точно такая же последовательность аминокислот, как и в ОНЬ, обнаружена в молекуле коллагена [11]. Вполне вероятно, что этот пептид образуется под влиянием протеаз в месте повреждения и стимулирует восстановительные процессы в поврежденном органе, что, очевидно, и является его физиологической функцией [11, 12]. Подобный механизм действия характерен для периферических пептидов, образующихся в результате частичного протеолиза соответствующих белков и осуществляющих аутокринную или паракринную регуляцию [13].
ББЬЕТ и АКТГ4-10 проявляют регуляторное влияние на восстановление печени и иммунной функции, поскольку выраженность и направленность проявляемых ими эффектов зависит от модели токсической гепатопатии. Кроме того, их эффекты в условиях поражения печени отличаются от эффектов этих пептидов у животных без патологии [8], что указывает на участие этих или подобных им лигандов в механизмах адаптации организма к различным токсическим агентам. Так, в условиях тетрахлорметановой гепатопатии ББЬЕТ стимулировал репаративную регенерацию гепатоцитов и нормализовал иммунологическую реактивность, препятствуя тем самым гиперактивации иммунной функции. Тот факт, что повышение дозы пептида не усиливало его эффекты, может быть следствием механизма обратной отрицательной свя-
зи, который существенно снижает экспрессию ô-опиатных рецепторов при длительном воздействии их агонистов [14]. Известно, что в условиях иммунодефицита регенераторные процессы протекают менее интенсивно [2]. Возможно, что с этим фактом связаны менее выраженные репаративные эффекты DSLET, а именно отсутствие влияния пептида на митозы гепатоцитов при отравлении гидразином. В то же время усиливалась ацитокине-тическая активность пептида в отношении гепатоцитов и изменялась направленность иммунотропного действия, что могло быть связано с выраженным стресс-лимитирую-щим действием, характерным для опиоидов, и ослаблением секреции глюкокортикостероидов, обладающих иммуносупрессорной активностью [5]. Есть основание сделать заключение о модуляторном влиянии опиоид-ного пептида DSLET на репаративную регенерацию печени и иммунную реактивность в условиях токсических гепатопатий, поскольку известно, что опиоидные пептиды выступают в качестве регуляторов биологических систем, способных изменять их уровень функционирования в зависимости от исходного состояния [3].
По сравнению с DSLET, репаративные и иммуномодуляторные эффекты AKT^.^ значительно менее выражены. В условиях тетра-хлорметановой гепатопатии AKTF4_10 стимулирует репаративную регенерацию печени, повышая митотическую активность гепато-цитов, только в малой дозе (1,5 мкг/кг). В условиях же отравления гидразином наблюдалось даже ослабление регенерации за счет снижения количества двуядерных гепатоци-тов. Скорее всего, определенный вклад в ослабление репаративной регенерации печени в этом случае вносит усиливающаяся под влиянием AKTF4_10 иммуносупрессия [2]. Вероятно, при этом большее действие на имму-ноциты оказывают прямые, а не центральные эффекты этого пептида, обладающего модуляторным влиянием на мозговые структуры
[7].
Tаким образом, эффект GHL - активатор-ный в отношении репаративной регенерации гепатоцитов и иммуносупрессорный вне зависимости от исходной активности иммунной функции, что приводит к предположению о преимущественно местном действии этого
пептида. Направленность и выраженность эффектов DSLET и АКТГ4_ю неодинакова в разных моделях токсических гепатопатий, что свидетельствует о регуляторном влиянии этих лигандов, при этом DSLET, активируя репаративную регенерацию печени, обладает модуляторной активностью и в отношении иммунной функции.
ЛИТЕРАТУРА
1. Акмаев И.Г. От нейроэндокринологии к нейроиммуноэндокринологии / И.Г. Акмаев,
B. В. Гриневич // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 2001. - Т. 131, № 1. - С. 22-32.
2. Алексеева И.Н., Брызгина Т.М., Павлович С.И., Ильчевич Н.В. Печень и иммунологическая реактивность - Киев, 1991. - 168 с.
3. Зозуля А.А. Опиоиды и иммунитет / А.А. Зозуля, С.Ф. Пшеничкин // Итоги науки и техники: Сер. "Иммунология". - 1990.- Т 25,
C. 48-120.
4. Иммунологические методы: Пер. с нем. / Под ред. Г. Фримеля. - М.: Мир, 1987.
5. Меерсон Ф.З. Стрессорные нарушения в системе противоопухолевого иммунитета и их ограничение стресслимитирующими факторами / Ф.З. Меерсон, Г.Т. Сухих // Вестн. АМН СССР. - 1985. - № 8. - С. 23-29.
6. Саркисов Д. С. Структурные основы адаптации и компенсации нарушенных функций -М., 1987.
7. Регуляторные пептиды: влияние на иммунную систему и репаративные процессы / Л.А. Северьянова, И.И. Бобынцев, Ю.Д. Ля-шев и др. // Мед. академ. журн. - 2003. - Т. 3, № 3. Прилож. 4. - С. 74-75.
8. Смахтин М.Ю., Конопля А.И., Северьянова Л.А., Швейнов И.А. DSLET и АКТГ4.І0 стимулируют митотическую активность гепа-тоцитов и снижают антителогенез // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 2003. -Т. 135, № 5. - С. 505-507.
6. Смахтин М.Ю., Конопля А.И., Северьяно-ва Л. А ., Швейнов И. А . Фармакологическая коррекция пептидом GLY-HIS-LYS иммуно-метаболических нарушений в условиях поражения печени тетрахлорметаном // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. - 2003. - № 2. - С. 19-21.
9. Смахтин М.Ю., Конопля А.И., Швейнов И.А. Стимуляция репаративной регенерации фактором роста клеток печени и его иммуномета-болические эффекты в условиях гепатопатии, вызванной гидразином // Вестн. новых медицинских технологий. - 2003. - Т. 10, № 1-2. -
1б
C. 22-23.
7. Stimulation of collagen synthesis in fibroblast
cultures by the tripeptide-copper complex glycyl-L-histidyl-L-lysine-Cu2+ / F.X. Maquart,
L. Pickart, M. Laurent et al. // FEBS Lett. -1988. - Vol. 238, № 2. - P. 343-346.
8. In vivo stimulation of connective tissue accumulation by the tripeptide-copper complex glycyl-L-histidyl-L-lysine-Cu2+ in rat experimental wounds / F.X. Maquart, G. Bellon, B. Chaqour et al. // J. Clin. Invest. - 1993. - Vol. 92, № 5. -P. 2368-2376.
9. Influence of syntetic peptide corresponding to the ACTH-like sequence of human immunoglobulin G1 on activity of murine thymocytes and peritoneal macrophages / E.V. Navolotskaya, T.A. Zar-garova, T.N. Lepikhova et al. // Immunol. Lett. -2000. - Vol. 72, № 2. - P. 93-99.
10. Wang Y., Wang X.M., Han J.S. Inhibition of the expression of delta opioid receptor mRNA by long-term exposure of NG-108-15 cell line to delta opioid agonists // Sheng Li Xue Bao. -1998. - Vol. 50, № 2. - P. 217-221.
