CC BY
91
Экспериментальная биология и медицина УДК 616.5-001:615.37
СИНЕРГИЧНОЕ ИММУНОТРОПНОЕ И РЕПАРАТИВНОЕ ДЕЙСТВИЕ ТИМОГЕНА, ДАЛАРГИНА И РЕГУЛЯТОРНОГО ПЕПТИДА GLY-HIS-LYS ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ
ТРАВМЕ КОЖИ
© Чердаков В.Ю., Смахтин М.Ю.,1 Дубровин Г.М., Бобынцев И.И.2
1 Кафедра биологической химии, кафедра травматологии, ортопедии и военно-полевой хирургии, 2 кафедра патофизиологии Курского государственного медицинского университета, Курск
E-mail: vic.cherdakov@rambler.ru
Установлено, что в условиях экспериментальной травмы кожи у крыс наблюдалось снижение функциональной активности нейтрофилов крови. Введение в эквимолярных дозах пептидов Gly-His-Lys (0,5 мкг/кг), даларгина (1,2 мкг/кг) и тимогена (0,5 мкг/кг) внутрибрюшинно, в течение 10 дней, сопровождалось повышением функциональной активности нейтрофилов крови, более выраженным у тимогена. Пептиды обладали синергичным иммунотропным и репаративным действием, поскольку при комбинированном введении препаратов наблюдалось существенное усиление функции нейтрофилов и ускорение репаративной регенерации, по сравнению с использованием препаратов по отдельности. Более выраженные иммунокорригирующие и репаративные изменения были выявлены в группах комбинированного введения пептидов Gly-His-Lys+тимоген и Gly-His-Lys+даларгин, которые частично корригировали поглотительную стадию фагоцитоза и кислородзависимую активность нейтрофилов, что сопровождалось выраженной активацией репаративных процессов в условиях кожных ран. Синергичное действие пептидов Gly-His-Lys, тимогена и даларгина может быть использовано для стимуляции заживления кожных ран.
Ключевые слова: тимоген, даларгин, пептид Gly-His-Lys, экспериментальные кожные раны, функция нейтрофилов, репаративная регенерация кожи.
THE SINERGIC IMMUNOTHROPIC AND REPARATIVE ACTION OF THYMOGEN, DALARGIN AND REGULATORY PEPTIDE GLYCYL-HISTIDYL-LYSINE IN EXPERIMENTAL SKIN TRAUMA Cherdakov V. Yu., Smakhtin M. Yu.,1 Dubrovin G.M., Bobyntsev I.I.2
1 Biochemistry Department, Traumatology, Orthopedics & Military Surgery Department,
2 Pathophysiology Department of Kursk State Medical University, Kursk
It has been established the decreased functional activity of blood neutrophils in the experimental rat skin trauma. The intraperitoneal injections of peptides in equimolar doses - Gly-His-Lys (0.5 ^g/kg), Dalargin (1.2 ^g/kg) and Thymogen (0.5 ^g/kg) during 10 days have resulted in their immunostimulating functions of blood neutrophil activities with the more expressed action in Thymogen. The peptides have had the synergetic immunostimulating and reparative actions since the combined injections of these substances the essential amplification of immune (neutrophil activity) and reparative effects has been observed compared to injections of peptides separately. The more expressed immunocorrecting and reparative changes have been found in peptide combined injections of Gly-His-Lys + Thymogen and Gly-His-Lys + Dalargin which partly corrected the absorptive stage of neutrophil phagocytosis and their oxidative activity leading to the expressed activation of skin wound reparative processes. The synergetic action of peptides Gly-His-Lys, Thymogen and Dalargin may be used for stimulating skin wound repair.
Keywords: Thymogen, Dalargin, peptide Gly-His-Lys, experimental skin wounds, function of neutrophils, skin reparative regeneration.
Травматизм является одной из важнейших медико-социальных проблем для большинства стран мира. В структуре травматизма преобладают бытовые травмы, а ведущими повреждениями в этих условиях, как правило, являются ушибы, гематомы, ссадины и раны - 21% [3]. В связи с этим выявление новых фармакологических субстанций и их комбинаций, эффективно стимулирующих заживление кожных ран, представляется актуальным вопросом. При этом одним из перспективных направлений современной биологии и медицины является применение для стимуляции репаративной регенерации поврежденных
тканей фармакологических препаратов, созданных на основе регуляторных пептидов [1].
