CC BY
50
ВЫВОДЫ. .....
1. Дозировка ПСС 10% к массе сахара-песка при производстве драже позволяет получать изделия, соот-ветствующие по физико-химическим и органолептическим показателям ГОСТ 7060-79. При указанной дозировке в готовом продукте повышается содержание массовой доли влаги на 80% и редуцирующих веществ на 2,6% по сравнению с контролем.
2. При хранении драже с добавкой ПСС в течение 90 сут потери влаги снижаются на 68,8% по сравнению с контролем.
3. Введение 10% ПСС повышает пищевую ценность драже ка 84,1%. Содержание железа, кальция,
магния и некрахмальных полисахаридов увеличивается на 70; 30,5; 20,8 и 98,5% соответственно, что свидетельствует о биологической ценности разработанного продукта и его радиопротекторных свойствах.
ЛИТЕРАТУРА
1. Зубченко A.B. Физико-химические основы технологии кондитерских изделий. - Воронеж, 1997.
2. Михайлов B.C., Палько A.C. Выбираем здоровье. -М., 1987.
Кафедра технологии хлебопекарного, кондитерского и макаронного производств
Поступила 25.10.01 г.
577.15.07.002.2
ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА КОМПЛЕКСНОГО ПРЕПАРАТА КЕРА ТИНРАСЩЕПЛЯЮЩИХ ПРОТЕАЗ АКТИНОМИЦЕТА ..... STREPTOMYCES FRAD10SP1RAUS ВКМ А-157
Л.В. АНТИПОВА, Ч.Ю. ШАМХАНОВ
Воронежская государственная технологическая академия
Большая часть промышленных ферментов - концентрированные, но не высоко очищенные препараты. Часто водные растворы ферментов (культуральная жидкость) слишком разбавлены и неудобны для прямого использования. Поэтому их обычно концентрируют путем выпаривания под вакуумом при относительно низкой температуре. Дальнейшего концентрирования и отделения некоторых растворимых примесей можно достичь осаждением ферментов органическими растворителями - чаще всего этиловым и изопропиловым спиртом, а также ацетоном. С этой же целью применяют высаливание неорганическими солями, например сернокислым аммонием [1].
Для промышленного использования ферментных препаратов большое значение имеет их стоимость, а не тщательная очистка [2]. Очистка от примеси сопутствующих ферментов или других содержащихся в препарате веществ необходима, если они неблагоприятным образом влияют на качество продукта и процесс его получения, а таюке для изучения субстратной специфичности [3].
Следует добавить, что высокоочищенные препараты применяются только в тех случаях, когда высокая стоимость не имеет значения по сравнению с поставленной целью. В пищевой технологии и перерабатывающих отраслях АПК, как правило, используют очищенные и полуочищенные препараты. Получение та-ких препаратов на основе актиномидетов представляет научно-практический интерес. Для актиномицетов характерен синтез нескольких препаративных форм протеаз с молекулярной массой в интервале 8000-11000 Да [2].
Цель настоящей работы - разработка способа выделения комплексного препарата кератинрасщепляю-щих протеаз из культуральной жидкости актиномицета ВКМ А-157 и исследова-
ние его фракционного состава.
Объект исследования - штамм Strpptomyc.es А-ас1ю5р1гаИ$ ВКМ А-157 из группы РгаШае, обладающий наилучшей способностью среди известных штаммов - продуцентов кератинрасщепляющих протеаз. Отбор был произведен из 34 штаммов актиномицетов таксономических групп КиЬго-аигстаасия, Сг1зеи$, РгасИае и Chromogenes культур музея отдела чистых культур Федерального государственного унитарного предприятия - Государственный научный центр по антибиотикам. Чистую культуру актиномицета поддерживали на плотной питательной среде с картофельным агаром.
Выращивание актиномицета проводили глубинным способом, включавшим два этапа. На первом этапе готовили водно-споровую суспензию из 20-суточ-ной чистой культуры штамма и вносили се в количестве 2% к объему питательной среды. Для получения вегетативного мицелия использовали споровый материал, содержащий 108 спор/см3. Состав среды подобран экспериментально, %: крахмал картофельный и соевая мука - 2; (ЫН^О* - 0,3; К'аС1 - 0,25; КН2Р04 - 0,05; СаСОз - 0,3; pH 7,4. Посевной материал готовили в колбах емкостью 750 см3 на лабораторной качалке при 180 об/мин, температуре 28-30°С в течение 48 ч до образования вегетативного мицелия; отношение объема среды к объему колбы 1 : 7,5.
На втором этапе осуществляли собственно культивирование продуцента. Для этого питательные среды вносили в качалочные колбы с соотношением объемов среды и колбы 1:7,5 и засевали вегетативным мицели-
швает-
свиде-
анного
'ИИ кон-[, 1987.
'.002.2
выде-
пляю-
миде-
:дова-
myces
адаю-
лтам-
отеаз.
