CC BY
36
УДК 579.66:547.94
А. Н. Шакиров (асп.), Н. И. Петухова (к. биол. н., доц.), В. В. Зорин (д.х.н., проф., зав. каф., чл.-корр. АН РБ)
Получение ^)-6-гептен-2-ола биовосстановлением 6-гептен-2-она с помощью клеток дрожжей Pichia sp. 87-9
Уфимский государственный нефтяной технический университет, кафедра биохимии и технологии микробиологических производств 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел. (347) 2431935, e-mail: [email protected]
A. N. Shakirov, N. I. Petukhova, V. V. Zorin
Synthesis of (S)-6-hepten-2-ol during bioreduction of 6-hepten-2-on by yeast cells Pichia sp. 87-9
Ufa State Petroleum Technological University 1, Kosmonavtov Str, 450062 Ufa, Russia; ph. (347) 431935, e-mail: [email protected]
Исследовано восстановление 6-гептен-2-она в (5)-6-гептен-2-ол — синтон спориолида А, известного своей цитотоксической активностью к раковым клеткам и антимикробным действием в отношении ряда патогенных микроорганизмов, в присутствии биомассы дрожжей Pichia sp. 87-9, полученной культивированием на среде с глицерином в качестве основного источника углерода. Показано, что в фосфатном буфере, содержащем 20% изопропанола, биовосстановление 6-гептен-2-она протекает энантиоселективно с образованием энантиомерно чистого (5)-6-геп-тен-2-ола (99% ее) с выходом 98% в течение 3 ч.
Ключевые слова: биовосстановление; 6-геп-тен-2-ол; 6-гептен-2-он; микроорганизмы; энан-тиоселективный биокатализ.
The reduction of 6-hepten-2-on to (5)-6-hepten-2-ol — syntone of sporiolide A, possessing a cytotoxicity to cancer cells and antimicrobial activity against pathogenic microorganisms, by yeast biomass Pichia sp. 87-9 obtained by culturing in a medium with glycerol as the primary carbon source was searched. It is shown, that bioreduction of 6-hepten-2-on in the phosphate buffer, containing 20% of isopropanol, proceeds enantioselectively and allows to obtain enantiomerically pure (5)-6-heptene-2-ol (99% ee) with 98% yield for 3 hours.
Key words: bioreduction; 6-hepten-2-ol; 6-hepten-2-on; microorganisms; enantioselective biocatalysis.
Оптически чистый (5)-6-геитен-2-ол является одним из ключевых соединений в синтезе выделенного из культурального раствора морских грибов Cladosporium sp., бурых водорослей ЛсИпоЬпсМа (гадИ и красной морской губки Niphates rowi, 12-членного лактона — спориолида А, проявляющего цитотоксичность
к клеткам L1210 лимфоидной лейкемии мышей и антимикробную активность в отношении ряда патогенных грибов (Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Aspergillus niger, Neurospora crassa) и грамположительных бактерий Micrococcus luteus 1 (схема 1).
O
O OBz
Спориолид А
OH
(8)-6-гептен-2-ол
Схема 1.
Дата поступления 25.07.13
Схема 2.
Ранее была найдена культура дрожжей Р1еЫа 87-9, способная к трансформации
5-гексен-2-она и подобраны условия, обеспечивающие энантиоселективное восстановление его в (Б)-5-гексен-2-ол с энантиомерной чистотой 99% ее и высоким выходом (95%) 2.
Установлено, что в присутствии трехсуточной биомассы дрожжей Р1ек1а $р. 87-9, полученной глубинным культивированием на среде, содержащей 5% глицерина, также эффективно протекает энантиоселективное биовосстановление 6-гептен-2-она с образованием высокочистого энантиомера (Б)-6-гептен-2-ола (схема 2).
В подобранных условиях (30 оС; 0.1М фосфатный буфер рН 7; изопропанол — 20%; субстрат — 5 г/л; биомасса — 80 г (асв)/л)
6-гептен-2-он практически полностью восстанавливается в (Б)-6-гептен-2-ол в течение 3 ч. При этом выход (Б)-6-гептен-2-ола достигает 98%, а энантиомерный избыток составляет не менее 99% (рис. 1). Высокая селективность биокатализатора сохраняется на протяжении 24 ч трансформации.
Таким образом, культура дрожжей Р1еМа 5р. 87-9 и условия энантиоселективного восстановления 5-гексен-2-она в (Б)-5-гексен-2-ол могут быть успешно использованы для получения оптически чистого (Б)-6-гептен-2-ола — синтона перспективного противоракового и антимикробного агента (спориолида А), путем восстановления 6-гептен-2-она.
Экспериментальная часть
Для наработки биомассы дрожжей Р1еМа $р. 87-9 использовали жидкую среду следующего состава (г/л): глицерин — 50; дрожжевой экстракт — 10; пептон — 5; вода водопроводная — 1 л.
