CC BY
32
УДК 579.66:547.94
Л. Я. Василова (к.т.н., доц.), А. Н. Шакиров (асп.), Н. И. Петухова (к.биол.н.,доц.), Р. Н. Шахмаев (к.х.н., доц.), В. В. Зорин (чл.-корр. АН РБ, д.х.н., проф., зав. каф.)
Поиск подходов к стереоконтролю биокатализаторов процесса восстановления 5-гексен-2-она
Уфимский государственный нефтяной технический университет, кафедра биохимии и технологии микробиологических производств 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел. (347) 2431935, e-mail:_bio@rusoil.net
L. Ya. Vasilova, A. N. Shakirov, N. I. Petukhova, R. N. Shakhmaev, V. V. Zorin
Approaches to stereocontrol of 5-hexen-2-one reduction biocatalysts
Ufa State Petroleum Technical University 1, Kosmonavtov Str., 450062 Ufa, Russia; ph. (347) 2431935, e-mail: bio@rusoil.net
Осуществлен поиск подходов к повышению сте-реоселективности процесса биовосстановления 5-гексен-2-она клетками микроорганизмов. Показано, что восстановление 5-гексен-2-она в (5)-5-гексен-2-ол микроорганизмами в атмосфере аргона протекает менее селективно, чем в аэробных условиях. Использование пермеабилизо-ванных клеток для трансформации кетона в аэробных условиях в присутствии изопропано-ла и экзогенного МАОРИ позволяет увеличить энантиоселективность процесса.
Ключевые слова: биовосстановление; 5-гек-сен-2-ол; 5-гексен-2-он; микроорганизмы; энан-тиоселективный биокатализ.
The search of approaches to increase of stereoselectivity in process of 5-hexen-2-one biore-duction by microorganisms' cells was provided. It is shown, that the reduction of 5-hexen-2-one into (5)-5-hexen-2-ol by microorganisms in atmosphere of argon is less selective than in aerobic conditions. The use of permeabilized cells for ketone transformation in aerobic conditions in the presence of isopropanol and exogenous NADPH allows to increase enantioselectivity of process.
Key words: bioreduction; 5-hexen-2-ol; 5-hexen-2-one; microorganisms; enantioselective bio-catalysis.
Оптически активные вторичные спирты (5)-5-гексен-2-ол и (^)-5-гексен-2-ол являются синтонами ряда низкомолекулярных биорегуляторов. В частности, (5)-5-гексен-2-ол является ключевым синтоном (-)-спонгодипсина — противоопухолевого препарата, проявляющего высокую цитотоксическую и антипролифера-тивную активность в отношении раковых кле-
точных линий J774.A1, HEK-293 и WEHI-164 а также служит предшественником (25,7Б)-ди-бутироксинонана — полового феромона злаковой галлицы (Sitodiplosis mosellana) 2. (^)-5-Гексен-2-ол применяется в синтезе дезоксимускарина — широко используемого мускариноподобного агониста 3.
Дата поступления 17.10.10
Ранее нами были выявлены 5 штаммов микроорганизмов (Geotriclmm sp. 85—i, Candida sp. 81 — 12, Metschnikowia sp. 84 — 13, Candida sake 111 и Pichia sp. 87—3), способные в течение 5—12 ч восстанавливать 5-гек-сен-2-он в аэробных условиях с высоким (78-98% ) выходом продукта 4. Это позволяет рассматривать их в качестве потенциальных биокатализаторов для получения (5)-5-гексен-2-ола. Однако в аэробных условиях образующийся продукт имеет низкую оптическую чистоту (не более 15% ее).
Известно, что стереоселективность клеточных катализаторов может существенно меняться под действием различных факторов, действующих как на стадии выращивания биомассы микроорганизмов, так и на стадии трансформации кетона (анаэробные условия, пермеабилизация клеток и др.) 5,в.
Доступность кислорода в процессе восстановления карбонилсодержащих соединений является одним из важнейших факторов, поскольку от этого зависит уровень коферментов NADH и NADPH в клетках, выполняющих роль эндогенного восстановителя 5,е. С целью поиска подходов к увеличению селективности процесса в настоящей работе была изучена трансформация 5 гексен-2-она микроорганизмами в анаэробных условиях (в атмосфере аргона).
В результате исследования было обнаружено, что все вышеупомянутые штаммы способны трансформировать 5-гексен-2-он в 5-гексен-2-ол в анаэробных условиях (табл. 1). За 24 ч трансформации конверсия субстрата достигала более 90%, а выходы продукта — 78-94%.
