CC BY
47
576.852.1:577.15.07
БИОСИНТЕЗ КЕРА ТИНРА ОЦЕПЛЯЮЩИХПРОТЕАЗ
АКТИНОМИЦЕТОМ 87ЖРТОМГСЕЗ ЕМОЮБРШЫЗ ВКМА-157
В РА^птлииыу л/гнптяяу
и М ±ХХ±^>±У\. к/ '—/ \у' 2 1^1 X X/ и V
Ч.Ю. ШАМХАНОВ, Л.В. АНТИПОВА
Воронежская государственная технологическая академия
Для получения денных белковых гидролизатов из отходов мясо- и рыбокомбинатов и кожевенных заводов необходимо изыскание протеаз, обладающих специфичностью к гидролизу протеноидов: фибрина, эластина, коллагена и кератина. По известным причинам наибольшие преимущества имеют микробные протеа-зы.
Одним из основных факторов, влияющим на быстрый рост микроорганизмов и максимальный биосинтез ими специфических ферментов, является подбор условий культивирования [ 1 ].
В литературных источниках [2-11] мало данных (или они полностью отсутствуют) по исследованию влияния таких условий культивирования, как исходное значение pH среды, температура, соотношение объемов питательной среды и колбы, соотношение углерод : азот (С : М), влияние отдельных аминокислот на процессы жизнедеятельности продуцентов кератин-расщепляющих протеаз.
Цель работы - изучение действия указанных факторов на рост актиномицета БмерШтусея ¡гасИо$р1гаИ8 ВКМ А-157 и синтез им специфических ферментов.
Объект исследования - штамм Б^ер^тусея /гасИозркаШ ВКМ А-157 из группы РгасНае, обладавший наилучшей способностью среди изученных штаммов к биосинтезу кератинрасщепляюпщх протеаз, был получен из музея отдела чистых культ\'р Федерального унитарного предприятия - Государственного научного центра по антибиотикам. Чистую культуру актиномицета поддерживали на плотной питательной среде с картофельным агаром.
Выращивание актиномицета проводили глубинным способом в два этапа. На первом этапе готовили водно-споровую суспензию из 20-суточной чистой культуры штамма и вносили ее в количестве 2 % к объем)' питательной среды. Для получения вегетативного мицелия использовали споровый материал, содержащий 108 спор/см3. Состав среды, %: крахмал картофельный - 2,0; соевая мука - 2,0; (МН4)2804 - 0,30; КаС1 - 0,25; КН2Р04 - 0,05; СаС03 - 0,30, pH - 7,4. Посевной материал готовили в колбах емкостью 750 мл на лабораторной качалке при 180 об/мин, температуре
тя_^п °г О /15 ЧГ ГГ/~1 Л^ЛПЛг>АТ>'1Т1ТГ 1Т
О IV/ -ги “X Ди V» ^ СЦкЛЭаПНУ!. О^/Х ^хеи. ¿гхохьих и
мицелия; отношение объемов среды и колбы - 1 : 7,5.
На втором этапе осуществляли собственно культивирование продуцента. Для этого питательные среды вносили в качалочныс колбы с соотношением объемов среды и колбы 1 : 7,5 и засевали вегетативным мицелием культуры, полученной на первом этапе. Объем за-севной культуральной жидкости составлял 5 % к объему питательной среды. Культивирование актиномицета осуществляли на питательной среде со следующим компонентным составом, %: кератин - 2,0; крахмал картофельный - 7,0; КН2Р04 - 0,15; М§804х7Нг0 -0,10; Ре804х7Н20 - 0,0015; 2иБ04 - 0,0005; СаС03 -0,40. Выращивание продуцента проводили при 28 °С в течение 96 ч в колбах емкостью 750 см3 со 100 см3 среды. Исходное значение pH среды составляло 7,2-7,4.
Культуральную жидкость отделяли от мицелия центрифугированием (3500 об/мин, 15 мин). В фильтрате определяли протеолитическую активность (ПС) модифицированным методом Ансона с применением субстрата казеината натрия [12] и биомассу' (БМ) микроорганизма - высушиванием до абсолютно сухой массы.