цетов
•iseus,
1СТЫХ
рного
гоан-
ддер-
ьньм
>"биН-
1эта-
уточ-
чест-
ІЯВЄ-гери-ібран )евая 0,05; їли в їпри о объема
іьти-
эеды
емов
;ели-
ем культуры, полученной на первом этапе; объем за-севной культуральной жидкости составлял 5% к объему питательной среды. Культивирование актиномице-та осуществляли на питательной среде следующего компонентного состава, %: кератин - 2,0; крахмал картофельный - 7,0; КН2РО4 - 0,15; MgS04x7H20 - ОД; FeS04x7H20 - 0,0015; Z11SO4 - 0,0005; СаС03 - 0,4. Выращивание продуцента проводили при 28°С в течение 96 ч в колбах емкостью 750 см3 со 100 см3 среды. Исходное значение pH среды устанавливали на уровне 7,2-7,4. По окончании выращивания отделяли мицелий центрифугированием (3500 об/мин, 15 мин).
Комплексный препарат ферментов осаждали из культуральной жидкости сульфатом аммония или органическими растворителями (ацетоном, этанолом и изопропанолом). Предварительно культуральную жидкость охлаждали до 4°С, приливали осадитель (органические растворители предварительно охлаждали до -18°С) и выдерживали 5-20 мин для образования осадка. Осадок отделяли центрифугированием (3500-4000 об/мин), растирали на ступке с небольшим количеством осадителя, фильтровали и высушивали на воздухе. В полученных препаратах определяли проте-олитическую (ПС) [4] и кератиназную [5] активности, а также белок по Лоури [6]. Была установлена корреляция между протеолитической и кератинрасщепляю-щей активностями.
Фракционирование препаратов проводили на сефа-дексе G-100 (Pharmacia, Швеция) при размерах колонки 2x75 см. При элюировании использовали буфер универсальный с pH 7,0 при скорости 30 см3/ч [7]. Электрофорез фракции активных белков проводили в 7,5%-м полиакриламидном геле при pH 8,3 (от/?мс-глициновый буфер) в течение 2-2,5 ч при напряженки 260 В и силе тока 5 мА. Для окраски гелей использовали 10%-й амидочерный 10 В в соответствии с рекомендациями [8].
Применение сульфата аммония для выделения про-теаз из культуральной жидкости Streptomyces fradiospiralis ВКМ А-157 положительных результатов не дало. При степени насыщения 0,8 осадок не формировался даже при выдержке в течение 16-24 ч, при увеличении насыщения отмечался выход по активности менее 13%. Органические растворители дали результат как по массовому выходу, таге и удовлетворительный по активности. Варьирование pH изменяет массовый выход осадков и чистоту препаратов ферментов. Наиболее полно ферменты выпадают в осадок при pH, соответствующем изоэлектрической точке [2].
Исследования влияния pH на полноту осаждения протеаз из культуральной жидкости актиномицета Streptomyces fradiospiralis ВКМ А-157 проводили при концентрациях этанола и изопропанола 75%, ацетона -64%. Такие концентрации осаднтелей обеспечивали выход активности соответственно 83, 80 и 73%. Значение pH осаждения варьировали от 6,0 до 9,0. Полученные результаты показали, что протеазы актиномицета достаточно полно осаждались при pH 7,0-8,0 с макси-
мумом при pH 7,5. Отклонение значения pH в ту или иную сторону приводило к существенному снижению активности. Так, при pH 6,0 и 9,0 ПС выделенных ферментов составила 73 и 80% от максимальной. Определение границ выделения протеаз из культуральной жидкости ^ігеріотусен /гаЛо.\рігаІіі' ВКМ А-157 проводили путем ступенчатого повышения концентрации осадителя в смеси.
Рис. 1
Как видно из рис. 1(1 - этанол, 2 - изопрапанол, 3 -ацетон), основная часть кератинрасщепляющих протеаз выделялась из растворов при конечной концентрации С этанола 72-77%, изопропанола и ацетона -64-77%. При концентрации этанола ниже 72%, изопропанола и ацетона ниже 64% из раствора выделялись преимущественно балластные вещества. Удельная активность (табл. 1) полученных осадков невелика: ПС 11,7-20,6 ед. ■ 10~3 /мг белка. Наибольшая удельная активность отмечена при осаждении этанолом в концентрации 72% - 32,7 ед. • 10_3/мг белка. При концентрации изопропанола 64% она на 14% ниже и равна
28,2 ед. • 10“3/мг белка. Самая низкая удельная активность - 22,3 ед. • 10'3/мг белка, т. е. на 32% ниже, чем активность осадка, полученного при использовании этанола, - наблюдалась при осаждении ацетоном. С увеличением концентрации этанола и изопропанола в растворе возрастало количество неактивных белков в осадке. Удельная активность снижалась на 21-25% от их максимального значения. При повышении концентрации ацетона от 64 до 77% удельная активность существенно не изменялась, так как при концентрации
64% в осадок Шесте с ферментами выпадало основное количество балластных белков. " ^
Рис. 2
Таким образом, целесообразными следует признать условия осаждения комплексного препарата про-теаз из культуральной жидкости 3[гер1отусе$ /гасио,чр!гаИ$ В КМ А-157 этанолом при pH 7,5 в концентрации 72%. При этом отмечалось наибольшее значение удельной активности, а следовательно, наиболее высокая степень очистки целевых ферментов.
