CC BY
58
УДК 544.473:577.15
А. Н. Шакиров (асп.), Р. Р. Дельмухаметов (студ.), Н. И. Петухова (к. биол. н., доц.), В. В. Зорин (чл.-корр. АН РБ, д.х.н., проф., зав. каф.)
ЭНАНТИОСЕЛЕКТИВНОЕ ВОССТАНОВЛЕНИЕ Я-МЕТОКСИАЦЕТОФЕНОНА С ПОМОЩЬЮ ДРОЖЖЕЙ
Р1СН1А ГЕЯМЕМГШБ 87-9
Уфимский государственный нефтяной технический университет, кафедра биохимии и технологии микробиологических производств 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел. (347) 2431935, е-mail: bio@rusoil.net
A. N. Shakirov, R. R. Delmukhametov, N. I. Petukhova, V. V. Zorin
ENANTIOSELECTIVE REDUCTION OF P-METHOXYACETOPHENONE BY YEASTS PICHIA FERMENTANS 87-9
Ufa State Petroleum Technological Univercity 1, Kosmonavtov Str, 450062 Ufa, Russia; ph. (347) 2431935, e-mail: bio@rusoil.net
Исследовано восстановление и-метоксиацетофе-нона в (5)-1-(4-метоксифенил)этанол — ключевой синтон для получения циклоалкил[Ь]индолов в присутствии биомассы дрожжей Р1еЫа (еттеп-Ьат 87-9. Предложен метод получения энзимати-чески активной биомассы дрожжей культивированием на питательной среде с глицерином в качестве основного источника углерода. Подобраны условия ее эффективного использования в процессе энантиоселективного восстановления и-метоксиацетофенона в (5)-1-(4-метоксифенил)-этанол в 0.1 М фосфатном буфере, содержащем 10% изопропанола, позволяющие получать продукт высокой энантиомерной чистоты (99% ее) с выходом 86% в течение 45 мин трансформации.
Ключевые слова: дрожжи Р1еЫа (еттепЬат 87-9; микроорганизмы; и-метоксиацетофенон; 1-(4-метоксифенил)этанол; энантиоселектив-ный биокатализ.
Работа выполнена при финансовой поддержке Минобрнауки России в рамках базовой части гос. задания
Оптически активный (5)-1-(4-метоксифе-нил)этанол является ключевым синтоном в синтезе циклоалкил[Ь]индолов, которые могут быть использованы при лечении аллергических реакций 1'2. Перспективным подходом к получению этого энатиомера является биовосстановление его прохирального предшественника (и-метоксиацетофенона) с помощью клеток дрожжей или грибов 3-5.
Ранее нами было показано, что трехсуточная биомасса дрожжей Р1еМа (еттепЬапв 87-9,
Дата поступления 14.01.15
The reduction of p-methoxyacetophenone to (5)-1-(4-methoxyphenyl)ethanol - the key synthon of cycloalkyl[b]indoles - in presence of yeasts Pichia fermentans 87-9 biomass was searched. The method of preparing enzymatically active yeasts biomass by growth on the medium with glycerol as the main carbon source is proposed. The conditions of p-methoxyacetophenone reduction to (5)-1-(4-methoxyphenyl)ethanol by aforementioned biomass allowing 85% yield of product with high optical purity of 99% ee are determined as 0.1 M phosphate buffer containing 10% isopropanol at the time of transformation is 45 min.
Key words: enantioselective biocatalysis; microorganisms; p-methoxyacetophenone; 1-(4-methoxyphenyl)ethanol; yeasts Pichia fermen-tans 87-9.
This work was financially supported by the Ministry of Education and Science of the Russian Federation as part of the base part of the state task.