При изучении влияния исходной величины pH питательной среды на рост актиномицета и синтез протеаз значения изучаемого параметра варьировали в интервале от 2,0 до 10,0. Исходное значение pH устанавливали добавлением 1 н растворов НО или №ОН
Результаты по влиянию исходного значения pH среды на рост продуцента и синтез им ферментов приведены на рис. 1.
Рис. 1
На рисунке видно, что при величине pH ниже 3,5 роста актиномицета не наблюдалось. Значительное количество БМ (кривая 1) накапливалось при культиви-
г
1.
! ’ "7
¡нет
т,5
(ИЯН-
исл.1
¿ИОВ тЫ' И Я-№м-
чн :е-:ил н лклы р-:о-,~
* 1|1‘ Е-
з
|.:|;ь-
■7.4.
!1:лЛ£4
Ьът-
■ ТГ|. |=П=М о>.-
,Ш£
\ 11К“
рле-
13 нл-1:1йВ-
I
1 pH
Л[.‘И-
р
I' лН
ь \5 г; ко
[ШЩ-
лчньчг:-щ1лу.'«>ч иииьёля тддю.югия .ч» ^ - г -?■>:■-._____________ ^
ровании продуцента на средах (кривая 2) с исходными значениями pH от 6,0 до 9,0 (2,21-2,52 г/100 см3 среды). Интенсивный рост БМ (2,83 г/100 см3 среды) отмечен при pH 7,5. Отклонения значения pH от 7,5 в обе стороны приводило к снижению массы образовавшегося мицелия. Так, при pH 5,0 масса абсолютно сухого мицелия актиномицета составляла 2,14 г, при pH 9,0 и
10.0 - 2,21 и 1,84 г (соответственно 76, 78 и 65 % от максимальной).
Интенсивный биосинтез протеаз актиномицетом наблюдался в средах, где исходные значения pH были от 6,5 до 8,0. При pH ниже 4,5 синтеза ферментов не происходило. Максимальное количество протеаз накапливалось при pH 7,5. Активность была 2344х10'3 ед./см3 фильтрата культуральной жидкости.
Следует отметить, что при исходных значениях pH
4.0 и 5,0, по окончании культивирования, сохранялось некоторое количество нсрастворенного кератина. При pH 2,0 и 3,0 кератин не использовался продуцентом (визуальные наблюдения).
При изучении зависимости роста продуцента и синтеза протеаз от температуры выращивания опыты проводили при 20, 30 и 40 °С. Выбор данного интервала связан с тем, что актиномицет, как и все продуценты кератинрасщепляющих протеаз, относится к мезо-фильным микроорганизмам [13].
Как показали результаты исследований, существует зависимость накопления БМ актиномицетом и синтеза протеаз от исходной величины pH питательной среды. Оптимальная область температур, при которой актиномицет способен расти и продуцировать ферменты, - 20-30 °С. При 30 °С активность ферментов ниже на 7 % (2178 х 10'3 ед./см3), чем в контрольной среде при 28 °С (2344х 10'3 ед./см3). Масса сухого мицелия достигала 2,64 г/100 см3 среды. При 20 °С активность ниже на 20 % (1874х10~3 ед./см3). Биомасса составляла 2,50 г/100 см3 среды. Дальнейшее повышение температуры выращивания до 40 °С приводило к слабому росту актиномицета (1,82 г БМ) и низкому уровню активности протеиназ - 1038х10'3 ед./см3 фильтрата культуральной жидкости (44 % от ПС в контроле).
Полученные дзнные свидетельствуют о том, что наиболее благоприятные условия для роста продуцента исинтеза им кератинрасщепляющих ферментов создаются культивированием его при 26-28 °С. На продуцирующей способности последнего отрицательно сказывается увеличение температуры выше 28 °С.
Влияние соотношения (А) объемов питательной среды и колбы на биосинтез протеаз (рис. 2) исследовали в зависимости от состава среды: 7-е соевой мукой; 2-е кератином; остальные компоненты среды оставались без изменений. Соотношение А варьировали от 1 : 3,5 до 1 : 15.
Анализ опытов по влиянию данного фактора на синтез, ферментов актиномицетом БЬ-ер^тусси ¡'гаси\щ)1гаИх ВКМ А-157 показал, что максимальная активность (2895х10_3 ед./см3 культуральной жидкости) при выращивании на среде с соевой мукой прихо-
Рис. 2
дится на объем 75 см3 ( А 1:10). При объеме среды 100 см3 (коэффициент 1 : 7,5) активность ферментов ниже на 7 % (2700х10'3 ед./см3). С дальнейшим увеличением объема среды ПС резко падает. Вероятно, при больших объемах среды снижается ее аэрация, что обусловливает и снижение синтеза протеаз.