Идентификацию активных протеаз проводили методами гель-фильтрации на сефадексе С-100 и электрофореза. Результаты исследований показали, что препарат состоит из двух основных фракций. Профиль элюции представлен на рис. 2 (/ - белок, мг/см3; 2 -ПС • 103, ед./см3 элюата). Протеолитическая активность была сосредоточена во фракции II. Относительное содержание активного белка составило 87% от общего количества в элюате. Ориентировочная молекулярная масса протеаз, определенная по методу [9], равна 7000-10000 Да. Следует отметить, что пигменты не отделялись от белков. Видимо, красящие вещества очень прочно связаны с исследуемыми протеазами, что весьма характерно для препаратов, получаемых при выращивании микроорганизмов на кератиновом субстрате [5]. При электрофорезе в полиакриламидном геле фракции II, отделенной от неактивных и низкомолекулярных белков, было обнаружено 8 белковых зон. Производство белковых гидролизатов из кератинового сырья требует применения ферментов, обладающих широкой специфичностью, что обеспечивает глубокий гидролиз до низкомолекулярных пептидов и аминокислот. В связи с этим исследовалось влияние различных ферментных препаратов в оптимальных условиях на расщепление предварительно обработанного мочевиной кератина пера. Дозировка вносимых препаратов - 6,0 ед./г белка. Гидролиз вели при температурах 40-45°С в течение 6 ч при непрерывном перемешивании на лабораторной качалке при 180 об/мин. Установ-
лено, что по способности переводить кератин пера в растворимую форму’ исследованные ферментные препараты можно расположить в следующей последовательности: препарат из Streptomycesfradiospiralis ВКМ А-157 (98%) > протолихинин (69%) > протосубтилин (62%) > трипсин (57%>) > пигмауесин (52%) > элегантен (46%) > амилооризин (27%) > пектофоетидин . (19%).
Результаты электрофореза свидетельствуют о высокой гетерогенности протеолитического комплекса Streptomyces fradiospiralis ВКМ А-157, что, по всей видимости, и является причиной достаточно глубокой деструкции кератиновых субстратов, установленной экспериментально.
выводы
1. При получении комплексного препарата кера- I тинрасщепляющих протеаз из культуральной жидкости Streptomyces fradiospiralis ВКМ А-157 максимальная удельная активность (32,7 ед. • 10 3/мг белка) отмечена при использовании этанола при pH 7,5 в концентрации 72%.
2. Полученный комплексный препарат при
гель-фильтрации на сефадексе G-100 обнаруживает две основных белковых фракции. Протеолитическая активность идентифицируется лишь в одной из них. Электрофореграммы доказывают гетерогенность протеолитического комплекса, состоящего из 8 фракций с ориентировочной молекулярной массой в диапазоне 7000 -10000 Да и обеспечивающего глубокую деструкцию кератиновых белков. ...
ЛИТЕРАТУРА
1. Батомункуева Б.П., Егоров Н.С. Изучение препаратов внеклеточных протеиназ грибов Aspergillus ochraceus 513 и Aspergillus alliaceus 7 dN 1 // Микробиология. - 2002. - 71. -№ 1. - C. 56-58.
2. Грачева И.M., Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов. 3-е изд., перераб. и доп. - М.: Изд-во Элевар, 2000. -512 с.
3. Аминопеитидаза PC гепатопанкреаса камчатского краба Paralithodes Camíshatica / Г.Н. Руденская, А.М. Шмойлов, В.А. Исаев и др. // Биохимия. - 2000. - 65. - Вып. 2. - С. 199-206.
4. ГОСТ20264.2-88. Препараты ферментные. Методы определения протеолитической активности. - М.: Изд-во стандартов, 1989. ^
5. Nickerson W.J., Noval J.J., Robison R.S. Keratinase. 1. Properties of the enzyme conjugate elaborated by Streptomyces fradiae // Biochem. Biopliys. Acta. - 1963. - 77. - P. 73-86.
6. Антипова Л.В., Глотова И.А., Рогов И.А. Методы исследо- , Вания мяса и мясных продуктов. - М.: Колос, 2001. - 376 с.
7. Остсрман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. - М.: Наука, 1985. - 536 с.
8. Гааль Э., Мсдьеши Г., Верецкая Л.С. Электрофорез в разделении биологических макромолекул. - М.: Наука, 1982. - 446 с.
9. Землянухнн A.A., Землянухии Л.А. Большой практикум по физиологии и биохимии растений: Учеб. пособие. - Воронеж: Изд-во Воронеж, ун-та, 1996. - 188 с.
Кафедра технологш! мяса и мясных продуктов
Поступила 25.09.02 г.