Известно, в заживлении кожных ран важную роль играют иммунные механизмы. В частности нейтрофилы первыми из фагоцитов приходят в очаг воспаления и от их активности существенно зависит длительность раневого процесса [9]. В связи с этим представляется актуальным дальнейшее выявление эффектов пептидных иммуномодуляторов в условиях кожных ран. К числу таких препаратов относится тимоген, состоящий из двух аминокислот ^Ы^ф) и обладающий выраженными тимомиметическими иммуномодулирующими свойствами [8].
Принимая во внимание стрессирующее воздействие травмы на организм, представляется целесообразным исследование эффективности применения пептидных компонентов стресс-лимитирующей системы организма в виде фармакологического препарата даларгина, который создан на основе синтетического аналога лей-энкефалина и репаративным действием [5, 7]. Также известено, что выраженное стимулирующее влияние на процессы роста и дифференци-ровки клеток оказывает трипептид Gly-His-Lys (GHL) [12].
Сочетанное применение регуляторных пептидов разных функциональных групп при травмах кожи требует подробного изучения, поскольку вопросы потенцирования или ослабления их эффектов представляют не только теоретическое, но и имеют практическое значение [1].
В связи с этим целью настоящей работы было изучение влияния препаратов тимогена, даларги-на, синтетического пептида Gly-His-Lys и их комбинаций на репаративные процессы и функцию нейтрофилов крови при травме кожи.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Эксперименты выполнены с использованием крыс Вистар массой 180-220 г. Раневой процесс моделировали под хлоралгидратным наркозом (З00 мг/кг внутрибрюшинно) нанесением полнослойных ран стандартного размера (1 см) на холке животных [2]. Препараты и пептид растворяли в 0,1 мл физиологического раствора непосредственно перед использованием и вводили в течение 10 дней со дня нанесения кожной раны внут-рибрюшинно в эквимолярных дозах: GHL - 0,5 мкг (синтезирован в НИИ химии Санкт-Петербургского государственного университета), даларгин -1,2 мкг (Микроген НПО ФГУП, Россия) и тимо-ген - 0,5 мкг (МБНПК ЦИТОМЕД ЗАО, Россия) на 1 кг массы тела. Крысы контрольной группы получали внутрибрюшинно физиологический раствор в эквивалентном объеме в течение того же периода времени. Животных выводили из эксперимента через 10 суток после травмы кожи.
Скорость заживления ран определяли путем динамического измерения площади ран [2]. Сразу после моделирования раневого процесса и через десять дней раны фотографировали цифровой фотокамерой Canon A410 с применением миллиметровой сетки с последующим измерением начальной (1 -е сутки) и конечной (через 10 суток) площадей ран. Вычисление площадей ран производилось с помощью программы Image Tool. На основании полученных данных вычисляли коэф-
фициент относительной регенерации ран по формуле: Y= So-St/So, где Y - коэффициент относительного заживления, So - начальная площадь раны, St - конечная площадь раны [2].
Фагоцитарную активность нейтрофилов крови исследовали после их инкубации с латексом [6,10]. Для оценки фагоцитарной активности нейтрофилов определяли фагоцитарный индекс (ФИ, процент нейтрофилов, участвующих в фагоцитозе) и фагоцитарное число (ФЧ, среднее количество поглощенных частиц латекса на один фагоцит) в мазках, окрашенных по Романовскому [6].
Также вычисляли индекс активности фагоцитов (ИАФ) (число фагоцитированных частиц латекса, умноженное на процент фагоцитирующих клеток и разделенное на число подсчитанных клеток) [10].
Кислородзависимую активность нейтрофилов определяли по реакции восстановления нитроси-него тетразолия (НСТ-тест) с использованием Multiscan MC 340 (Labsystems, Финляндия) [4]. В качестве стимулятора использовали зимозан. Функциональный резерв нейтрофилов (ФРН) рассчитывали как соотношение показателей стимулированного и спонтанного НСТ-теста [10].
Достоверность различий полученных данных определяли с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Установлено, что при экспериментальной травме кожи наблюдалось снижение показателей ФИ, ФЧ и ИАФ, что свидетельствовало об ослаблении фагоцитарной активности нейтрофилов крови (табл. 1).
