CC BY
72
УДК 544.473:577.15
А. Н. Шакиров (асп.), Н. И. Петухова (к. биол. н., доц.), Р. Р. Дельмухаметов (студ.), С. В. Коренева (студ.), В. В. Зорин (д.х.н., проф., чл.-корр. АН РБ, зав. каф.)
Микробиологическое энантиоселективное восстановление ацетофенона и его функциональных производных
Уфимский государственный нефтяной технический университет, кафедра биохимии и технологии микробиологических производств 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел. (347)2431935; e-mail: [email protected]
A. N. Shakirov, N. I. Petukhova, R. R. Delmukhametov, S. V. Koreneva, V. V. Zorin
Microbiological enantioselective reduction of acetophenon and its functional derivatives
Ufa State Petrolium Technological Univercity 1, Kosmonavtov Str., 450062 Ufa, Russia; ph. (347)2431935, e-mail: [email protected]
Исследован процесс восстановления ароматических кетонов (ацетофенона, и-хлорацетофе-нона, и-метоксиацетофенона) с помощью дрожжей. Показано, что в аэробных условиях при 30 оС в 0.1 М фосфатном буфере (рН 7) в присутствии экзогенного восстановителя (изопро-панола) клетки дрожжей трансформируют аце-тофенон и и-хлорацетофенон энантиоселективно с образованием (5)-1-фенилэтанола (99% ее) и (5)-1-(4-хлорфенил)этанола (97% ее) в течение 48 ч. При использовании и-метоксиацетофенона в качестве субстрата исследуемый биокатализатор не проявлял восстанавливающей активности.
Ключевые слова: ацетофенон; биовосстановление кетонов; энантиоселективный биокатализ; и-хлорацетофенон; (5)-1-фенилэтанол; (5)-1-(4-хлорфенил)этанол.
Энантиомерно чистые ароматические спирты являются важными синтонами в получении ряда лекарственных соединений 1-5. В частности, энантиомеры 1-фенилэтанола могут быть использованы в синтезе консервантов для глазных капель и ингибитора кишечной абсорбции холестерина 3. (5)-1-(4-метоксифенил)-этанол (£-3Ь) является ключевым синтоном в синтезе циклоалкил[Ь]индолов, использующихся при лечении аллергических реакций 1'2.
Перспективным подходом к получению энантиомеров 1-фенилэтанола и его функционально замещенных аналогов является биовосстановление прохиральных предшественников (ацетофенона и его производных) с помощью клеток микроорганизмов в присутствии доступных экзогенных восстановителей (глюкозы, изопропанола, циклогексанона и др.) 6-10.
Дата поступления 05.05.12
The reduction of aromatic ketones (acetophenone, p-chloroacetophenone, p-methoxyacetophenone) by yeasts was searched. It has been shown that under aerobic conditions at 30 oC in 0.1 M phosphate buffer (pH 7) in presence of exogenic reducing agent (isopropanol) yeasts cells enantioselectively transforms acetophenone and p-chloroacetophenone producing (S)-phenyl-ethanol (99% ee) and (S)-1-(4-chlorophenyl)-ethanol (97% ee) respectively after 48 hours of transformation. The searched biocatalyst didn't show any reducing activity with p-methoxy-acetophenone as substrate.
Key words: enantioselective biocatalysis; bio-reduction of ketones; acetophenone; p-chloro-acetophenone; (S)-l-phenylethanol; (5)-1-(4-chlorophenyl)ethanol.
В отличие от ассиметрического восстановления кетонов химическими методами, связаными с использованием дорогих реагентов или метал-локомплексных катализаторов, методы биовосстановления менее затратны и более экологичны.
С целью поиска эффективного биокатализатора восстановления ароматических кетонов в настоящей работе исследованы процессы восстановления ацетофенона (1а), «-хлорацетофенона (1b) и n-метоксиацетофенона (1c) с помощью клеток дрожжей (культура 87-9) из коллекции кафедры биохимии и технологии микробиологических производств Уфимского государственного нефтяного технического университета.
Трансформацию кетонов осуществляли в аэробных условиях при температуре 30 оС в 0.1 М фосфатном буфере (рН 7), содержащем 5 г/л субстрата и 80 г(асв)/л трехсуточной
1a;1b
O
OH
CH3
CH3
NAD(P)H дрожжи 87-9
R'
NADP+ (S)-2a; (S)-2b OH
R = H (a); R = Cl (b)
биомассы дрожжей. В качестве экзогенного восстановителя, необходимого для регенерации внутриклеточных коферментов микроорганизмов (NADH или NADPH) 11-13, использовали изопропанол, который вносили в реакционную смесь в концентрации 15%.
