CC BY
25
УДК 544.473л577.15
А. Н. Шакиров (асп.), В. В. Зорин (чл.-корр. АН РБ, д.х.н., проф., зав. каф.), Н. И. Петухова (к. биол. н., доц.), Л. Я. Василова (к. техн. н., доц.)
Поиск биокатализаторов для энантиоселективного восстановления и-метоксиацетофенона
Уфимский государственный нефтяной технический университет, кафедра биохимии и технологии микробиологических производств 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел. (347) 2431935, e-mail: bio@rusoil.net
A. N. Shakirov, V. V. Zorin, N. I. Petukhova, L. Ya. Vasilova
Search of biocatalysts for the enantioselective reduction of p-methoxyacetophenone
Ufa State Petrolium Technical Univercity 1, Kosmonavtov Str, 450062 Ufa, Russia; ph. (347) 2431935, e-mail: bio@rusoil.net
Исследована способность шести дрожжевых культур восстанавливать и-метоксиацетофенон в 1-(4-метоксифенил)этанол в аэробных условиях при 30—32 оС в 0.1 М фосфатном буфере (рН 7), содержащем 10% (об./об.) изопропанола. Выявлены две наиболее активные дрожжевые культуры Р1еН1а эр. 80-11 и Ме1зсНткот1а эр. 8413, осуществляющие этот процесс энантиоселек-тивно с преимущественным образованием (5)-1-(4-метоксифенил)этанола — ключевого синтона циклоалкил[Ь]индолов.
Ключевые слова: 1-(4-метоксифенил)этанол; и-метоксиацетофенон; микроорганизмы; энан-тиоселективный биокатализ.
Оптически активный (5)-1-(4-метоксифе-нил)этанол (5-1) является ключевым синто-ном в синтезе циклоалкил[Ь]индолов, которые могут быть использованы при лечении аллергических реакций 1>2. Перспективным подходом к получению этого энантиомера является биовосстановление его прохирального предшественника (и-метоксиацетофенона, 2) с помощью клеток дрожжей или грибов 3-5.
С целью разработки эффективного биокатализатора осуществлен поиск ферментов, способных катализировать энантиоселективное восстанавление кетона 2, у шести дрожжевых культур из коллекции кафедры биохимии и технологии микробиологических производств Уфимского государственного нефтяного технического университета.
В результате тестирования 6 культур микроорганизмов были обнаружены 3 штамма, которые в течение 24 ч в аэробных условиях при температуре 30—32 оС в 0.1 М фосфатном буфере (рН 7), содержащем 10% (об./об.) изопропанола — экзогенного восстановителя,
Дата поступления 22.09.11
The ability of 6 yeast cultures to reduce p-methoxyacetophenone into 1-(4-methoxyphe-nyl)ethanol under aerobic conditions, 30—32 0C in phosphate buffer solution (pH 7) containing 10% (v/v) of isopropanol was researched. Two active yeast cultures Pichia sp. 80-11 and Metschnikowia sp. 84-13 providing this process enantioselectively with predominate production of (5')-1-(4-methoxyphenyl)ethanol — the key syntones for the cycloalkyl[b]indoles — were found.
Key words: 1-(4-methoxyphenyl)ethanol; p-methoxyacetophenone; microorganisms; enan-tio-selective biocatalysis.
5 г/л субстрата и 80 г (асв)/л биомассы, трансформировали кетон 2 с конверсией более 30% (рис. 1).
1 2 3 4 5 6
Рис. 1. Конверсия субстрата в процессе трансформации и-метоксиацетофенона (2) при 30 °С в 0.1 М фосфатном буфере (рН 7), содержащем 10% изопропанола, 5 г/л субстрата и 80 г (асв)/л биомассы микроорганизмов, в течение 24 ч: 1 — Pichia sp. 8011; 2 — Metschnikowia sp.84-13; 3 — Saccharomyces cerevisiae; 4 — Hansenula sp.; 5 — Pichia sp.; 6 — Rhodotorulla sp.
Исследование продуктов трансформации показало, что при использовании большинства тестируемых микроорганизмов в реакционных смесях накапливается только 1-(4-метоксифе-нил)этанол (1). Исключение составили дрожжи ЯкойоЬоти1а зр., которые трансформировали кетон (2) неселективно.
Изучение кинетики накопления спирта 1 в процессе биовосстановления кетона 2 в присутствии клеток Р1сМа зр. 80-11 и МвЬзсН-пгкошга зр. 84-13 показало, что кривая выходит на плато уже через 3 ч трансформации (рис. 2). Это свидетельствует о высокой скорости процесса восстановления кетона 2 с помощью этих микроорганизмов.
Таблица 1
Оптические свойства и стереонаправленность синтеза 1-(4-метоксифенил)этанола (1) в процессе восстановления л-метоксиацетофенона (2) с помощью микроорганизмов
Микроорганизм а5 (конфигурация) Оптическая чистота, % ее
РШа эр. 80-11 -17.2 (Б) 33.1
Metschnikowia эр. 84-13 -14.0 (Б) 27.0
Рис. 2. Кинетика накопления 1-(4-метоксифенил)-этанола (1) в процессе трансформации и-метокси-ацетофенона (2) при 30 °С в 0.1М фосфатном буфере (рН 7), содержащем 10% изопропанола, 5 г/л субстрата и 80 г (асв) / л биомассы микроорганизмов
Исследование оптических свойств спирта 1 показало, что дрожжи Р1сЫа зр. 80-11 и Мв1зсНп1кош>1а зр. 84-13 осуществляют восстановление кетона 2 энантиоселективно с преимущественным образованием целевого (5)-(-)-1-(4-метоксифенил)этанола (табл. 1).