достигшая стационарной фазы роста при культивировании на пептоно-дрожжевой среде (дрожжевой экстракт — 1%; пептон — 0.5%), содержащей 5% глицерина, энантиоселективно восстанавливает ряд карбонилсодержащих соединений (5-гексен-2-он, 6-гептен-2-он, гексан-2-он, гептан-2-он, 4-метилпентан-2-он, ацето-фенон, п-хлор-, п-бром-, п-нитроацетофеноны в практически важные 5-спирты высокой энантиомерной чистоты (93—99 % ее) 6-9. Однако восстановление п-метоксиацетофенона в присутствии такой биомассы в предложенных
Таблица 1
Выход и энантиомерная чистота (8)-1-(4-метоксифенил)этанола при восстановлении л-метоксиацетофенона (5 г/л) при 30 оС в 0.1М фосфатном буфере (рН 7), содержащем 5% изопропанола, в присутствии трехсуточной биомассы культуры
Р. ТегтепХапв 87-9 (80 г (асв)/л)
Культура Содержание гли- Время Выход (Б)-1-(4-метокси- Энантиомерная
церина в среде, % реакции, ч фенил)этанола, % чистота, % ее
Трехсуточная 5 24 14 98
Трехсуточная 3 24 80 44
72 80 16
Односуточная 3 24 88 87
72 82 54
условиях (0.1 М фосфатный буфер (рН 7), содержащий 20% изопропанола, 5 г/л субстрата, 80 г(асв)/л биомассы, 30 оС) не протекает.
В настоящей работе осуществлен поиск альтернативных условий получения энзима-тически активной биомассы дрожжей Р. (втшвпЬат 87-9 и ее использования для энан-тиоселективного восстановления п-метокси-ацетофенона. Исследовано влияние содержания глицерина в ростовой среде и продолжительности культивирования дрожжей на восстановительные свойства биомассы, а также концентрации изопропанола в реакционной смеси, на процесс восстановление кетона.
Реализация трансформации п-метоксиаце-тофенона в буфере с более низким содержанием изопропанола (5%) позволила выявить способность трехсуточной биомассы дрожжей Р. (втшвпЬат 87-9, полученной на среде, содержащей 5% глицерина, восстанавливать этот кетон. В процессе восстановления образуется (5)-1-(4-метоксифенил)этанол высокой энан-тиомерной чистоты (98%), но с низким выходом (14%) (табл. 1).
Значительно более высокий выход продукта (80% за 24 ч) в этих условиях достигается при использовании трехсуточной биомассы, полученной на среде с 3% глицерина (табл. 1). Однако энантиомерная чистота (5)-1-(4-меток-сифенил)этанола, образующегося в этих условиях, не превышает 44%. При более продолжительной трансформации (в течение 72 ч) энанти-омерный избыток становится еще меньше (16% ее), вероятно, в результате сопутствующей сте-реоинверсии 5-энантиомера в ^-энантиомер.
он
Замена трехсуточной биомассы дрожжей на односуточную позволила существенно увеличить энантиомерную чистоту целевого продукта, образовавшегося за 24 ч реакции в системе с 5% изопропанола (с 44 до 87 % ее). При этом выход продукта увеличивается с 80 до 88 % (табл. 1).
Энантиомерно чистый (5)-1-(4-метоксифе-нил)этанол образуется в системе, содержащей 20% изопропанола (табл. 2). Снижение концентрации изопропанола в реакционной смеси приводит к потере селективности биокатализатора. В оптимальной по выходу продукта системе (5% изопропанола) энантиомерная чистота (5)-1-(4-метоксифенил)этанола составляет 91% ее.
Таблица 2
Зависимость энантиомерной чистоты (8 )-1-(4-метоксифенил)этанола (в % ее),
образующегося при 30 оС в процессе восстановлении л-метоксиацетофенона (5 г/л) в 0.1М фосфатном буфере (рН 7) в присутствии односуточной биомассы культуры Р. fermentans 87-9 (80 г (асв)/л), полученной на среде с 3% глицерина,
от концентрации изопропанола
Изопропанол, % Энантиомерная чистота, % ее
4 ч 17 ч 24 ч
5 91 88 87
10 92 89 89
15 94 93 93
20 100 100 100
Таким образом, односуточная биомасса Р. (втшвпЬат 87-9 (экспоненциальной фазы роста) является перспективным энантиоселек-тивным биокатализатором для получения (5)-1-(4-метоксифенил)этанола. Однако, существенным недостатком метода получения такой биомассы является ее низкий выход. На среде с 3% глицерина выход биомассы после первых суток культивирования в 4 раза ниже, чем через 3 сут выращивания дрожжей.