Иная картина наблюдается при использовании в средах кератина. Наибольшая активность ферментов (2344х10~3 ед./см3) отмечена при объеме среды 100 см3. Дальнейшее его увеличение не так резко сказывается на процессе накопления протеаз. При объеме среды 200 см3 (коэффициент 1 : 3,8) данная активность ферментов в 7,4 раза выше, чем при культивировании на соевой муке (1092х10"3 и 146х10"3 ед./см3).
При выращивании актиномицета в производственных условиях на среде с соевой мукой расход воздуха на. аэрирование культуры составлял 22,0 м3/ч на 100 дм3 среды.
Установлено, что использование в питательных средах кератина вместо соевой муки влечет за собой сокращение расхода воздуха для аэрации культуры.
Нами не обнаружено литературных данных, касающихся выявления оптимального соотношения С : N для роста продуцентов кератинрасщепляющих протеаз и синтеза ими ферментов. В связи с этим был исследован широкий диапазон указанных соотношений: от 2 : 1 до 100 : 1.
- ✓ / / /
” \
\ X V <С - < < -• 2 у у А \ ■ - ✓ И / / / / V / в > 01 •2
п С V £
1 л а .. ✓ ✓ / ■ V 7 /
■; ; ю 15 20 5а ¡оо 150 Г:^
Рис. 3
Из приведенных данных (рис. 3:7- ПС - активность, ед/см3; 2- БМ, г/100 см3) следует, что актиномицет 8&ер№тусех /гасИо&'р1гаНх ВКМ Л-157 способен расти и синтезировать активные протеиназы во всем исследуемом диапазоне соотношения С : >1- от 2 : 1 до
100 : 1. С увеличением концентрации углерода в среде усиливается рост микроорганизмов, а также возрастает активность протеолитических ферментов. Следует отметить, что ее уровень непосредственно не связан с накоплением БМ и в большей степени зависит от продуктивности мицелия, выражаемой в единицах активности на 1 мг сухого веса:
С : N Продуктивность мицелия, ед. ПС/мг
2 : 1 0,49
5 : 1 0,76
10:1 0,83
15:1 0,86
20 : 1 0,66
50 : 1 0,35
100 : 1 0,21
Наиболее благоприятное для синтеза протеаз оказалось соотношение С : Нот 15 : 1 до 20 : 1. В этом интервале ПС составила 2312+2206х 103 ед./см3 фильтрата г^льтуральной жидкости.
Пользуясь полученными данными по активности ферментов, проведем следующее сравнение: Компоненты среды % С : N ПС 10'3, ед./см3 Крахмал картофельный 7,0 (17,5:1) 2700
Соевая мука 2,0
Крахмал картофельный 7,0 (15,2:1) 2344
Кератин 2,0
Отсюда следует, что количество азота (кератина), вносимого в питательную среду, надо уменьшать до соотношения С : Ы, равного 17,5. Активность ферментов в среде с этим соотношением (крахмал - 7,0 %; кератин -1,76 %) составила 2663 х 10'3 едУсм3 фильтрата культуральной жидкости. Уточнение соотношения С : N дли продуцента позволило увеличить ПС на 12 %.
При исследовании влияния отдельных свободных аминокислот в питательной среде при культивировании актиномицета Streptomyces (гасНощгаНь ВКМ А-157 на синтез протеаз их вносили в количестве 0,1 % к контрольной среде с изменением состава по кератину' (1,76 %).
Таблица
Аминокислоты
ПС - 10" ед./см3
ПС,
% от контроля
£>1-лизин 2184 . 82
¿»¿-Р-аланин 2903 : 109
ОЬ- лейцин 4128 155
D¿-cepин 3595 ; ! 135
¿-аспарагин 2104 79
¿»¿-триптофан 5353 ; 201
¿-аргинин 3595 135
ОЬ- валин 3329 125
¿-цистеин 692 26
¿-гистидин 1837 69
©¿-метионин 1491 56
¿-глутаминовая кислота 2903 10?
