CC BY
101
УДК 579.66:547.94
А. Н. Шакиров (асп.), Н. И. Петухова (к. биол. н., доц.), В. В. Зорин (чл.-корр. АН РБ, д.х.н., проф., зав. каф.)
Энантиоселективное восстановление карбонилсодержащих соединений с помощью дрожжей Pichiafermentans 87-9
Уфимский государственный нефтяной технический университет, кафедра биохимии и технологии микробиологических производств 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел. (347) 2431935, e-mail: bio@rusoil.net
A. N. Shakirov, N. I. Petukhova, V. V. Zorin
Enantioselective reduction of carbonyl compounds by yeasts Pichiafermentans 87-9
Ufa State Petroleum Technological University 1, Kosmonavtov Str., 450062 Ufa, Russia; ph. (347) 2431935, e-mail: bio@rusoil.net
Исследованы процессы энантиоселективного восстановления ряда предельных, непредельных и жирноароматических карбонилсодержащих соединений в соответствующие 5-спирты высокой оптической чистоты (90—99 % ее) с помощью клеток культуры Pichia fermentans 87-9, достигшей начала стационарной фазы роста. Показано, что в 0.1 М фосфатном буфере (рН 7), содержащем 20% изопропанола, в присутствии биомассы дрожжей наиболее эффективно восстанавливаются непредельные и предельные ке-тоны (Сб и С7). Скорость восстановления кето-нов снижается в ряду: 4-метилпентан-2-он > 5-гексен-2-он > 6-гептен-2-он > гексанон-2 > гептанон-2 > ацетофенон > ундеканон-2 > 4-нитроацетофенон > 4-бромацетофенон ^ 4-хло-рацетофенон.
Ключевые слова: биовосстановление; кетоны; вторичные спирты; микроорганизмы; энантио-селективный биокатализ.
The processes of enantioselective reduction of saturated, unsaturated and alkyl aryl carbonyl compounds into respective S-alcohols of high optical purity (90—99 %) by culture Pichia fermentans 87-9 on stationary phase were studied. It is shown that in 0.1 M phosphate buffer (pH 7) containing 20% isopropanol in the presence of yeasts biomass unsaturated and saturated ketones (Cg and C7) are reduced more effectively. The reduction rate decreases among: 4-methylpentan-2-one > 5-hexen-2-one > 6-hep-ten-2-one > hexanone-2 > heptanone-2 > aceto-phenone > undecanone-2 > 4-nitroacetophenone > 4-bromoacetophenone > 4-chloroacetophenone.
Key words: bioreduction; ketone; secondary alcohols; microorganisms; enantioselective biocatalysis.
Энантиомерно чистые вторичные спирты широко используются в синтезе фармакозна-чимых соединений и экологически безопасных средств защиты растений 1-3. В частности, вторичный спирт (5)-5-гексен-2-ол [(S)-(1)] необходим для синтеза противоракового агента (-)-спонгодипсина 4 и (25, 75)-дибутирокси-нонана — полового феромона оранжевой злаковой галлицы (Sitodiplosis mosellana) 5, (5)-6-гептен-2-ол [(S)-2] служит синтоном спориолида А, проявляющего цитотоксичность к клеткам лимфоидной лейкемии и противогрибковую активность в отношении ряда патогенных грибов (Candida albicans, Cryptococ-cus neoformans, Aspergillus niger, Neurospora
Дата поступления 04.11.13
ета$$а) 6, п-производные (5)-1-фенилэтанола [(5)-3], используются в синтезе в-адренерги-ческих блокаторов 7.
Энантиомерно чистые вторичные спирты могут быть получены из доступных карбонилсодержащих предшественников. Наиболее эффективными являются методы энантиоселек-тивного восстановления кетонов в присутствии клеток микроорганизмов, продуцирующих энантиоселективные оксидоредуктазы, позволяющие получать оптически активные спирты теоретически со 100%-ным выходом 8'9.