С целью разработки более эффективного способа получения энзиматически активной биомассы для восстановления п-метоксиацетофено-на была исследована возможность использования для биокатализа трехсуточной биомассы дрожжей, полученной на среде с 3% глицерина,
предварительно выдержанной в свежей питательной среде того же состава в течение 18 ч. Было обнаружено, что в процессе такой операции исходное количество биомассы (8.2 г(асв)/л среды) дополнительно увеличивается (более чем в 2 раза).
При исследовании восстановления п-ме-токсиацетофенона в системах с 5—10 %-ным содержанием растворителя в присутствии прединкубированной биомассы установлено, что в этих условиях процесс протекает более энантиоселективно (рис. 1), чем при использовании односуточной биомассы (табл. 2) и приводит к образованием высокочистого (5)-1-(4-метоксифенил)этанола (99% ее).
д—й—
20 -+ — — —
выход при 5% изопропанола выход при 10 % изопропанола чистота при 5 % изопропанола чистота при 10% изопропанола
2 3
Время, ч
Рис. 1. Динамика образования и энантиомерной чистоты (8)-1-(4-метоксифенил)этанола в процессе восстановления п-метоксиацетофенона при 30 оС в 0.1М фосфатном буфере (рН 7), содержащем 5 или 10% изопропанола, в присутствии прединку-бированной биомассы культуры Р. fermentans 87-9 (80 г (асв)/л), полученной на среде с3% глицерина
Наиболее эффективно восстановление протекает при концентрации изопропанола 5%. В этих условиях (5)-1-(4-метоксифенил)-этанол образуется с выходом 86% и энантио-мерной чистотой 99% ее в течение 45 мин трансформации (рис. 1).
Таким образом, предложен метод получения энзиматически активной биомассы дрожжей Р. (вгшвпЬат 87-9 и подобраны условия ее использования в процессе энантиоселектив-ного восстановления п-метоксиацетофенона в (5)-1-(4-метоксифенил)этанол, позволяющий получать продукт с высокими выходом и энантиомерной чистотой.
Экспериментальная часть
Для наработки биомассы дрожжей Р. (втшвпЬат 87-9 использовали жидкую питательную пептоно-дрожжевую среду с глицерином следующего состава (г/л): глицерин — 30 или 50; дрожжевой экстракт — 10; пептон — 5; вода водопроводная — 1 л.
Культивирование дрожжей осуществляли глубинным способом в конических колбах объемом 250 мл, содержащих 50 мл питательной жидкой среды, при температуре 30 оС на орбитальном шейкере (180 об/мин) в течение 24 или 72 ч (до достижения экспоненциальной или начала стационарной фазы роста, соответственно).
Выращенную биомассу отделяли от среды центрифугированием в течение 15 мин при 6000 об/мин, трижды промывали 0.1М фосфатным буфером (рН 7) и использовали для трансформации. В экспериментах с прединку-бированной биомассой выращенную в течение 72 ч биомассу отделяли от среды центрифугированием в течение 15 мин при 6000 об/мин, после чего ее снова помещали в 50 мл свежей питательной среды и вновь культивировали при температуре 30 оС на орбитальном шейкере (180 об/мин) в течение 18 ч. Прединкубиро-ванную биомассу отделяли от среды центрифугированием в течение 15 мин при 6000 об/мин, трижды промывали 0.1М фосфатным буфером (рН 7) и использовали для трансформации.
Биовосстановление кетонов осуществляли в 0.1М фосфатном буфере (рН 7), содержащем биомассу микроорганизмов в количестве 80 г (асв)/л, изопропанол — 5, 10, 15 или 20 % и субстрат с начальной концентрацией 5 г/л. Трансформацию проводили при 30 оС при перемешивании на возвратно-поступательном шейкере.
Текущий контроль состава реакционных смесей проводили методом газо-жидкостной хроматографии на хроматографах ЛХМ-8МД (колонка 3000x3мм, 5% полиэтилен-гликольсе-бацината на СЬгоша1оие Ы-А", температуры: колонки 70 оС, испарителя 200 оС; газ носитель азот, расходы: газа-носителя — 18—20 мл/мин, водорода — 30 мл/мин, воздуха — 300 мл/мин) и Хроматек Кристалл 5000.2 (энантиоселектив-ная капиллярная колонка 8ире1ео Ав1ее CHIRALDEX В-РМ 30мх0.25ммх0.12мкм, температуры: колонки 80 оС, испарителя и детектора 190 оС; газ носитель азот, давление газа-носителя 100 кПа, расходы: водорода — 30 мл/мин, воздуха — 300 мл/мин), снабженными пламенно-ионизационными детекторами.
