CC BY
76
УДК 544.473:577.15
А. Н. Шакиров (асп.), Н. И. Петухова (к. биол. н., доц.), Р. Р. Дельмухаметов (студ.), С. В. Коренева (студ.), В. В. Зорин (д.х.н., проф., чл.-корр. АН РБ, зав. каф.)
Микробиологическое энантиоселективное восстановление ацетофенона и его функциональных производных
Уфимский государственный нефтяной технический университет, кафедра биохимии и технологии микробиологических производств 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел. (347)2431935; e-mail: bio@rusoil.net
A. N. Shakirov, N. I. Petukhova, R. R. Delmukhametov, S. V. Koreneva, V. V. Zorin
Microbiological enantioselective reduction of acetophenon and its functional derivatives
Ufa State Petrolium Technological Univercity 1, Kosmonavtov Str., 450062 Ufa, Russia; ph. (347)2431935, e-mail: bio@rusoil.net
Исследован процесс восстановления ароматических кетонов (ацетофенона, и-хлорацетофе-нона, и-метоксиацетофенона) с помощью дрожжей. Показано, что в аэробных условиях при 30 оС в 0.1 М фосфатном буфере (рН 7) в присутствии экзогенного восстановителя (изопро-панола) клетки дрожжей трансформируют аце-тофенон и и-хлорацетофенон энантиоселективно с образованием (5)-1-фенилэтанола (99% ее) и (5)-1-(4-хлорфенил)этанола (97% ее) в течение 48 ч. При использовании и-метоксиацетофенона в качестве субстрата исследуемый биокатализатор не проявлял восстанавливающей активности.
Ключевые слова: ацетофенон; биовосстановление кетонов; энантиоселективный биокатализ; и-хлорацетофенон; (5)-1-фенилэтанол; (5)-1-(4-хлорфенил)этанол.
Энантиомерно чистые ароматические спирты являются важными синтонами в получении ряда лекарственных соединений 1-5. В частности, энантиомеры 1-фенилэтанола могут быть использованы в синтезе консервантов для глазных капель и ингибитора кишечной абсорбции холестерина 3. (5)-1-(4-метоксифенил)-этанол (£-3Ь) является ключевым синтоном в синтезе циклоалкил[Ь]индолов, использующихся при лечении аллергических реакций 1'2.
Перспективным подходом к получению энантиомеров 1-фенилэтанола и его функционально замещенных аналогов является биовосстановление прохиральных предшественников (ацетофенона и его производных) с помощью клеток микроорганизмов в присутствии доступных экзогенных восстановителей (глюкозы, изопропанола, циклогексанона и др.) 6-10.
Дата поступления 05.05.12
The reduction of aromatic ketones (acetophenone, p-chloroacetophenone, p-methoxyacetophenone) by yeasts was searched. It has been shown that under aerobic conditions at 30 oC in 0.1 M phosphate buffer (pH 7) in presence of exogenic reducing agent (isopropanol) yeasts cells enantioselectively transforms acetophenone and p-chloroacetophenone producing (S)-phenyl-ethanol (99% ee) and (S)-1-(4-chlorophenyl)-ethanol (97% ee) respectively after 48 hours of transformation. The searched biocatalyst didn't show any reducing activity with p-methoxy-acetophenone as substrate.
Key words: enantioselective biocatalysis; bio-reduction of ketones; acetophenone; p-chloro-acetophenone; (S)-l-phenylethanol; (5)-1-(4-chlorophenyl)ethanol.
В отличие от ассиметрического восстановления кетонов химическими методами, связаными с использованием дорогих реагентов или метал-локомплексных катализаторов, методы биовосстановления менее затратны и более экологичны.
С целью поиска эффективного биокатализатора восстановления ароматических кетонов в настоящей работе исследованы процессы восстановления ацетофенона (1а), «-хлорацетофенона (1b) и n-метоксиацетофенона (1c) с помощью клеток дрожжей (культура 87-9) из коллекции кафедры биохимии и технологии микробиологических производств Уфимского государственного нефтяного технического университета.
Трансформацию кетонов осуществляли в аэробных условиях при температуре 30 оС в 0.1 М фосфатном буфере (рН 7), содержащем 5 г/л субстрата и 80 г(асв)/л трехсуточной
1a;1b
O
OH
CH3
CH3
NAD(P)H дрожжи 87-9
R'
NADP+ (S)-2a; (S)-2b OH
R = H (a); R = Cl (b)
биомассы дрожжей. В качестве экзогенного восстановителя, необходимого для регенерации внутриклеточных коферментов микроорганизмов (NADH или NADPH) 11-13, использовали изопропанол, который вносили в реакционную смесь в концентрации 15%.
