CC BY
39
УДК 579.66:547.94
Л. Я. Калимуллина (к. техн. н, доц.), А. Н. Шакиров (студ.), Р. Н. Шахмаев (к.х.н., доц.), Н. И. Петухова (к. биол. н., доц.), В. В. Зорин (чл.-корр. АН РБ, д.х.н., проф., зав. каф.)
Скрининг биокатализаторов для энантиоселективного восстановления 5-гексен-2-она
Уфимский государственный нефтяной технический университет, кафедра биохимии и технологии микробиологических производств 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел. (347) 2431935, e-mail: bio@rusoil.net
L. Ya. Kalimullina, A. N. Shakirov, R. N. Shahmaev, N. I. Petukhova, V. V. Zorin
Screening of biocatalyst for enantioselective reduction of 5-hexen-2-one
Ufa State Petroleum Technical University 1, Kosmonavtov Str., 450062 Ufa, Russia; рh. (3472) 431935; е-mail: bio@rusoil.net
Осуществлен скрининг микроорганизмов, способных восстанавливать 5-гексен-2-он. Найдены штаммы дрожжей, энантиоселективно трансформирующие 5-гексен-2-он с образованием (5)-5-гексен-2-ола, и грибов, образующих преимущественно (_К)-5-гексен-2-ол, с выходом 78-98 %.
Ключевые слова: биовосстановление; 5-гек-сен-2-ол; 5-гексен-2-он; микроорганизмы; энан-тиоселективный биокатализ.
Оптически активные вторичные спирты (5)-5-гексен-2-ол и (^)-5-гексен-2-ол являются синтонами ряда низкомолекулярных биорегуляторов. Так, (5)-5-гексен-2-ол является ключевым синтоном (-)-спонгодипсина — противоопухолевого препарата, проявляющего высокую цитотоксическую и антипролиферативную активность в отношении раковых клеточных линий J774.A1, НЕК-293 и WEHI-164 1, а также служит предшественником (25,75 )-дибути-роксинонана — полового феромона злаковой галлицы (5Иой1р1о$1$ то..е11апа) 2.
OH
(8)-5-гексен-2-ол
(-)-спонгидепсин
O
(28,78)-дибутироксинонан
Дата поступления 08.12.09
Screening of microorganisms that are able to reduce 5-hexen-2-one was carried out. Strains of yeast for enantioselective transformation of 5-hexen-2-one to (S)-5-hexen-2-ol and strains of fungi producing predominantly (R)- 5-hexen-2-one to with yields 78—98 % were found.
Key words: bioreduction; 5-hexen-2-ol; 5-hexen-2-one; microorganisms; enantioselective biocatalysts.
(^)-5-Гексен-2-ол применяется в синтезе дезоксимускарина — широко используемого мускариноподобного агониста 3.
Перспективным подходом к получению энантиомерно чистых (5)- и (^)-5-гексен-2-олов является биовосстановление их прохи-рального предшественника (5-гексен-2-она) с помощью клеток дрожжей или грибов.
В настоящей работе осуществлен поиск потенциальных биокатализаторов среди культур дрожжей и грибов из коллекции кафедры биохимии и технологии микробиологических производств Уфимского государственного нефтяного технического университета.
В результате исследования были обнаружены 22 штамма, способные трансформировать 5-гексен-2-он в 5-гексен-2-ол с конверсией более 50% в следующих (стандартных) условиях реакции: 0.1 М фосфатный буфер, рН 7.0; субстрат — 5 г/л; биокатализатор — 80 г (асв)/л; аэробные условия, температура 30—32 оС, время реакции — 24 ч (табл. 1).
Наиболее высокий выход продукта (78—98 %) был достигнут при использовании грибов рода Geotrichum (85-1, 85-2, 85-3, 85-4, 85-5, 85-7) и дрожжей Candida sake 777, Candida sp. 81-12, Metschnikowia sp. 84-13 и Hansenula sp. 87-3.