Ранее было показано, что фермент-кофер-ментная система, функционирующая в клетках дрожжей Р1еЫа fermentans 87-9, достигших начала стационарной фазы роста, способна
о
я
10 - 13
Ргекга sp. 87-9
Я=С4Н9 (10,14) , /-С4Н9 (13,17), С5Н11 (11,15), С9Н19 (12,16)
ОН
А
я
(Б)-14 - (Б)-17
Схема 1
энантиоселективно восстанавливать ряд непредельных [5-гексен-2-он (4), 6-гептен-2-он (5)] и жирноароматических [ацетофенон (6), 4-хлорацетофенон (7), 4-бромацетофенон (8) и 4-нитроацетофенон (9)] кетонов в соответствующие 5-спирты высокой оптической чистоты (93—99 % ее) в фосфатном буфере, содержащем 20% изопропанола 10-12.
С целью расширения синтетического потенциала созданного биокатализатора в настоящей работе была изучена возможность его использования для энантиоселективного восстановления ряда предельных кетонов нормального и разветвленного строения, а также проведено сравнение его эффективности в процессах трансформации предельных, непредельных и жирноароматических карбонилсо-держащих соединений.
В результате исследования было установлено, что в присутствии клеток культуры Р1ек1а (вттвпЬапв 87-9, достигшей начала стационарной фазы роста в процессе периодического культивирования, происходит энантиосе-лективное восстановление предельных карбо-нилсодержащих соединений, как нормального [гексанон-2 (10), гептанон-2 (11), ундеканон-2 (12)], так и разветвленного строения [4-метил-пентан-2-он (13)] в соответствующие (5)-спир-ты (14-17) (схема 1).
В большинстве случаев энантиомерный избыток продуктов, полученных в течение 24 ч трансформации, достигает 99%, а их выход составляет 84—99 % (табл. 1). Только при восстановлении ундекан-2-она (12) выход продукта оказался невысоким (6—8 % за 24—48 ч реакции). Снижение концентрации субстрата в среде с 5 до 2 г/л увеличивает выход (Б)-унде-кан-2-ола [(Б)-16] до 23% за 48 ч. Энантиомер-ная чистота (5)-ундекан-2-ола [(Б)-16] независимо от концентрации субстрата и времени реакции составляет около 90% ее.
Сравнение начальных скоростей восстановления исследованных предельных (10—13) и непредельных [5-гексен-2-она (4), 6-гептен-2-она (5)] карбонилсодержащих соединений, а также жирноароматических кетонов [ацетофе-нона (6) и 4-нитро-, 4-хлор-, 4-бромацетофено-
нов (7-9)] показало, что наиболее быстро протекает восстановление и 4-метилпентан-2-она (13) и 5-гексен-2-она (4) (рис. 1). В ряду не-разветвленных предельных кетонов увеличение длины углеводородной цепи с 6 до 11 атомов углерода приводит к существенному замедлению начальной скорости реакции. Аналогично восстановление более короткоцепочечного
5-гексен-2-она (4) протекает быстрее, чем его шестиуглеродного гомолога. Непредельные ке-тоны нормального строения [5-гексен-2-он (4),
6-гептен-2-он (5)] имеют более высокие начальные скорости восстановления, чем их предельные аналоги [гексан-2-он (10), гептан-2-он (11)] (рис. 1).