В результате исследования трансформации п-метоксиацетофенона в течение 96 ч было обнаружено, что дрожжи не способны восстанавливать это соединение (табл. 1). В то же время при использовании п-хлорацетофенона и ацетофенона было установлено, что дрожжи активно катализируют восстановление субстратов в соответствующие спирты с конверсией на уровне 40 и 87 %, соответственно, в течение 48 ч трансформации.
Исследование продуктов трансформации кетонов 1а и 2а в присутствии клеток дрожжей (культура 87-9) и изопропанола показало, что восстановление ацетофенона и п-хлорацетофе-нона протекает энантиоселективно с образованием S-1-фенилэтанола (S-2a) и S-144-хлор-фенил)этанола (S-2b) высокой оптической чистоты (табл.).
Таким образом, найден новый перспективный энантиоселективный биокатализатор для хемо-энзиматического синтеза фармакозначи-мых соединений на основе ацетофенона и его производных.
Экспериментальная часть
Спектры ЯМР и С записывали в CDCl3 на приборе Bruker АМ-300 (рабочая частота 300 и 75.47 МГц соответственно), внутренний стандарт — остаточный сигнал CHCl3 или ТМС. Конфигурацию продуктов трансформации определяли на поляриметре «Optical Activity Limited» Model AA-55. Стандартная величина удельного вращения (S)-(-)-1-фенилэтанола [a]25 -57 (с 5.12, CHCl3)14, ^)-1-(4-хлорфенил)-этанола [a]D25 - 49 (c 1.84, Et2O)5
Биовосстановление осуществляли при 30 оС в 0.1М фосфатном буфере (рН 7), содержащем изопропанол — 15%, биомассу микроорганизмов — 80 г (асв)/л и субстрат — 5 г/л, при перемешивании в течение 2—4 сут. Биомассу микроорганизмов для трансформации получали, как описано ранее 15. Выделение продуктов трансформации осуществляли из осветленной центрифугированием реакционной смеси (15 мин при 5000 об/мин). Продукт трансформации высаливали с помощью NaCl и троекратно экстрагировали равным объемом диэти-лового эфира. Экстракт осушали над обезвоженным сульфатом магния и концентрировали на роторно-пленочном испарителе. Непрореа-гировавший субстрат отделяли от целевого продукта на хроматографической колонке с силикагелем Merk 60 (0.063—0.200 мм), элю-ент — гексан:этилацетат (8:1).
Текущий контроль концентрации субстрата и продукта в пробах, предварительно осветленных центрифугированием (10 мин при 5000 об/мин), осуществляли на хроматографе «Хроматек Кристалл 5000.2» с пламенно-ионизационным детектором на хираль-ной капиллярной колонке Supelco BetaDEX 110 (30 м х 0.25 мм х 0.25 мкм). Режим анализа: температура испарителя — 220 оС, температура детектора — 220 оС, температура колонки — 100—220 оС, скорость нагрева — 5 оС/мин, давление газа-носителя 100 кПа, расход водорода 25 мл/мин, расход воздуха 250 мл/мин, газ-носитель — азот).
В качестве стандартных образцов использовали рацемические смеси 1-фенилэта-нола, 1-(4-хлорфенил)этанола и 1-(4-метокси-фенил)-этанола, полученные встречным синтезом путем восстановления ацетофенона и его производных борогидридом натрия.
1-Фенилэтанол (2а). Спектр ЯМР в СDCl3 (8, м.д.): 1.41 д (3H, СН3), 4.80 к (1H, СН-O), 7.17-7.54 м (5H, С6Н5). Спектр 13С ЯМР в СDCl3 (8, м.д.): 24.9 (1C, СН3),
R
O
Восстановление ароматических кетонов дрожжами (культура 87-9)
Условия: 0.1 М фосфатный буфер (рН 7), содержащий 15 % изопропанола; 5 г/л субстрата; 80 г(асв)/л биомассы; 30 оС; перемешивание
Таблица
* конверсия определена методом ГЖХ; ** энантиомерный избыток определен методом ГЖХ, конфигурация продуктов установлена путем сравнения значений удельного вращения с литературными данными
Субстрат
Время, ч
Конверсия
%
Продукт
Энантиомерный избыток**, % ее
O
CH3
48
1а
OH
87
CH3
99 (S)
O
CH3
48
Cl'
1b
OH
40
CH3
СГ
(S)-2b
97 (S)
O
CH3
H3CO'
48
96
1c
0
0
70.2(1С, СН-О), 125.3 (2С, С6Н5), 127.3 (1С, C6Hs), 128.3 (2С, QH5), 145.7 (1С, QH5).