Таблица 1 Трансформация 5-гексен-2-она клетками микроорганизмов
Микроорганизм Конверсия, % Выход 5-гексен-2-ола, %
ОвоМсНит эр. 85-1 95 88
ОвоМсНит эр. 85-2 93 97
ОвоМсНит эр. 85-3 96 98
ОвоМсНит эр. 85-4 98 92
ОвоМсН/ит эр. 85-5 97 95
ОвоМсН/ит эр. 85-6 93 78
ОвоМсН/ит эр. 85-7 97 92
Сапб1бэ эакв 777 94 87
Cаndidа эр. 81-12 100 96
Сапб1ба guillвrmondii 80-7 74 66
Мв1эсНт'1кот'1а эр. 84-13 100 96
БассЬаготусвэ cвrвviэiaв 87-2 72 71
Напэвпи1а эр. 87-3 94 93
РШа эр. 87-1 56 37
Rhodotorula эр. 87-4 83 77
Диз 2/1 98 70
Диз 14/1 98 68
Диз 5/3 100 71
Диз У32 95 56
9/2 96 65
7/3 98 66
Р-1 78 40
5 -г-
3 -
я в о
И
12
Время, ч
16
20
24
- ОеоМокыт sp. 85-1 -Натепыйа sp. 87-3 -Metsокnikowia sp. 84-13
- ОеоМокыт sp. 85-3
- ОеоМокыт sp. 85-5
- Сап^с1а sake 777 -Сап^с1а sp. 81-12
- ОеоМокыт sp. 85-2
- ОеоМокыт sp. 85-4 -ОеоМокыт sp. 85-7
Условия реакции: 0.1 М фосфатный буфер рН 7.0; 80 г (асв)/л; 5 г/л субстрата; 30 оС Рис. 1. Кинетика накопления 5-гексен-2-ола при трансформации 5-гексен-2-она наиболее активными культурами микроорганизмов
4
2
0
0
4
8
а
Исследование кинетики восстановления 5-гексен-2-она этими культурами микроорганизмов показало, что большая часть продукта накапливается в реакционной смеси в течение 5—12 ч трансформации (рис. 1).
При исследовании оптических свойств продуктов трансформации было обнаружено, что дрожжевые культуры восстанавливают субстрат преимущественно в (5)-5-гексен-2-ол, тогда как грибы рода ОвоЬпеНит накапливают в реакционных смесях в основном (,К)-5-гек-сен-2-ол (табл. 2).
Таким образом, найдены биокатализаторы, способные энантиоселективно восстанавливать 5-гексен-2-он. Однако, оптическая чистота продуктов трансформации оказалась низкой, что может быть связано с наличием в клетках нескольких ферментов противоположной энантионаправленности, проявляющих карбонилредуктазную активность в отношении 5-гексен-2-она. Это обуславливает необходимость дальнейшей оптимизации условий трансформации и поиска способов подавления активности ферментов, катализирующих побочные реакции 5.
Таблица 2 Оптические свойства продуктов восстановления 5-гексен-2-она культурами микроорганизмов
Микроорганизм № (конфигурация) Оптическая чистота, % ее
Овotrichum эр. 85-1 - 0.7 4.7
Овotrichum эр. 85-2 - 0.9 6.0
Овotrichum эр. 85-3 - 2.0 13.3
Овotrichum эр. 85-4 - 2.0 13.3
Овotrichum эр. 85-5 - 1.0 6.7
Овotrichum эр. 85-7 - 0.2 1.3
Candida эакв 777 + 2.3 (Б) 15.3
Candida эр. 81-12 + 1.5 (Б) 10.0
Mвtэchnikowia эр. 84-13 + 1.1 (Б) 7.3
Hanэвnula эр. 87-3 + 1.7 (Б) 11.3
* Стандартная величина удельного вращения (Б)~ (+)-5-гексен-2-ола [а]2£ +15 (с = 1.0%, СНС13), (Я)-(-)-5-гексен-2-ола - 15 (с = 1.0%, СНС13) 4
Материалы и методы
Синтез 5-гексен-2-она. К раствору 13.0 г (0.1 моль) этилацетоацетата в 30 мл безводного этанола осторожно прибавляли 2.3 г (0.1 моль) натрия, затем смесь охлаждали до 0 оС и прикапывали при перемешивании в течении 20 мин 12.1 г (0.1 моль) аллилброми-да. Реакционную смесь выдерживали 3 ч при комнатной температуре и 4 ч при 60 оС (при этом образуется осадок бромида натрия). Осадок отфильтровывали, этиловый спирт отгоняли в вакууме и к остатку прибавляли 40 мл 10% NaOH. Смесь перемешивали 2 ч при комнатной температуре и 3 ч при 60 оС, охлаждали, подкисляли концентрированной HCl до pH 4 и экстрагировали эфиром (3 х 20 мл). Объединенные органические фазы промывали 30 мл насыщенного раствора NaHCO3, затем 30 мл воды и сушили над Na2SO4. Растворитель отгоняли и остаток перегоняли 6. Выход 7.38 г (75%) 5-гексен-2-она, т. кип. 129 оС. ИК спектр, v, см-1: 3080, 3001, 2980, 2920, 1717 (C=O), 1641 (С=С), 1414, 1362, 1231, 1163, 997, 914. Спектр ЯМР *H, 5, м. д.: 1.89 с (3H, CH3), 2.06 м (2H, CH2CH=), 2.29 т (2H, CH2C=O), 4.69-4.80 м (2H, CH2=), 5.49-5.62 м (1H, CH=). Спектр ЯМР 13С, 5, м.д.: 27.28 (С4), 29.34 (C1), 42.13 (C3), 114.64 (C6), 136.59 (C5), 207.54 (C2).