Таблица 1
Конверсия субстрата и выход 5-гексен-2-ола при трансформации 5-гексен-2-она микроорганизмами в анаэробных условиях
Микроорганизм Конверсия, % Выход продукта, %
Geotrichum sp. 85-1 95 79
Candida sake 777 94 78
Candida sp. 81-12 93 88
Metschnikowia sp. 84-13 94 91
Pichia sp. 87-3 97 94
Исследование кинетики восстановления 5-гексен-2-она в анаэробных условиях показало, что наиболее активно процесс осуществля ется в течение 8 ч, после чего кривая накопления продукта выходит на плато и остается на том же уровне до конца трансформации (рис. 5).
- Candida акя 777
- Mcixhniknwijt sp X4-IJ
- Candida sp. 81*12
- Picba sp. 87-3
- Gcoirichum sp. S3- J
Рис. 1. Кинетика накопления 5-гекссн-2-ола при восстановлении 5 тек сен-2 она микроорганизмами в анаэробных условиях при 30 °С в 0.1М фосфатном буфере (рН 7) при начальной концентрации субстрата — 5 т/л, биомассы — 80 г (асв)/л
Изучение оптических свойств препаратов 5-гексен 2-ола, полученных в анаэробных ус ловиях в течение 8 ч трансформации, показало, что все исследуемые микроорганизмы восстанавливали 5-гексен-2-он преимущественно в (5')-5"Гексен-2"ОЛ (табл. 2). При этом оптическая чистота продуктов трансформации не превышала 7% ее.
Таблица 2
Оптические свойства и стереонаправленность синтеза при восстановлении 5-гексен-2-она различными микроорганизмами в анаэробных условиях
Микроорганизм m (конфигурация) Оптическая чистота продукта. %ee
Geotrichum sp. 85-1 + 0.2 (S) 1.3
Candida sake 777 + 0.6 (S) 4
Candida sp. 81-12 + 1,0 (S) 7
Metschnikowia sp. 84-13 + 0.24 (S) 1.6
Pichia sp. 87-3 + 0.1 {S) 0.7
Условия реакции: 24 ч при 30 "С; 0.1М фосфатный буфер, рН 7.0; биомасса — 80 г (асв)/л; 5 гексен-2-он — 5 г/л, атмосфера аргона.
* Стандартная величина удельного вращения ($Х+)-5-гексен 2 ола - [Z7]l5 +15 (с=1.0%, CHClj), (R)-(-)-5-гексен-2-ом - [/7]f ■ 15(с~1.0%, СНС13)9.
Полученные данные показывают, что при переходе от аэробных условий биотрансформации к анаэробным происходит снижение селективности процесса восстановления 5-гек-сен-2-она исследуемыми клеточными биокатализаторами. Вероятно, более интенсивная аэрация реакционной смеси будет, напротив, способствовать увеличению селективности реакции.
Другим известным подходом увеличения селективности биокатализаторов является предобработка биомассы растворителями (ацетоном, толуолом и др.), вызывающими пермеа-билизацию клеток 5,в. Использование такого подхода в процессах восстановления ароматических кетоиов клетками гриба ОеоЬНскит сапсИЛит, обработанными ацетоном, позволило получить (5)-сп и рты с высокой оптической чистотой 7' .
Предложенная методология была использована нами для восстановления 5-гексен-2-она пермеабилизованиыми клетками исследуе мых микроорганизмов, а также грибами СеоНгШшт цтр. 85-2, 85-3, 85-4, 85-5 и 85-7 из коллекции кафедры биохимии и технологии микробиологических производств Уфимского государственного нефтяного технического университета,
В наших исследованиях в качестве экзогенного восстановителя был использован изо-пропанол. Пермеабилизацию клеток осуществляли обработкой биомассы с помощью ацетона.
В результате исследования были обнаружены 10 штаммов, способных в аэробных условиях восстанавливать 5-гексен-2-он в 0.1 М фосфатном буфере (рН 7), содержащем 5 г/л субстрата, 80 г (асв)/л пермеабилизованных клеток, 0.26 г/л МАБРН и 0.4% изопропано-ла, при температуре 30 °С, в течение 24 ч (табл. 3).