4-Хлорацетофенон 4-Бромацетофенон 4-Нитроацетофенон Ацетофенон
4-Метилпешан-2-он Ундекан-2-он Гептан-2-он Гексан-2-он
6-Гептен-2-он 5-Гексен-2-он
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 Начальная скорость, ммоль/лч
Рис. 1. Начальная скорость восстановления различных кетонов (5 г/л) при 30 оС в 0.1М фосфатном буфере (рН 7), содержащем20% изопропанола, в присутствии биомассы РСЫа fermentans 87-9 (80 г (асв)/л)
Восстановление ароматических карбонильных соединений протекает медленнее, чем короткоцепочечных предельных и непредельных кетонов (рис. 1). Наиболее быстро протекает восстановление ацетофенона (6). Наличие нитрогруппы в п-положении существенно замедляет процесс. Замена нитрогруппы на галоген (хлор или бром) еще более снижает скорость реакции, что делает процесс получения (5)-(—)-1-(4-хлорфенил)этанола [(5)-18] и (5)-(—)-1-(4-бромфенил)этанола [(5)-19] с
Таблица 1
Выход вторичных спиртов и их энантиомерная чистота при восстановлении алифатических кетонов при 30оС в 0.1М фосфатном буфере (рН 7), содержащем 20% изопропанола, в присутствии биомассы (80 г (асв)/л) Р1еИ1а fermentans 87-9
Субстрат Концентрация субстрата, г/л Время, ч Продукт Выход продукта, % Энантиомерный избыток, %
Гексан-2-он (10) 5 1 3 24 (в)-Гексан-2-ол [(S)-14] 80 90 99 99 99 99
Гептан-2-он (11) 5 1 24 (в)-Гептан-2-ол [(S)- 15] 60 84 СП СП СП СП
Ундекан-2-он (12) 2 48 (в)-Ундекан-2-ол [(S)- 16] 23 89
5 24 48 CD 00 9 8 О CD
4-Метил-пентан-2-он (13) 5 1 24 (в)-4-Метилпентан-2-ол [(S)-17] 97 99 СП СП СП СП
помощью трехсуточной биомассы Р1еЫа (втшвпЬат 87-9 малоэффективным.
Таким образом, полученные результаты показывают, что клетки культуры дрожжей Р1еЫа (втшвМат 87-9, достигшей начала стационарной фазы роста, могут быть использованы для получения не только непредельных или жирноароматических спиртов 5-кон-фигурации высокой чистоты, но и энантиомер-но чистых (99% ее) короткоцепочечных предельных спиртов нормального [(5)-гексан-2-ола и (5)-гептан-2-ола (5)-14 и (5)-15] и разветвленного [(5)-4-метилпентан-2-ола (5)-17] строения. Наиболее эффективно восстанавливаются непредельные и предельные кетоны С6—С7-ряда. Скорость восстановления кетонов снижается в ряду: 4-метилпентан-2-он > 5-гек-сен-2-он > 6-гептен-2-он > гексанон-2 > гепта-нон-2 > ацетофенон > ундеканон-2 > 4-нитро-ацетофенон > 4-бромацетофенон > 4-хлораце-тофенон.
Экспериментальная часть
Для наработки биомассы дрожжей Р1еМа (втшвпЬат 87-9 использовали жидкую среду следующего состава (г/л): глицерин — 50; дрожжевой экстракт — 10; пептон — 5; вода водопроводная — 1 л.
Культивирование дрожжей осуществляли глубинным способом в конических колбах на 250 мл, содержащих 50 мл питательной жидкой среды, при температуре 30 оС на орбитальном шейкере в течение 72 ч (до достижения начала стационарной фазы роста).
Выращенную биомассу отделяли от среды центрифугированием в течение 15 мин при 6000 об/мин, трижды промывали 0.1М фос-
фатным буфером (рН 7) и использовали для трансформации.
Биовосстановление кетонов осуществляли в 0.1М фосфатном буфере (рН 7), содержащем биомассу микроорганизмов в количестве 80 г (асв)/л, изопропанол — 20% и субстрат с начальной концентрацией 2—5 г/л. Трансформацию проводили в течение 24 ч при 30 оС при перемешивании на возвратно-поступательном шейкере.