Непрореагировавший субстрат и продукт трансформации выделяли из осветленной центрифугированием (в течение 15 мин при 9000 об/мин) и подсоленной хлористым натрием реакционной смеси путем трехкратной экстракции диэтиловым эфиром в соотношении 1:1(у/у). Объединенные органические вытяжки сушили над безводным сульфатом натрия и концентрировали, упаривая растворитель на роторно-пленочном испарителе. Спирт от ке-
80
-- 80
60
а: 60
40
-- 40
20
0
0
тона отделяли методом колоночной жидкостной хроматографии на силикагеле Merk 60 (0.0630.200 мм), элюируя смесью растворителей гек-сан/этилацетат с градиентом (100:0 ^ 50:50).
Идентификацию продуктов реакции осуществляли методами ЯМР. Спектры ЯМР 1Н, 13С записаны на приборе Bruker АМ-300 (рабочая частота 300 МГц для 1Н и 75 МГц для 13С). Образцы готовили в стандартных 5 мм ампулах. Концентрация растворов составляла 5—10%, растворитель — CDCI3, в качестве
Литература
1. Hillier C., Marcoux J. F., Zhao D. L., Grabowski E. J., Mckeown A. E., Tillyer R. D. Stereoselective formation of carbon-carbon bonds via SN2-displacement: synthesis of substituted cycloalkyl[b]indoles // J. Org. Chem.- 2005.-V.70.- P. 8385-8394.
2. Hillier М. C., Desrosiers J. N., Marcoux J. F., Grabowski E. J. Stereoselective carbon-carbon bond formation via the Mitsunobu displacement of chiral secondary benzylic alcohols // Org. Lett.- 2004.- V.6.- P.573-576.
3. Nakamura K., Matsuda T. Asymmetric reduction of ketones by the acetone powder of Geotrichum candidum // J. Org. Chem.- 1998.- V.63.-P.8957-8964.
4. Wendlausen R., Moran P.J.S., Joekes I., Rodrigues J.A.R. Continuous process for large-scale preparation of chiral alcohols with baker's yeast immobilized on chrysotile fibers // J. Mol. Catal. B: Enzym.- 1998.- V.5.- P.69-73.
5. Wang W., Zong M.-H., Lou W.-Yo. Use of an ionic liquid to improve asymmetric reduction of 4'-methoxyacetophenone catalyzed by immobilized Rhodotorula sp. AS2.2241 cells // J. Mol. Catal. B: Enzym.- 2009.- V.56.- P.70-73.
6. Шакиров А. Н., Петухова Н. И., Дельмухаме-това Р. Р., Коренева С. В., Зорин В. В. // Баш. хим. ж.- 2012.- Т.19, №2.- C.71-73.
7. Шакиров А. Н., Дельмухаметов Р. Р., Петухо-ва Н. И., Шахмаев Р. Н., Зорин В. В. Глицерин - сырье для получения биокатализатора энан-тиоселективного восстановления 5-гексен-2-она в (3)-5-гексен-2-ол - ключевой синтон низкомолекулярных биорегуляторов // Экологическая химия.- 2012.- Т. 21, №3.- C.187-192.
8. Шакиров А. Н., Петухова Н. И., Зорин В. В. Получение (5)-6-гептен-2-ола биовосстановлением 6-гептен-2-она с помощью клеток дрожжей Pichia sp. 87-9// Баш. хим. ж.- 2013.- Т.20, №3.- С.20-22.
9. Шакиров А. Н., Петухова Н. И., Зорин В. В. Энантиоселективное восстановление карбонил-содержащих соединений с помощью дрожжей Pichia fermentans 8779// Баш. хим. ж.-2013.- Т.20, №4.- С.59-63.
внутреннего стандарта использовали сигнал тетраметилсилана для ЯМР и остаточный сигнал хлороформа для ЯМР 13С.