Пептид GHL при внутрибрюшинном введении не оказывал существенного влияния на функцию нейтрофилов крови. В этих условиях пептиды даларгин и тимоген в эквимолярных концентрациях сопоставимо стимулировали активность нейтрофилов (ФИ, ФЧ, ИАФ).
При использовании комбинаций пептидов наблюдалось усиление эффекта. В группе животных, получавших комбинацию пептидов GHL+тимоген, наблюдалась коррекция уровня ФИ и ИАФ, а при использовании комбинации GHL+даларгин - коррекция уровней всех изученных показателей (ФИ, ФЧ, ИАФ) (табл. 1).
Травматическое повреждение кожных покровов животных также сопровождалось снижением показателей кислородзависимой бактерицидной активности нейтрофилов и угнетением их функционального резерва (рис.1). Раздельное введение даларгина и тимогена достоверно усиливало кис-
Таблица 1
Влияние пептида Gly-His-Lys, тимогена, даларгина и их комбинации на фагоцитарную активность нейтрофилов крови при травме кожи (М±т, п=8)
№ груп пы Условия эксперимента Фагоцитарный индекс, % Фагоцитарное число, абс. Индекс активации фагоцитоза
1 Интактные животные 69,02±3,2 2,1±0,1 1,38±0,07
Экспериментальные группы животных (нанесение кожных ран)
2 Введение физиологического раствора 37,04±2Д*1 1,09±0,05*1 0,44±0,02*1
3 Введение GHL 39,22±3,0*1 1,12±0,05*1 0,47±0,01*1
4 Введение даларгина 49,03±2,2*1-3 1,39±0,04*1-3 0,68±0,02*1-3
5 Введение тимогена 50,02±2,5*1-3 1,47±0,08*1-3 0,74±0,04*1-3
6 Введение GHL+тимоген 70,67±2,09*2-5 1,62±0,08*1-3 1,30±0,08*2-5
7 Введение GHL+даларгин 74,83±3,9*2-5 2,35±0,11*2-6 1,49±0,02*2-5
8 Введение тимоген+даларгин 55,17±5,46*1-3’6’7 1,85±0,11*1-5’7 1,01±0,07*1-7
Примечание: * - достоверность отличий (р<0,05), цифры рядом со звездочкой показывают по отношению к показателю, какой группы эти различия достоверны, п - количество животных в группах.
Таблица 2
Влияние пептида Gly-His-Lys, тимогена, даларгина и их комбинации на заживление кожных ран (М±т, п=8).
№ п/п Условия опыта Начальная площадь раны, 2 см Площадь раны в день забоя, мм2 Относительное заживление раны (КОР)
1 Введение изотонического раствора хлорида натрия (контроль) 1,03±0,05 0,78±0,02 0,29±0,03
2 Введение пептида Gly-His-Lys 0,95±0,03 0,59±0,03*1 0,44±0,04*1
3 Введение тимогена 0,96±0,04 0,63±0,04*1 0,41±0,03*1
4 Введение даларгина 1,01±0,05 0,58±0,03*1 0,45±0,03*1
5 Введение Gly-His-Lys +тимоген 1,05±0,04 0,46±0,03*1-4 0,56±0,04*1-4
6 Введение Gly-His-Lys+даларгин 1,03±0,06 0,35±0,05*1-5 0,71±0,06*1"5
7 Введение тимоген+даларгин 0,99±0,03 0,45±0,05*1-4’6 0,57±0,03*1-4’6
Примечание: * - достоверность отличий (р<0,05), цифры рядом со звездочкой показывают по отношению к показателю, какой группы эти различия достоверны, п - количество животных в группах.
лородзависимую активность нейтрофилов периферической крови. При комбинированном введении тимогена или даларгина с пептидом GHL усиление эффекта наблюдалось в обеих группах животных, что сопровождалось коррекцией функционального резерва нейтрофилов (рис.1).
При изучении репаративной активности было выявлено, что все пептиды повышали скорость заживления ран (табл. 2), а при использовании комбинаций GHL+тимоген и GHL+даларгин эффект усиливался.
Известно, что в фазе воспаления происходит миграция лейкоцитов в рану. В первые 24 часа в ране доминируют нейтрофилы, а позже - макро-
фаги и лимфоциты [11]. Эти клетки регулируют создание соединительнотканого матрикса формирующегося рубца путем выделения различных цитокинов. От их активности также зависит вероятность нагноения и длительность патологического процесса [9]. В связи с этим представляется целесообразным использование иммуномодулятора тимогена. Возможно, что его сочетание с GHL и даларгин усиливают репаративную активность благодаря сочетанию двух эффектов - за счет активации клеток иммунной системы и последующим усилением непрямого репаративного действия, а также непосредственного воздействия на клетки кожи.