Текущий контроль состава реакционных смесей проводили методом газо-жидкостной хроматографии на хроматографах ЛХМ-8МД (колонка 3000х3мм, 5% полиэтилен-гликольса-бацината на Chromatone N-AW, температуры: колонки 70 оС, испарителя 200 оС; газ носитель азот, расходы: газа-носителя 18—20 мл/мин, водорода 30 мл/мин, воздуха 300 мл/мин) и Хроматек Кристалл 5000.2 (капиллярная колонка Supelco Astec CHIRALDEX B-PM 30м х х0.25мм х 0.12мкм, температуры: колонки 80 оС, испарителя и детектора 190 оС; газ носитель азот, давление газа-носителя 100 кПа, расходы: водорода 30 мл/мин, воздуха 300 мл/ мин), снабженными пламенно-ионизационными детекторами.
Непрореагировавший субстрат и продукты трансформации выделяли из осветленной центрифугированием (в течение 15 мин при 9000 об/мин) и высоленной хлористым натрием реакционной смеси путем трехкратной экстракции диэтиловым эфиром в соотношении 1:1(v/v). Объединенные органические вытяжки сушили над безводным сульфатом натрия и концентрировали, упаривая растворитель на роторно-пленочном испарителе. Спирт от ке-тона отделяли методом колоночной жидкостной хроматографии на силикагеле Merk 60
(0.063—0.200 мм), элюируя смесью растворителей гексан/этилацетат с градиентом (100:0 ^ 50:50).
Идентификацию продуктов реакции осуществляли методами ЯМР. Спектры ЯМР *Н, 13С записаны на приборе Вгикег АМ-300 (рабочая частота 300 МГц для и 75 МГц для 13С). Образцы готовили в стандартных 5 мм ампулах. Концентрация растворов составляла 5—10 %, растворитель — CDCI3, в качестве внутреннего стандарта использовали сигнал тетраметилсилана для ЯМР 1Н и остаточный сигнал хлороформа для ЯМР 13С.
Гексан-2-ол (14): Спектр ЯМР *И в СDCl3, 8, м.д.: 0.86 т (3И, С6И3), 1.25 д (3И, С*И3), 1.28-1.57 м (6И, 3СИ2), 2.56 уш. с (1И, ОИ), 3.68-3.79 м (1И, СИОИ). Спектр ЯМР 13С в СDCl3, 8, м.д.: 13.91 (1С, С6И3), 22.89 (1С, СИ2), 23.33 (1С, С*И3), 28.26 (1С, СИ2), 39.20 (1С, СИ2), 67.52 (1С, СИОИ).
5-Гексен-2-ол (1): Спектр ЯМР *И в СDCl3, 8, м.д.: 1.11 д (3И, СИ3), 1.36-1.55 м (2И, СИ2), 1.96-2.16 м (2И, СИ2СИ=), 2.91 уш. с (1И, ОИ), 3.66-3.76 м (1И, СИОИ), 4.86-4.99 м (2И, СИ2=), 5.68-5.82 м (1И, СИ=). Спектр ЯМР 13С в СDCl3, 8, м.д.: 23.07 (1С, С*И3), 29.88 (1С, СИ2), 38.00 (1С, СИ2), 67.06 (1С, СИОИ), 114.32 (1С, СИ2=), 138.33 (1С, СИ=).
4-Метилпентан-2-ол (17): Спектр ЯМР в СDCl3, 8, м.д.: 0.93 д (6И, 2СИ3), 1.13 д (3И, С*И3), 1.26-1.52 м (2И, СИ2), 1.74-1.87 м (1И, СИ), 2.15 уш. с (1И, ОИ), 3.77-3.84 м (1И, СИОИ). Спектр ЯМР 13С в СDCl3, 8, м.д.: 22.79 (2С, (СИ3)2СИ), 24.06 (1С, С*И3), 24.84 (1С, СИ2), 48.85 (1С, СИ2), 65.35 (1С, СИОИ).