(5)-1-(4-Метоксифенил)этанол. Спектр ЯМР *Н, 8, м. д.: 1.45 д (3Н, СН3СНОН), 3.79 с (3Н, СН30), 4.81 кв (1Н, СИОН), 6.87 д (2Н, Аг), 7.28 д (2Н, Аг). Спектр ЯМР 13С, 8, м.д.: 24.83 (СН3СНОН), 54.96 (СН3О), 69.46 (СНОН), 113.51 (2С, Аг), 126.48 (2С, Аг), 137.98 (1С, Аг), 158.55 (1С, Аг).
References
1. Hillier C., Marcoux J.F., Zhao D.L., Grabowski E.J., Mckeown A.E., Tillyer R.D. [Stereoselective formation of carbon-carbon bonds via SN2-displace-ent: synthesis of substituted cycloalkyl-[b]indoles]. J. Org. Chem. 2005, v. 70, pp. 8385-8394.
2. Hillier M.C., Desrosiers J.N., Marcoux J.F., Grabowski E.J. [Stereoselective carbon-carbon bond formation via the Mitsunobu displacement of chiral secondary benzylic alcohols]. Org. Lett. 2004, v.6, pp. 573-576.
3. Nakamura K., Matsuda T. [Asymmetric reduction of ketones by the acetone powder of Geotrichum candidum]. J. Org. Chem. 1998, v. 63, pp. 8957-8964.
4. Wendlausen R., Moran P.J.S., Joekes I., Rodrigues J.A.R. [Continuous process for large-scale preparation of chiral alcohols with baker's yeast immobilized on chrysotile fibers]. J. Mol. Catal. B: Enzym. 1998, v.5, pp. 69-73.
5. Wang W., Zong M.-H., Lou W.-Yo. [Use of an ionic liquid to improve asymmetric reduction of 4'-methoxyacetophenone catalyzed by immobilized Rhodotorula sp. AS2.2241 cells]. J. Mol. Catal. B: Enzym. 2009, v. 56, pp. 70-76.
6. Shakirov A. N., Petukhova N. I., Del'mukhame-tov R.R., Koreneva S.V., Zorin V.V. Mikro-biologicheskoe enantioselektivnoe vosstanovlenie atsetofenona i ego funktsional'nykh proizvodnykh [Microbiological enantioselective reduction of acetophenon and its functional derivatives] Bashkir skii khimicheskii zhurnal [Bashkir chemical journal], 2012, v. 19, no 2, pp. 71-73.
7. Shakirov A. N., Del'mukhametov R. R., Petukhova N.I., Shakhmaev R.N., Zorin V.V. Glitserin — syr'yo dlya polucheniya biokatalizatora enantiose-lektivnogo vosstanovleniya 5-geksen-2-ona v (S)-5-geksen-2-ol — klyuchevoi sinton nizkomoleku-lyarnykh bioregulyatorov [Glycerol — a raw material for the biocatalyst enantioselective reduction of 5-hexen-2-one (S)-5-hexen-2-ol — a key synthon low-molecular bioregulators]. Ekologicheskaya khimiya [Ecological chemistry], 2012, v. 21, no. 3, pp. 187-192.
8. Shakirov A.N., Petuhova N.I., Zorin V.V. Poluchenie (S)-6-gepten-2-ola biovosstanov-leniem 6-gepten-2-ona s pomoshch'yu kletok drozhzhei Pichia sp. 87-9 [Synthesis of (S)-6-hepten-2-ol during bioreduction of 6-hepten-2-on by yeast cells Pichia sp. 87-9] Bashkirskii khimicheskii zhurnal [Bashkir chemical journal], 2013, v. 20, no 3, pp. 20-22.
9. Shakirov A.N., Petuhova N.I., Zorin V.V. Enantiose-lektivnoe vosstanovlenie karbonilsoderzhashchikh soedinenii s pomoshch'yu drozhzhei Pichia fermen-tans. 87-9 [Enantioselective reduction of carbonyl compounds by yeasts Pichia fermentans 87-9] Bashkirskii khimicheskii zhurnal [Bashkir chemical journal], 2013, v. 20, no 4, pp. 59-63.