¿>¿-0- фенил-а-аланин 4474 168
Контрольная среда 2663 100
Как видно из таблицы, добавление в питательную среду дополнительно отдельных аминокислот по-разному влияет на биосинтез ферментов актиномицетом.
Из исследованных аминокислот только пять снижали активность синтезируемых ферментов: лизин < аспарагин < гистидин < метионин < цистеин, остальные повышали синтез протеаз. Триптофан и фенилаланин обладали большим стимулирующим эффектом из этого ряда аминокислот. Активность ферментов составила 5353х10'3 ед./см3 (201 %) и 4474х10'3 ед/см3 (168 %) соответственно. Валин, аргинин, серин, лейцин в 1,25-1,55 раза увеличивали активность протеаз по сравнению с аналогичной величиной в контрольном опыте.
Состав свободных аминокислот гидролизата, полученного при действии препарата внеклеточных протеаз Streptomyces /гасИохрггаИя ВКМ А-157 на кератин пера, характеризовался высоким содержанием изолейцина (22 %), лейцина (17 %), аргинина (14 %), стимулирующими синтез ферментов у продуцента. Незначительное содержание цистина (4,6 %) говорит о том, что аминокислота большей частью входит в состав пептидов гидро лизата, которые составили 10-13 % от общего количества продуктов. Поэтому' цистеин не угнетает синтез протеаз на среде с кератином, расщепляющимся внеклеточными ферментами растущей культуры до аминокислот.
выводы
Полученные результаты свидетельствуют о том, что наиболее благоприятные условия для роста акти-номицета Б^ерШпусе.?/гасИохр1гаН ВКМ А-157 и синтеза им кератинрасщепляющих ферментов создаются при культивировании его при исходном значении pH 7,5, температуре 28 °С и соотношении объемов среды и колбы 1: 10. Активность при этом составила 2663х10‘3 ед./см-5 фильтрата культуральной жидкости.
Использование в питательных средах кератина вместо соевой мужи влечет за собой сокращение расхода воздуха для аэрации культуры.
Уточнение соотношения С : N для продуцента позволило увеличить его протеолитическую активность на 12 %.
Положительное влияние на биосинтез кератинрасщепляющих протеаз актиномицетом З^ерШпусея р-айю$р\гаИя ВКМ А-157 оказывало присутствие в среде некоторых свободных аминокислот. Значительное усиление биосинтеза протеаз происходило в присутствии в среде триптофана. Активность ферментов увеличилась в два раза и составила 5353x10'3 ед./см3 фильтрата культуральной жидкости.
Анализ полученных данных показывает целесообразность использования вторичныхкерагиновых отходов в питательных средах при культивировании актиномицета как индуктора биосинтеза специфических протеаз, а также, возможность их переработки в белковые кормовые родукты методом микробной фермента-
ьную
>раз-
ÎT0M.
шжа-
< ас-ьные инин зэто-тави-68 %) щ в в по сьном
полуроте-
ратин
юлей-
шму-
начи-
и,что
епти-
)бще-
гает
щим-
рыдо
том, акги-I синился ш pH еды и ЗхЮ'3
атина
>асхо-
га по-.ность
шрас-
myces
всре-
льное
:утст-
гвели-
ШЛЬТ-
:сооб-
отхо-
акги-
[еских
5елко-
жнта-
ции (без выделения ферментов из культуральной жидкости).
ЛИТЕРАТУРА
1. Грачева И.М., Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов. - 3-е изд., перераб. и доп. - М. : Элевар, 2000.-512 с.
2. Гусев MB., Минеева Л.А. Микробиология. - М.: Изд-во МГУ, 1985. -376 с.
3. Шлегель Г. Общая микробиология: Пер. с нем. - М.: Мир, 1972.-476 с,
4. Биосинтез микроорганизмами нуклеаз и иротеаз / Под ред. А.А Имшенецкого.-М.: Наука, 1979.-294 с.
5. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках,- М.: Высш. школа, 1979. -455 с.
6. Безбородов А.М. Биохимические основы микробиологического синтеза -М.: Легкая и пищевая пром-сть, 1984. - 304 с.
7. Коновал»в С.А. Биосинтез ферментов микроорганизмами. -М.: Пищевая пром-сть, 1972.-269 с.