Рис. 1. Эффекты регуляторных пептидов ОИЬ, тимогена, даларгина и их комбинаций на уровень функционального резерва (М±т, п=8) нейтрофилов в условиях кожных ран.
Обозначения: ___________ - линия обозначает уровень интактных животных.
Столбики - животные с экспериментальной травмой кожи.
1. Введение физиологического раствора (контроль). 2. Введение ОИЬ.
3. Введение даларгина. 4. Введение тимогена.
5. Введение комбинации ОИЬ+тимоген.
6. Введение комбинации ОИЬ+даларгин.
7. Введение комбинации тимоген+даларгин.
Примечание: * - р<0,05, а рядом стоящая цифра - номера групп сравнения.
Возможно, что тимоген, активируя нейтро-фильные гранулоциты, способствует выделению ими ряда пептидных веществ, которые могут положительно влиять на процессы заживления ран [8].
В то же время выраженная репаративная активность комбинации ОИЬ+даларгин могла быть обусловлена не только непосредственным действием двух пептидов-репарантов [5,12] на клетки соединительной ткани, но и сочетанием синергичной иммунокорригирующей активности, а также проявлением стресс-лимитирующего действия даларгина [12].
Учитывая выше перечисленное, можно заключить, что выбранные для исследования пептиды в условиях кожных ран обладали синергичными свойствами в отношении иммунной функции и репаративной регенерации, т.к. при сочетанном (попарном) введении пептидов наблюдалось достоверное увеличение показателей функции нейтрофилов крови и процесса репарации в сравнении с группами с раздельным введением препаратов. При этом наиболее выраженный иммунокорригирующий и репаративный эффекты оказывали комбинации пептидов ОИЬ+тимоген и ОИЬ+даларгин.
Таким образом, в условиях экспериментальной травмы кожи комбинации препаратов
ОИЬ+тимоген и ОИЬ+даларгин восстанавливают сниженную после травмы функциональную активность нейтрофилов крови до уровня интакт-ных животных и ускоряют процессы восстановления кожных покровов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Акмаев И.Г. Современные представления о взаимодействиях регулирующих систем: нервной, эндокринной и иммунной // Успехи физиол. наук. -1996. - Т. 27, № 1. - С. 3-20.
2. Амирасланов Ю.А., Матасов В.М., Хотинян В.Ф. Лечение ран в управляемой абактериальной среде. - М., 1981. - 157 с.
3. Анкин Л.Н. Политравма: Организационные, тактические и методологические проблемы. - М.: Мед-пресс-информ., 2004. - 176 с.
4. Зинкин В.Ю., Годков М.А. Способ количественной оценки кислородзависимого метаболизма нейтро-фильных гранулоцитов человека // Клин. лаб. диагност. - 2004. - № 8. - С. 26-29.
5. Максакова Е.В. Даларгин в лечении травматических повреждений роговицы // Офтальмолог. журнал. - 2000. - № 6. - С. 95-97
6. Медведев, А.Н. Способ исследования поглотительной фазы фагоцитоза // Лаб. дело. - 1991. - № 2. -С. 19-20.
7. Рудин И.В. Влияние даларгина на желчеотделительную функцию печени // Бюллетень сибирской медицины. - 2006. - № 1. - С. 21-25.
S. Смирнов В.С. Клиническая фармакология тимогена. - СПб.: Ред., 2004. - 106 с.
9. Фрейдлин И.С., Тотолян А.А. Базофилы и тучные клетки // Клетки иммунной системы. - Т. 4. -СПб.: Наука, 2001. - 308 с.
10. Фримель /[Иммунологические методы. - М.: Медицина, 1987. - 472 с.
11. Martin P., Hopkinson-Wooley J., McCluskey J. Growth factors and cutaneous wound repair // Prog. Growth Factor Res. - 1992. - Vol. 4. - P. 25-44.
12. Trackhy R.E., Fors T.D., Pickart L., Uno H. The hair follicle-stimulating properties of peptide copper complexes. Results in C3H mice // Ann. N. -Y. Acad. Sci. - 1991. - Vol. 642, - N 10. - P. 468-469.