Гептан-2-ол (15): Спектр ЯМР в СDCl3, 8, м.д.: 0.87 т (3И, С7И3), 1.26 д (3И, С!И3), 1.18-1.55 м (8И, 4СИ2), 2.56 уш. с (1И, ОИ), 3.71-3.78 м (1И, СИОИ). Спектр ЯМР 13С в СDCl3, 8, м.д.: 13.96 (1С, С7И3), 22.74 (1С, СИ2), 23.33 (1С, С*И3), 25.76 (1С,
Литература
1. Jurcek O., Wimmerova M., Wimmer Z. // Coordination Chemistry Reviews.— 2008.— V. 252.- P.781.
2. Ghanem A.//Tetrahedron.- 2007.- V.63.- P. 1754.
3. Kurbanoglu E. B., Zilbeyaz K., Kurbanoglu N. I., Kilic H. // Tetrahedron: Asymmetry.- 2007.-V.18.- P.2332.
СИ2), 32.25 (1С, СИ2), 39.50 (1С, СИ2), 67.28 (1С, СИОИ).
6-Гептен-2-ол (2): Спектр ЯМР в СDCl3, 8, м.д.: 1.15 д (3И, СИ3), 1.35-1.53 м (4И, 2СИ2), 1.80 уш. с (1И, ОИ), 2.02-2.10 м (2И, СИ2СИ=), 3.72-3.80 м (1И, СИОИ), 4.91-4.99 м (2И, СИ2=), 5.73-5.82 м (1И, СИ=). Спектр ЯМР 13С в СDCl3, 8, м.д.: 22.10 (1С, С*И3), 25.08 (1С, СИ2), 33.92 (1С, СИ2), 38.91 (1С, СИ2), 67.96 (1С, СИОИ), 114.53 (1С, СИ2=), 138.70 (1С, СИ=).
Ундекан-2-ол (16): Спектр ЯМР *И в СDCl3, 8, м.д.: 0.88 т (3И, СиИ3), 1.17 д (3И, С!И3), 1.23-1.49 м (16И, 8СИ2), 1.91 уш. с (1И, ОИ), 3.72-3.82 м (1И, СИОИ). Спектр ЯМР 13С в СDCl3, 8, м.д.: 13.99 (1С, СиИ3),
22.59 (1С, С10И2), 23.31 (1С, С*И3), 25.71 (1С, С4И2), 29.24 (1С, СИ2), 29.51 (1С, СИ2),
29.60 (2С, 2СИ2), 31.82 (1С, С9И2), 39.28 (1С, С3И2), 67.98 (1С, СИОИ).
1-Фенилэтанол (3): Спектр ЯМР *Н в СDCl3, 8, м.д.: 1.41 д (3И, СН3), 4.80 к (1И, СНОИ), 7.17-7.54 м (5И, Аг). Спектр ЯМР 13С в СDCl3, 8, м.д.: 24.9 (1С, СН3), 70.2 (1С, СНОИ), 125.3 (2С, Аг), 127.3 (1С, Аг), 128.3 (2С, Аг), 145.7 (1С, Аг).
1-(4-Нитрофенил)этанол (20): Спектр ЯМР в СDCl3, 8, м.д.: 1.51 д (3И, СИ3), 5.04 к (1И, СИОИ), 7.87 дд (4И, Аг). Спектр ЯМР 13С в СDCl3, 8, м.д.: 25.5 (1С, СИ3), 69.5 (1С, СИОИ), 123.8 (2С, Аг), 126.1 (2С, Аг), 148.0 (1С, Аг), 152.3 (1С, Аг).
1-(4-Хлорфенил)этанол (18): Спектр ЯМР в СDCl3, 8, м.д.: 1.45 д (3И, СИ3), 4.84 к (1И, СИОИ), 7.3 дд (4И, Аг). Спектр ЯМР 13С в СDCl3, 8, м.д.: 24.9 (1С, СИ3), 69.5 (1С, СИОИ), 126.6 (2С, Аг), 128.4 (2С, Аг), 132.8 (1С, Аг), 144.0 (1С, Аг).