* Стандартная величина удельного вращения (Я)-(+)-1-(4-метоксифенил)этанола [а]™ + 51.9 (с=1, СНС13), (Б)-(-)-1 -(4-метоксифенил)этанола [а]™ - 51.9 (с=1, СНС13)
Вместе с тем, было установлено, что выход продукта в расчете на исходный субстрат не превышает 56—58 % (рис. 3). Снижение исходной концентрации субстрата до 2.5 г/л не привело к существенному изменению выхода целевого продукта.
суб страт - 5 г/л ■ субстрат - 2.5 г/л
Рис. 3. Выход 1-(4-метоксифенил)этанола (1) при восстановлении и-метоксиацетофенона (2) при различных начальных концентрациях субстрата при 30 оС в 0.1 М фосфатном буфере, содержащем 10% изопропанола, в присутствии клеток микроорганизмов (80 г (асв)/л ) в течение 24 ч
По-видимому, это связано с достижением состояния равновесия в обратимых реакциях восстановления кетона 1 и окисления спирта 2, которые, как известно, могут протекать одновременно под действием различных оксидоре-дуктаз, присутствующих в клетках микроорганизмов 6'7.
Таким образом, найдены дрожжевые культуры Pichia sp. 80-11 и Metschnikowia sp. 84-13, перспективные для разработки биокаталитического метода получения (5)-1-(4-метоксифенил)этанола. Для увеличения выхода и оптической чистоты продукта необходима оптимизация условий реакции для смещения равновесия окислительно-восстановительных процессов в сторону образования целевого 5-энантиомера.
Экспериментальная часть
Спектры ЯМР и С записывали в CDCl3 на приборе Bruker АМ-300 (рабочая частота 300 и 75.47 МГц соответственно), внутренний стандарт — остаточный сигнал CHCl3 или ТМС. Удельное вращение полученных продуктов ([a]D продукта) измеряли, на автоматическом поляриметре «Perkin Elmer» Model 341 Ро1апте1ег при А=589 нм. Стандартная величина удельного вращения (R)-(+)-1-(4-метоксифенил)этанола [a]D + 51.9 (с=1, CHCl3), (Б)-(-)-1-(4-метоксифенил)эта-нола [а]д - 51.9 (с=1, CHCl3) 3.
Биовосстановление п-метоксиацетофено-на осуществляли при 30—32 оС в 0.1М фосфатном буфере (рН 7), содержащем изопропанол — 10%, биомассу микроорганизмов — 80 г (асв)/л и субстрат — 2.5—5 г/л, при перемешивании в течение 2 сут. Биомассу микроорганизмов для трансформации получали, как описано ранее .
Текущий контроль концентрации субстрата и продукта в пробах, предварительно осветленных центрифугированием (10 мин при 5000 об/мин), осуществляли на хроматографе ЛХМ-8МД с пламенно-ионизационным детектором, на колонке 3000 х 3 мм с 5% полиэти-
ленгликольсебацината на хроматоне N-AW. Режим анализа: температура колонки - 16G оС, температура испарителя - 25G оС, газ-носитель (азот) - 3G мл/ мин, водород - 3G мл/ мин, воздух - 3GG мл/мин.
Выделение 1-(4-метоксифенил)этанола осуществляли из осветленной центрифугированием реакционной смеси (15 мин при 5GGG об/мин). Продукт трансформации высаливали с помощью NaCl и троекратно экстрагировали равным объемом диэтилового эфира. Экстракт осушали над обезвоженным сульфатом магния и концентрировали на роторно-пленочном испарителе. ^прореагировавший субстрат отделяли от целевого продукта на хроматографи-ческой колонке с силикагелем Merk 6G (G.G63-G.2GG мм), элюент - гексан:этилацетат (8:1). 1-(4-Meтоксифeнил)этанол (1). Спектр ßMP 1H, 8, м. д.: 1.45 д (3H, CH3CHOH), 2.3G (1H, OH), 3.79 с (3H, CH3O), 4.81 кв (1H, CHOH), 6.87 д (2H, AO, 7.28 д (2H, AO. Спектр ßMP 13С, 8, м.д.: 24.83 (CH3CHOH), 54.96 (CH3O), 69.46 (CHOH), 113.51 (2C, Aг), 126.48 (2C, Лг), 137.98 (1C, AT), 158.55 (1C, Ar).
Литература
1. Hillier C., Marcoux J.F., Zhao D.L., Grabowski E.J.J., Mckeown A.E., Tillyer R.D. // J. Org. Chem.- 2GG5.- V.7G.- P.8385.
2. Hillier C., Desrosiers J. N., Marcoux J. F., Grabowski E. J.J. //Org. Lett.- 2GG4.- V.6.- P. 573.
3. Nakamura K., Matsuda T. // J. Org. Chem.-1998.- V.63.- P.8957.
4. Wendlausen R., Moran P.J.S., Joekes I., Rodrigues J.A.R. // J. Mol. Catal. B: Enzymatic.-1998.- V.5.- P.69.
5. Wang W., Zong M.-H., Lou W.-Yo. // J. Mol. Catal. B: Enzym.- 2GG9.- V.56.- P.7G.
6. Faber K. Biotransformations in Organic Chemistry. Springer, Berlin, 1997.- 245 P.
7. Зорин В. В., Петухова H. И. // Панорама современной химии. Успехи органического катализа и химии гетероциклов.- M.: Химия, 2006.- C.28G.
8. Василова Л. Я., Зорин В. В., Петухова H. И., Шакиров A. H. // Баш. хим. ж.- 2G1G.- Т.17, №5.- С.32.