8. Роуз Э. Химическая микробиология: Пер. с англ,-М.: Мир. 1971. - 294 с.
9. Meevootisom V., Niederprucin D. Control of exocellular proteases in dermatophytes and especially: Trichophyton rubrum // Sabouraudia. - 1979. - 17,- 2,- P. 91-106.
10. Овчаров A.K. Протеолтнческие ферменты термофильного актиномицета: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. - М., 1969. -29 с.
11. Chaloupka I., К recow а P. Regulation of the Formation of Protease in Bacullus megaterium // Folia Microbiologia. - 1966. -11.- №
2. - C. 83-94.
12. ГОСТ 20264.2-88. Препараты ферментные. Метода определения протеолитической активности. - М.: Изд-во стандартов, 1989.
13. Красильников H.A. Лучистые грибки. - М.: Наука, 1970. -534 с.
Кафедра технологии мяса и мясных продуктов
Поступила 25.09.02 г.
637.52:663.05.002.2
ФЕРМЕНТИРОВАННЫЕ ПИЩЕВЫЕ ДОБАВКИ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В МЯСНЫХ ПРОДУКТАХ .....
Н.ВЛ1ЕФЕДОВА
Московский государственный университет прикладной биотехнологии " • :
Совершенствование структуры мясных продуктов за счет обогащения их растительным сырьем позволяет сделать питание населения более полноценным, разнообразным и рациональным. Необходимость использования растительного сырья обусловлена не только составом растительного белка, но и наличием минеральных веществ, витаминов, углеводов, полисахаридов и других биологически активных веществ. Способность молочнокислых бактерий (МКБ) ферментировать растительные субстраты и снижать содержание опасной дои здоровья вредной микрофлоры можно широко использовать в производстве пищевых продуктов, в том числе мясных. Метаболические вещества, образующиеся в растительном сырье под действием бактерий, участвуют в формировании потребительских и технологических свойств пищевых систем с гетерогенным составом компонентов.
Ферментация, а точнее брожение, обусловленное МКБ, проходит в различных растительных субстратах не однотипно и зависит от бактериальной принадлежности и условий культивирования. Брожение связано с перестройкой органических молекул субстрата. Как правило, бактерии в качестве источника углерода используют сахара и другие углеводы, реже масла и жиры, а иногда углеводороды. Более того, в растительных субстратах для питания бактерий имеется источник азота и минеральные вещества. Развитие МКБ сопровождается образованием различных по свойствам и активности метаболитов. Среди множества первичных метаболитов брожения особую ценность представляет вырабатываемая в виде двух оптических изомеров мо-
лочная кислота, количество которой зависит от ферментативных особенностей бактерий и состава ферментируемого субстрата. Так, правовращающий Ц+)-изомер молочной кислоты образуется в молоке в присутствии Lactobacillus acidophilus за 40 ч культивирования и достигает 800 мг/100 г, Bifidobacterium bifidum - за 48 ч (500 мг/100 г), йогуртная закваска - за
■з « /апп Mr/inn .л г] 1
3 Ч Mi/ i\jyj i) [i j.
Первичные метаболиты, в их числе аминокислоты, нуклеотиды, белки, нуклеиновые кислоты, углеводы и др., являются жизненно важными для роста микроорганизмов веществами. Высокая протеолитическая активность одних МКБ способствует тому, что в среде накапливаются необходимые аминокислоты, полипептиды, благодаря которым создаются условия для развития консорциума метаболически связанных бактерий различных видов. Опираясь на общеизвестные данные о различной активности культур молочнокислых заквасок в образовании свободных аминокислот, небелкового азота, следует считать возможным применение культур МКБ для ферментации растительного сырья путем внесения жидких заквасок на основе лактобактерий, бифидобактерий и стрептококков. В последних фазах своего развитая МКБ синтезируют вещества, не играющие важной роли в метаболизме бактерий, но как биологически активные компоненты, необходимые для обогащения пищевых продуктов, они представляет несомненный интерес.
Технологически и экономически обосновано в мясной технологии комбинирование мясного сырья с растительными, зерновыми и крупяными продуктами [2]. Их применение позволяет создавать мясо-раститель-ные продукты не только с рациональным сочетанием белков, жиров, микроэлементов, но и с балансом заме-