1-(4-Хлорфенил)этанол (2b). Спектр *Н ЯМР в CDCl3 (8, м.д.): 1.45 д (3H, CH3), 4.84 к (1H, CH-O), 7.3 дд (4H, Ar). Спектр 13С ЯМР в СDCl3 (8, м.д.): 24.9 (1C, CH3), 69.5 (1C, CH-O), 126.6 (2C, Ar), 128.4 (2C, Ar), 132.8 (1C, Ar), 144.0 (1C, Ar).
1-(4-Метоксифенил)этанол (2c). Спектр ЯМР *H, 8, м. д.: 1.45 д (3H, CH3), 3.79 с (3H, CH3O), 4.81 к (1H, CH-O), 7.08 дд (4H, Ar). Спектр ЯМР 13С, 8, м.д.: 24.83 (1C, ОТ3), 54.96 (1C, CH3O), 69.46 (1C, CH-O), 113.51 (2C, Ar), 126.48 (2C, Ar), 137.98 (1C, Ar), 158.55 (1C, Ar).
Литература
1. Hillier C., Marcoux J. F., Zhao D. L., Grabowski E.J. J., Mckeown A. E., Tillyer R. D. // J. Org. Chem.- 2005.- V. 70.- P. 8385.
2. Hillier C., Desrosiers J. N., Marcoux J. F., Grabowski E.J.J. // Org. Lett.- 2004.- V.6.-P. 573.
3. Vieira G., de Freitas Araujo D., Lemos T., de Mattos M., de Oliveira M., Melo V., de Gonzalo G., Gotor-Fernandez V., Gotor V. // J. Braz. Chem. Soc.- 2010.- V.21, №8.- Р. 1509.
4. Barros-Filho B. A., de Oliveira M., Lemos T., de Mattos M., de Gonzalo G., Gotor-Fernandez V., Gotor V. // Tetrahedron: Asymmetry.- 2009.-V.20.- P. 1057.
5. Wei Yang, Jian-He Xu, Yan Xie, Yi Xu, Gang Zhao, Guo-Qiang Lin // Tetrahedron: Asymmetry.- 2006.- V. 17.- P. 1769.
6. Nakamura K., Matsuda T. // J. Org. Chem.-1998.- V. 63.- P. 8957.
7. Wendlausen R., Moran P.J.S., Joekes I., Rodrigues J.A.R. // J. Mol. Catal. B: Enzymatic.- 1998.- V. 5.- P. 69.
8. Wang W., Zong M.-H., Lou W.-Yo. // J. Mol. Catal. B: Enzym.- 2009.- V. 56.- P. 70.
9. Шакиров А. Н., Василова Л. Я., Петухова Н. И., Зорин В. В. // Баш. хим. ж.- 2011.- Т.18, №4.- С. 38.
10. Qing Xie, Jianping Wu, Gang Xu, and Lirong Yang // Biotechnol. Prog.- 2006.- V.22.-P. 1301.
11. Faber K. Biotransformations in Organic Chemistry.- Berlin: Springer, 1997.- 245 р.
12. Зорин В. В., Петухова Н. И. Клетки микроорганизмов как катализаторы в энантиоселектив-ной трансформации органических соединений // Панорама современной химии. Успехи органического катализа и химии гетероциклов.- М.: Химия, 2006.- С.280.
13. Зорин В. В., Петухова Н. И., Шахмаев Р. Н. // Российский хим. журнал. ЖВХО им. Д. И. Менделеева, 2011.- V.55, №1.- С. 77.
14. Каталог на продукцию фирмы Aldrich [Электронный ресурс]: http://sigma-aldrich.com.
15. Василова Л. Я., Зорин В. В., Петухова Н. И., Шакиров А. Н. // Баш. хим. ж.- 2010.- Т.17, №5.- С.32.