В результате исследования трансформации п-метоксиацетофенона в течение 96 ч было обнаружено, что дрожжи не способны восстанавливать это соединение (табл. 1). В то же время при использовании п-хлорацетофенона и ацетофенона было установлено, что дрожжи активно катализируют восстановление субстратов в соответствующие спирты с конверсией на уровне 40 и 87 %, соответственно, в течение 48 ч трансформации.
Исследование продуктов трансформации кетонов 1а и 2а в присутствии клеток дрожжей (культура 87-9) и изопропанола показало, что восстановление ацетофенона и п-хлорацетофе-нона протекает энантиоселективно с образованием S-1-фенилэтанола (S-2a) и S-144-хлор-фенил)этанола (S-2b) высокой оптической чистоты (табл.).
Таким образом, найден новый перспективный энантиоселективный биокатализатор для хемо-энзиматического синтеза фармакозначи-мых соединений на основе ацетофенона и его производных.
Экспериментальная часть
Спектры ЯМР и С записывали в CDCl3 на приборе Bruker АМ-300 (рабочая частота 300 и 75.47 МГц соответственно), внутренний стандарт — остаточный сигнал CHCl3 или ТМС. Конфигурацию продуктов трансформации определяли на поляриметре «Optical Activity Limited» Model AA-55. Стандартная величина удельного вращения (S)-(-)-1-фенилэтанола [a]25 -57 (с 5.12, CHCl3)14, ^)-1-(4-хлорфенил)-этанола [a]D25 - 49 (c 1.84, Et2O)5
Биовосстановление осуществляли при 30 оС в 0.1М фосфатном буфере (рН 7), содержащем изопропанол — 15%, биомассу микроорганизмов — 80 г (асв)/л и субстрат — 5 г/л, при перемешивании в течение 2—4 сут. Биомассу микроорганизмов для трансформации получали, как описано ранее 15. Выделение продуктов трансформации осуществляли из осветленной центрифугированием реакционной смеси (15 мин при 5000 об/мин). Продукт трансформации высаливали с помощью NaCl и троекратно экстрагировали равным объемом диэти-лового эфира. Экстракт осушали над обезвоженным сульфатом магния и концентрировали на роторно-пленочном испарителе. Непрореа-гировавший субстрат отделяли от целевого продукта на хроматографической колонке с силикагелем Merk 60 (0.063—0.200 мм), элю-ент — гексан:этилацетат (8:1).
Текущий контроль концентрации субстрата и продукта в пробах, предварительно осветленных центрифугированием (10 мин при 5000 об/мин), осуществляли на хроматографе «Хроматек Кристалл 5000.2» с пламенно-ионизационным детектором на хираль-ной капиллярной колонке Supelco BetaDEX 110 (30 м х 0.25 мм х 0.25 мкм). Режим анализа: температура испарителя — 220 оС, температура детектора — 220 оС, температура колонки — 100—220 оС, скорость нагрева — 5 оС/мин, давление газа-носителя 100 кПа, расход водорода 25 мл/мин, расход воздуха 250 мл/мин, газ-носитель — азот).
В качестве стандартных образцов использовали рацемические смеси 1-фенилэта-нола, 1-(4-хлорфенил)этанола и 1-(4-метокси-фенил)-этанола, полученные встречным синтезом путем восстановления ацетофенона и его производных борогидридом натрия.
1-Фенилэтанол (2а). Спектр ЯМР в СDCl3 (8, м.д.): 1.41 д (3H, СН3), 4.80 к (1H, СН-O), 7.17-7.54 м (5H, С6Н5). Спектр 13С ЯМР в СDCl3 (8, м.д.): 24.9 (1C, СН3),
R
O
Восстановление ароматических кетонов дрожжами (культура 87-9)
Условия: 0.1 М фосфатный буфер (рН 7), содержащий 15 % изопропанола; 5 г/л субстрата; 80 г(асв)/л биомассы; 30 оС; перемешивание
Таблица
* конверсия определена методом ГЖХ; ** энантиомерный избыток определен методом ГЖХ, конфигурация продуктов установлена путем сравнения значений удельного вращения с литературными данными
Субстрат
Время, ч
Конверсия
%
Продукт
Энантиомерный избыток**, % ее
O
CH3
48
1а
OH
87
CH3
99 (S)
O
CH3
48
Cl'
1b
OH
40
CH3
СГ
(S)-2b
97 (S)
O
CH3
H3CO'
48
96
1c
0
0
70.2(1С, СН-О), 125.3 (2С, С6Н5), 127.3 (1С, C6Hs), 128.3 (2С, QH5), 145.7 (1С, QH5).