Таблица 3 Конверсия субстрата и выход 5-гексен-2~ола при восстановлении 5-гексен-2-она лермеабилиэованкыми клетками микроорганизмов
Микроорганизм Конверсия субстрата, % Выход продукта, %
Оео!псЬит Бр. 85-1 16 16
СеоМсЬит $р. 85-2 96 94
СеоМсЬит ер. 85-3 88 84
Сео1Г!сЬит $р. 85-4 91 30
Сео1Г1сЬит яр. 65-5 95 92
СеоМсЬит эр. 85-7 96 93
СапёШа Баке 777 63 53
СапёШа зр. 81-12 45 26
Ме^сЬт'кою/'а Бр. 84-13 54 38
РюЫа 5/5 87-3 71 63
Условия реакции: 0.1 М фосфатный буфер (рН 7); 5-гексен-2-он — 5 г/л; пермеабилшоеанные клетки — 80 г/л; М-ШРЯ - 0.26 г/л; чзопропанол - 0.4%, температура 30 "С, время реакции — 24 ч.
Установлено, что при восстановлении 5-гек-сен-2-она пермеабилизованными клетками грибов рода Ce.Otrich.um (кроме Сео(пс1шт $р. 85-1) целевой продукт образуется с высоким выходом (84—94 % от теоретического) (табл. 3).
Исследование кинетики накопления 5-гек-сен-2-ола в реакционной смеси показало, что наибольший выход целевого продукта достигается в большинстве случаев уже через 3—7 ч трансформации (рис. 2). Дальнейшее инкубирование реакционной смеси приводит лишь к незначительному увеличению выхода 5-гек-сен-2-ола.
НчС
СН,
А
пермеа бшшзоваття клет ка
НО н
н,с
^ ЮШ(Р)+
он
Башкирский химический журнал. 2010. Том 17. № 5
Экспериментальная часть
От/лА? 5якс 777 ■У,у $р. '12
Мизс/ш&ююв '
Рл-Ли ¿р. 87-3 <Зео1ГкЬит ¡р. 85-1 ОеохгкЬит ¡р. 85-2 Осо1г!с11ит ¡р. 85'3
\ Т.'Г.'.'ГЛ".-." >/■
ОеосгкЬил} ¡р. 85-5 Сео1г1сЬит ¡р. 85- 7
Рис. 2. Кинетика накопления 5-гексен-2-оля при восстановлении 5-тексен-2-она пермеабилиэоваины-ми клетками микроорганизмов при 30 "С в 0.1 М фосфатном буфере (рН 7) при начальной концентрации субстрата — 5 г /л; пермеабилизо ванных клеток — 80 г/л; NADPH — 0.26 г/л; изопропанола — 0.4%
С помощью микроорганизмов, трансформирующих 5-гексен-2-он, в изученных условиях с выходом 5-гексен-2-ола свыше 85%, был осуществлен синтез целевых продуктов и исследованы их оптические свойства (табл. 4).
Таблица 4
Оптические свойства и стереонаправленностьсинтеза 5-гексен-2-олапермсабилиэованными клетками микроорганизмов
Микроорганизм ¡ÉÉ (конфигурация) Оптическая чистота. % ее
Geotrichum $р. S5-2 + 3,4 (S) 23
Geotrichum sp. 85-3 + 3,8 (S) 25
Geotrichum sp, 85-4 + 4.2 (S) 28
Geotrichum sp. 05-5 + 4 8 (S) 32
Geotrichum sp. 85-7 + 4.6 (S) 31
* Стандартная величина удельного вращения (S)-(+)-5-гексен-2-ола [/7]" + 15 (с=1.0 %, СНС1,), (Ю-(-И гексен 2-ола [/7]205 - 15(с=1,0%, CHCls)9.
Пермеабилизованные ацетоном клетки грибов рода СеоЬНсИит восстанавливали 5-гексен-2-он преимущественно в (5)-5-гексен-2-ол (табл. 4). При этом оптическая чистота полученных продуктов оказалась заметно выше, чем при анаэробной трансформации (табл. 2) и при использовании непермеабили-зованных клеток микроорганизмов в аэробных условиях *
Спектры ЯМР 'Н и !3С записывали в CDC1:) на приборе Bruker АМ-300 (рабочая частота 300 и 75.47 МГц соответственно), внутренний стандарт — остаточный сигнал CHCI3 или ТМС. Удельное вращение полученных продуктов \0]~и измеряли на автоматическом поляриметре «Perkin El тег» 341 при Л = 589 им, температуре 25 °С. Стандартная величина удельного вращения (5)-(+)-5-гексен-2-ола - +15 (jpl.O %, СНС13), (Ю- (-)-5-гексен-2-ола - - 15 (с=1,0 %, СНС13)э.