Культивирование дрожжей осуществляли глубинным способом в конических колбах емкостью 250 мл, содержащих 50 мл питательной жидкой среды, при температуре 30 оС на орбитальной качалке в течение 72 ч.
Выращенную биомассу отделяли от среды центрифугированием в течение 15 мин при 6000 об/мин, трижды промывали 0.1М фосфатным буфером (рН 7.0) и использовали для трансформации.
Биовосстановление 6-гептен-2-она осуществляли в 0.1М фосфатном буфере (рН 7.0), содержащем биомассу микроорганизмов в количестве 80 г (асв)/л, изопропанол — 20% и субстрат с начальной концентрацией 5.0 г/л. Трансформацию проводили в течение 24 ч при 30 оС при энергичном перемешивании на возвратно-поступательном шейкере.
Отбор проб производили после осаждения клеток центрифугированием в течение 15 мин при 9000 об/мин.
Анализ состава реакционных смесей проводили с помощью газожидкостной хроматографии на хроматографах ЛХМ-8МД (колонка 3000х3мм, 5% полиэтиленгликольсабацина-та на Chromatone N-AW, температуры: колонки 70 оС, испарителя 200 оС; газ-носитель азот, расход: газа-носителя 18—20 мл/мин, водорода 30 мл/мин, воздуха 300 мл/мин) и Хроматек Кристалл 5000.2 (энантиоселек-тивная капиллярная колонка Supelco Astec CHIRALDEX B-PM 30м х 0.25 мм х 0.12 мкм, температура: колонки 80 оС, испарителя и детектора 190 оС; газ-носитель азот, давление газа-носителя 100 кПа, расход: водорода — 30 мл/мин, воздуха 300 мл/мин), снабженными пламенно-ионизационными детекторами.
Непрореагировавший субстрат и продукты трансформации выделяли из осветленной центрифугированием (в течение 15 мин при 9000 об/мин) и высоленной хлористым натрием реакционной смеси путем трехкратной экстракции диэтиловым эфиром в соотношении 1:1(v/v). Объединенные органические вытяжки сушили над безводным сульфатом натрия, затем концентрировали, упаривая растворитель на роторно-пленочном испарителе.
Затем методом колоночной жидкостной хроматографии на силикагеле Merk 60 (0.063— 0.200 мм) отделяли спирт от кетона, элюируя смесью растворителей гексан/этилацетат с градиентом (100:0 ^ 50:50).
100
80 --
^ 60 -f 3 40
20 --
100
80 60 40 20
<u <u
□ выход продукта
□ энантиомерный избыток
0,5 ч 3 ч
24 ч
0
0
Рис. 1. Вьжод и энантиомерный избыток №/6-гептен-2-ола — продукта восстановления 6-гептен-2-она (5 г/л) при 30 оС в 0.1 М фосфатном буфере (рН 7), содержащем20% изопропанола, в присутствии биомассы дрожжей РСЫа sp. 87-9 (80 г(асв)/л)
Идентификацию продуктов реакции осуществляли методом ЯМР. Спектры ЯМР !Н, 13С записаны на приборе Bruker АМ-300 (рабочая частота 300 МГц для 1Н и 75 МГц для 13С). Образцы готовили в стандартных 5 мм ампулах. Концентрация растворов составляла 5—10 %, растворитель — CDCI3, в качестве внутреннего стандарта использовали сигнал тетраметилсилана для ЯМР 1Н и остаточный сигнал хлороформа для ЯМР 13С.
Литература
1. Du Y., Chen Q., J. Linhardt R. // J. Org. Chem.- 2006.- V.71.- P.8446.
2. Шакиров А. Н., Дельмухаметов Р. Р., Пету-хова Н. И., Шахмаев Р. Н., Зорин В. В. // Экологическая химия.- 2012.- Т.21, №3.-С.187.
Спектр ЯМР 1H в СDClз, 8, м. д.: 1.18 д (3H, CH3); 1.43-1.46 м (4H, CHOH-CH2-CH2-CH2); 1.83 уш. с (1H, OH); 2.04-2.07 м (2H, CH2CH=); 3.75-3.81 м (1H, CHOH); 4.91-5.03 м (2H, CH2=); 5.69-5.90 м (1H, CH=). Спектр ЯМР 13С в СDCl3, 8, м.д.: 23,2 (С1); 24.9 (C4); 33.5 (C3); 38.5 (C5); 67.6 (C2); 114.3 (C7); 138.5 (C6).
References
1. Du Y., Chen Q., J. Linhardt R. J. Org. Chem.-2006.- V.71.- P.8446.
2. Shakirov A. N., Del'muhametov R. R., Petuho-va N. I., Shakhmaev R. N., Zorin V. V. Ekologicheskaya khimiya.- 2012.- Т.21, №3.-С.187.