1-(4-Хлорфенил)этанол (2b). Спектр *Н ЯМР в CDCl3 (8, м.д.): 1.45 д (3H, CH3), 4.84 к (1H, CH-O), 7.3 дд (4H, Ar). Спектр 13С ЯМР в СDCl3 (8, м.д.): 24.9 (1C, CH3), 69.5 (1C, CH-O), 126.6 (2C, Ar), 128.4 (2C, Ar), 132.8 (1C, Ar), 144.0 (1C, Ar).
1-(4-Метоксифенил)этанол (2c). Спектр ЯМР *H, 8, м. д.: 1.45 д (3H, CH3), 3.79 с (3H, CH3O), 4.81 к (1H, CH-O), 7.08 дд (4H, Ar). Спектр ЯМР 13С, 8, м.д.: 24.83 (1C, ОТ3), 54.96 (1C, CH3O), 69.46 (1C, CH-O), 113.51 (2C, Ar), 126.48 (2C, Ar), 137.98 (1C, Ar), 158.55 (1C, Ar).
Литература
1. Hillier C., Marcoux J. F., Zhao D. L., Grabowski E.J. J., Mckeown A. E., Tillyer R. D. // J. Org. Chem.- 2005.- V. 70.- P. 8385.
2. Hillier C., Desrosiers J. N., Marcoux J. F., Grabowski E.J.J. // Org. Lett.- 2004.- V.6.-P. 573.
3. Vieira G., de Freitas Araujo D., Lemos T., de Mattos M., de Oliveira M., Melo V., de Gonzalo G., Gotor-Fernandez V., Gotor V. // J. Braz. Chem. Soc.- 2010.- V.21, №8.- Р. 1509.
4. Barros-Filho B. A., de Oliveira M., Lemos T., de Mattos M., de Gonzalo G., Gotor-Fernandez V., Gotor V. // Tetrahedron: Asymmetry.- 2009.-V.20.- P. 1057.
5. Wei Yang, Jian-He Xu, Yan Xie, Yi Xu, Gang Zhao, Guo-Qiang Lin // Tetrahedron: Asymmetry.- 2006.- V. 17.- P. 1769.
6. Nakamura K., Matsuda T. // J. Org. Chem.-1998.- V. 63.- P. 8957.
7. Wendlausen R., Moran P.J.S., Joekes I., Rodrigues J.A.R. // J. Mol. Catal. B: Enzymatic.- 1998.- V. 5.- P. 69.
8. Wang W., Zong M.-H., Lou W.-Yo. // J. Mol. Catal. B: Enzym.- 2009.- V. 56.- P. 70.
9. Шакиров А. Н., Василова Л. Я., Петухова Н. И., Зорин В. В. // Баш. хим. ж.- 2011.- Т.18, №4.- С. 38.
10. Qing Xie, Jianping Wu, Gang Xu, and Lirong Yang // Biotechnol. Prog.- 2006.- V.22.-P. 1301.
11. Faber K. Biotransformations in Organic Chemistry.- Berlin: Springer, 1997.- 245 р.
12. Зорин В. В., Петухова Н. И. Клетки микроорганизмов как катализаторы в энантиоселектив-ной трансформации органических соединений // Панорама современной химии. Успехи органического катализа и химии гетероциклов.- М.: Химия, 2006.- С.280.
13. Зорин В. В., Петухова Н. И., Шахмаев Р. Н. // Российский хим. журнал. ЖВХО им. Д. И. Менделеева, 2011.- V.55, №1.- С. 77.
14. Каталог на продукцию фирмы Aldrich [Электронный ресурс]: http://sigma-aldrich.com.
15. Василова Л. Я., Зорин В. В., Петухова Н. И., Шакиров А. Н. // Баш. хим. ж.- 2010.- Т.17, №5.- С.32.