Дрожжи выращивали на агаризованной картофельно-сахарозной среде (картофель — 90 г; сахароза — 10 г; агар-агар — 15 г; вода — 1 л). Грибы рода Geotrichum выращивали на глицеринсодержащей среде (глицерин — 30 г; дрожжевой экстракт — 10 г; пептон — 5 г; агар-агар — 15 г; вода — 1 л). Питательные среды стерилизовали в автоклаве в течение 30 мин при температуре 120 °С. Выращивание микроорганизмов осуществляли на чашках Петри при температуре 30 °С в течение 72 ч.
Выращенную биомассу микроорганизмов собирали, промывали трижды 0.1 М фосфатным буфером (рН 7.0) и использовали для трансформации в анаэробных условиях. Для получения пермеабилизо ванных клеток отмытую от среды биомассу обрабатывали ацетоном в течение 5 мин, после чего удаляли ацетон центрифугированием. Полученные пермеабилизованные клетки микроорганизмов высушивали при комнатной температуре.
Трансформацию 5-гексен-2-она в анаэробных условиях осуществляли в атмосфере аргона в 0.1 М фосфатном буфере (рН 7,0), содержащем 80 г (асв)/л биомассы микроорганизмов и 5.0 г/л субстрата, при температуре 30 °С, при перемешивании (Í20 об./мин) в течение 24 ч. Трансформацию 5-гексен-2-она пермеабилизо ванными клетками проводили в 0.1М фосфатном буфере (рН 7.0), содержащем 80 г (асв)/л биокатализатора, 0.26 г/л NADPH, 0.4% изопропанола, при температуре 30 "С, при перемешивании (120 об/мин) в течение 24 ч.
Протекание реакции контролировали хро-матографически после удаления из реакционной среды би о катализатор а центрифугированием в течение 10 мин при 9000 об./мин. Использовали хроматограф ЛХМ-8МД с пламенно-ионизационным детектором, колонку 3000 х 3 мм с 5% полиэтиленгликольсебацината на хроматоне N-AW, режим анализа: температура
Врем*. ч
Башкирский химический журнал, 2010. Том 17. JVs 5 35
колонки — 60 0С, температура испарителя — 200 0С, газ-носитель (азот) — 30 мл/мин, водород — 30 мл/мин, воздух — 300 мл/мин.
Выделение 5-гексен-2-ола производили из осветленной центрифугированием реакционной смеси (15 мин при 10000 об./мин). Продукт трансформации высаливали NaCl и троекратно экстрагировали равным объемом ди-этилового эфира. Экстракт осушали над обезвоженным сульфатом натрия и концентрировали на роторно-пленочном испарителе. Непрореа-гировавший субстрат отделяли от целевого продукта на хроматографической колонке с силикагелем Merk 60 (0.063—0.200 мм), элю-ент — гексан: этил ацетат (8:1). 5-гексен-2-ол. Спектр ЯМР 1H, 8, м. д.: 1.11 д (3H, CH3), 1.36-1.55 м (2H, CH2), 1.96-2.16 м (2H, CH2CH=), 2.91 уш. с (1H, OH), 3.66-3.76 м (1H, CHOH), 4.86-4.99 м (2H, CH2=), 5.685.82 м (1H, CH=). Спектр ЯМР 13С, 8, м.д.: 23.07 (С1), 29.88 (C4), 38.00 (C3), 67.06 (C2), 114.32 (C6), 138.33 (C5).
Литература
1. Grassia A., Bruno I., Debitus C., Marzocco S., Pinto A., Gomez- Paloma L., Riccio R. // Tetrahedron.- 2001.- V. 57.- P. 6257
2. Hooper A. M., Dufour S., Willaert S. P., Pickett J. A. // Tetrahedron Lett.- 2007.- V. 48.- P. 5991
3. Conti P., Dallanoce C., Amici M., Micheli C., Carrea G., Zambianchi F. // Tetrahedron: Asymmetry.- 1998.- V. 9.- P. 657
4. Калимуллина Л. Я., Шакиров А. Н., Шах-маев Р. Н., Петухова Н. И., Зорин В. В. // Баш. хим. ж.- 2009.- Т. 16, №4.- С. 74
5. Faber K. Biotransformations in Organic Chemistry / Springer, Berlin, 1997.- 245 p.
6. Зорин В. В., Петухова Н. И. // Панорама современной химии. Успехи органического катализа и химии гетероциклов.- М.: Химия.-2006 г.- С. 280
7. Nakamura K., Matsuda T. // J. Org. Chem.-1998.- V.63.- P. 8957.
8. Nakamura K., Matsuda T. // Tetrahedron.-1998.- V. 54.- P. 8393.
9. Каталог на продукцию фирмы Aldrich [Электронный ресурс]: http://sigma-aldrich.com.