1-(4-Бромфенил)этанол (19): Спектр ЯМР в СDCl3, 8, м.д.: 1.48 д (3И, СИ3), 4.78 к (1И, СИОИ), 7.31 дд (4И, Аг). Спектр ЯМР 13С в СDCl3, 8, м.д.: 25.0 (1С, СИ3), 69.8 (1С, СИОИ), 122.1 (1С, Аг), 128.2 (2С, Аг), 131.2 (2С, Аг), 144.7 (1С, Аг).
References
1. Jurcek O., Wimmerova M., Wimmer Z. Coordination Chemistry Reviews. 2008. V.252. P.781.
2. Ghanem A. Tetrahedron. 2007. V.63. P.1754.
3. Kurbanoglu E. B., Zilbeyaz K., Kurbanoglu N. I., Kilic H. Tetrahedron: Asymmetry. 2007. V.18. P.2332.
4. Grassia A., Bruno I., Debitus C., Marzocco S., Pinto A., Gomez- Paloma L., Riccio R. // Tetrahedron.- 2001.- V.57.- P.6257.
5. Hooper A. M., Dufour S., Willaert S. P., Pickett J. A. // Tetrahedron Lett.- 2007.-V.48.- P.5991.
6. Du Y., Chen Q., J. Linhardt R. // J. Org. Chem.- 2006.- V.71.- P.8446.
7. Vieira G., de Freitas Araujo D., Lemos T., de Mattos M., de Oliveira M., Melo V., de Gonzalo G., Gotor-Fernandez V., Gotor V. // J. Braz. Chem. Soc.- 2010.- V.21, №8.- Р.1509.
8. Зорин В. В., Петухова Н. И. / Панорама современной химии. Успехи органического катализа и химии гетероциклов.- М.: Химия.- 2006.-С.280.
9. Faber K. Biotransformations in Organic Chemistry. Springer, Berlin, 1997.- 245 р.
10. Шакиров А. Н., Дельмухаметов Р. Р., Петухова Н. И., Шахмаев Р. Н., Зорин В. В. // Экол. химия.- 2012.- Т.21, №3.- С.187.
11. Шакиров А. Н., Петухова Н. И., Дельмухаметов Р. Р., Коренева С. В., Зорин В. В. // Баш. хим. ж.- 2012.- Т.19, №2.- С.71.
12. Шакиров А. Н., Петухова Н. И., Зорин В. В. / / Баш. хим. ж.- 2013.- Т.20, №3.- С.20.
4. Grassia A., Bruno I., Debitus C., Marzocco S., Pinto A., Gomez- Paloma L., Riccio R. Tetrahedron. 2001. V.57. P.6257.
5. Hooper A. M., Dufour S., Willaert S. P., Pickett J. A. Tetrahedron Lett. 2007. V.48. P.5991.
6. Du Y., Chen Q., J. Linhardt R. J. Org. Chem. 2006. V.71. P.8446.
7. Vieira G., de Freitas Araujo D., Lemos T., de Mattos M., de Oliveira M., Melo V., de Gonzalo G., Gotor-Fernandez V., Gotor V. J. Braz. Chem. Soc. 2010. V.21, no.8. P.1509.
8. Zorin V.V., Petukhova N.I. Panorama sovre-mennoi khimii. Uspehi organicheskogo kataliza i khimii geterosziklov [Panorama of modern chemistry. Advances of Organic Catalysis and heterocyclic chemistry].— Moscow: Khimiia Publ., 2006. P. 280.
9. Faber K. Biotransformations in Organic Chemistry. Berlin: Springer Publ., 1997. 245 p.
10. Shakirov A. N., Del'mukhametov R. R., Petukhova N. I., Shakhmaev R. N., Zorin V. V. Ekol. khimiia. 2012. V.21, no.3. P.187.
11. Shakirov A. N., Petukhova N. I., Del'mukhametov R. R., Koreneva S. V., Zorin V. V Bash. khim. zh. 2012. V.19, no.2. P.71.
12. Shakirov A. N., Petukhova N. I., Zorin V. V Bash. khim. zh. 2013. V.20, no.3. P.20.