Биотрансформация 5-гексен-2-она. Дрожжи выращивали на агаризованной карто-фельно-сахарозной среде следующего состава (г/л): картофель — 90; сахароза — 10; агар-агар — 15; вода водопроводная — 1 л. Грибы рода Geotrichum выращивали на комплексной среде следующего состава (г/л): глицерин — 30; дрожжевой экстракт - 10; пептон - 5; агар-агар — 15; вода водопроводная — 1 л. Питательные среды стерилизовали в автоклаве в течение 30 мин при температуре 120 оС. Выращивание микроорганизмов осуществляли на чашках Петри при температуре 30 оС в течение 72 ч.
Выращенную биомассу микроорганизмов культуру собирали, промывали трижды 0.1 М фосфатным буфером (рН 7.0) и использовали для трансформации. Трансформацию 5-гек-сен-2-она осуществляли в течение 2 сут в 0.1 М фосфатном буфере (рН 7.0), содержа-
щем биомассу — 80 г (асв)/л и субстрат — 5.0 г/л, при температуре 30—32 оС, при перемешивании.
Изменение концентрации субстрата и продукта трансформации определяли в предварительно осветленных центрифугированием в течение 15 мин (при 5000 об/мин.) пробах. Концентрации веществ оценивали на хроматографе ЛХM-8MД с плазменно-ионизацион-ным детектором, на трехметровой колонке диаметром 3 мм с неподвижной фазой — поли-этиленгликольсебацинатом (5% от веса фазы), нанесенного на хроматон N-AW.
Выделение (R)- или ^)-5-гексен-2-ола производили из осветленной реакционной смеси. Целевые продукты трансформации высаливали NaCl и троекратно экстрагировали равным объемом диэтилового эфира. Экстракт осушали над обезвоженным сульфатом натрия, пробу концентрировали, отгоняя растворитель. Образовавшийся продукт биотрансформации отделяли от непрореагировавшего субстрата методом колоночной жидкостной хроматографии на силикагеле Merk 60 (0.063—0.200 мм), используя в качестве элюен-та смесь гексан—этилацетат в соотношении 8 : 1.
Оптическую чистоту полученного продукта определяли с помощью автоматического поляриметра «Perkin Elmer» Model 341 при Я = 589 нм.
Литература
1. Grassia A., Bruno I., Debitus C., Marzocco S., Pinto A., Gomez- Paloma L., Riccio R. // Tetrahedron.- 2001.- V. 57.- P. 6257.
2. Hooper A. M., Dufour S., Willaert S. P., Pickett J. A. // Tetrahedron Lett.- 2007.- V. 48.-P. 5991.
3. Conti P., Dallanoce C., Amici M., Micheli C., Carrea G., Zambianchi F. // Tetrahedron: Asymmetry.- 1998.- V. 9.- P. 657.
4. Каталог продукции фирмы Aldrich [Электронный ресурс]: http://sigma-aldrich.com.
5. Петухова H. И., Зорин В. В. // В сб. Панорама современной химии. Успехи органического катализа и химии гетероциклов.— M.: Химия, 2006.- С. 280.
6. Lorret N. В., Howard W. L. // J. Org. Chem.-1961.- V. 26.- P. 3112.
