CC BY
62
577.156.002.612
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА КОМПЛЕКСНОГО ПРЕПАРАТА КЕРАТИНРАСЩЕПЛЯЮЩИХ ПРОТЕАЗ АКТИНОМИЦЕТА STREPTOMYCESFRADЮSPIRALISВКМА-157
ч.ю . шамханов, л.в. антипова Цистеин и восстановленный глютатион в концен-
Воронежская государственная технологическая академия
Использование протеолитических ферментов в перерабатывающих отраслях промышленности зависит от некоторых критериев. Самое большое значение в выборе протеаз имеют специфичность фермента, физико-химические условия биокатализа (оптимум рН действия, термостабильность, наличие активаторов и ингибиторов), а также стоимость фермента.
Производство белковых гидролизатов требует применения ферментов, обладающих широкой специфичностью, что обеспечивает глубокий гидролиз до низкомолекулярных пептидов и аминокислот. Известно, что протеолитические комплексы ферментов актиномице-тов состоят из нескольких протеаз с различной субстратной специфичностью [1].
Многие кератинрасщепляющие протеазы имеют оптимум рН для действия на кератин в зоне 6,0-9,0 [2-4]. Исключением является протеаза из Candida albicans [5], оптимум рН которой находится при 4,0, причем фермент неактивен при рН ниже 2,5 и выше 6,0. Неионные детергенты и двухвалентные металлы не оказывали влияния на кератинолитическую активность. На основании ингибиторного анализа фермент идентифицирован как карбоксильная протеиназа, подобная катепсину.
Ферменты активны в ограниченных пределах величин рН. Эти пределы могут быть узкими или широкими. Кривая зависимости активности от рН еще недостаточно полно характеризует фермент, так как оптимумы рН могут быть разными для различных субстратов [6]. Повышение температуры приводит к увеличению скорости ферментативных реакций, но при этом увеличивается также и скорость инактивации фермента. Эти два фактора оказывают противоположное влияние на скорость ферментативной реакции [7].
Имеются данные влияния рН на активность «про-назы» [В], которая обладает оптимумом протеолитиче-ской активности по казеину при рН 8,0-9,0.
Изучение влияния разных специфических реагентов на ферменты позволяет судить о присутствии различных связей и группировок в активных центрах протеаз.
Наиболее важными активаторами и ингибиторами протеаз актиномицетов являются ионы металлов и специфические реагенты. В большинстве случаев они снижают протеолитическую активность [9]. Так, про-теазы актиномицета Streptomyces rectus var proteolyticus полностью ингибировали ионы Hg2+ и Ag+ ; снижали активность ионов Со2+, Zn2+ и Cd2+ на 70%, незначительно активировали ионы Na+, K+, Mg2+ и Fe2+ [10].
трации 110- М снижали активность «протоальбина» на 70-В0% [11], что дает основание предполагать наличие в ферменте дисульфидных связей. Диизопропил-фторфосфат (ДПФФ) и и-хлормеркурийбензоат натрия полностью инактивировали протеазы термофильного актиномицета Streptomyces rectus [10]. В препарате из Actinomyces fradiae 119 [9] найдены лейцинамино- и карбоксипептидазы, ингибируемые ЭДТА; сериновые протеазы с трипсиновой, химотрипсиновой и эластаз-ной активностями, ингибируемые ДПФФ.
Цель настоящей работы - изучение некоторых физико-химических свойств комплексного препарата ке-ратинрасщепляющих протеаз актиномицета Streptomycesfradiospiralis ВКМ А-157.
Штамм Streptomyces fradiospiralis ВКМ А-157 из группы Fradiae был выращен на питательной среде с соевой мукой [12].
Комплексный препарат ферментов осаждали из культуральной жидкости этанолом (при рН 7,5) в концентрации 72% в растворе.
Культуральную жидкость охлаждали до 4оС, приливали осадитель (органический растворитель предварительно охлаждали до -18оС) и выдерживали 5-20 мин для образования осадка. Осадок отделяли центрифугированием (3500-4000 об/мин), измельчали на ступке с небольшим количеством осадителя. Отфильтрованный затем осадок высушивали на воздухе. В полученных препаратах определяли протеолитическую активность (ПС) и белок по Лоури [13]. Препарат имел удельную активность 32,7 ед -103/мг белка.
При разделении белковой смеси на основании раз -ницы молекулярных масс ее компонентов использовали фильтрование через сефадекс G-100 (Рhаrmасiа, Швеция). Работу проводили на колонке размерами 2,0x75,0 см. Буфер универсальный, используемый для определения ПС, рН 7,0. Скорость пропускания раствора 30 см3/ч [14].
Электрофорез фракции активных белков проводили в 7,5%-м полиакриламидном геле при рН В,3 (трис-глициновый буфер) в течение 2-2,5 ч при напряжении 260 В и силе тока 5 мА. Для окраски гелей использовали 10%-й амидочерный 10 В в соответствии с рекомендациями [15].
Комплексный препарат кератинрасщепляющих протеаз из актиномицета Streptomyces fradiospiralis ВКМ А-157 характеризовался двумя белковыми фракциями. Протеолитическая активность обнаружена только во фракции II, состоящей из В белковых зон. Ориентировочная молекулярная масса протеаз равна 7000-10000 Да.
Изучение физико-химических свойств протеаз ак -тиномицета Streptomyces fradiospiralis ВКМ А-157
Рис. 1
20 30 35 40 45 50 55 60 65 I
Рис. 2
проводили с фракцией II, активной в отношении субстрата казеината натрия.
Исследовали влияние величины рН на протеолити-ческую активность комплексного препарата из Streptomycesfradiospiralis. Субстратом для определения ПС с лужил 2%- й раствор казеината натрия. Г идро-лиз вели при температурах 30, 40, 50, 60, 65 оС. Значения рН изменяли от 5,0 до 9,0.
При изучении влияния ионов металлов на протеазы препарата его выдерживали в растворах солей при концентрациях 3 • 10-4 ... 3 • 10-2, а затем определяли про-теолитическую активность.
Информацию о возможном присутствии в активном центре фермента тех или иных групп можно получить при обработке препарата специфическими ингибиторами. В качестве таких ингибиторов использовали этилендиаминтетраацетат (ЭДТА), монойодуксусную кислоту (С2ИзЮ2), №28203, КМп04 и фенилметил-сульфонилфторид (ФМСФ). Раствор фермента с реагентом выдерживали при конечной концентрации его в смеси 10-3-10-5 в течение 30 мин при температуре 30оС. Обработку тиосульфатом натрия проводили при 40оС [11]. Затем определяли активность препарата при оптимальных условиях.
Как показали исследования (рис. 1), протеазы проявляли наибольшую активность в нейтральной зоне. Оптимум находился при рН 7,0. Отклонения в обе стороны от этого значения существенно влияли на активность ферментов. Так, при рН 6,0 ПС составила 81%, а
при рН 8,0 - 83% от максимальной. В кислой (рН 5,0) и щелочной (рН 9,0) зонах активность резко падала. Она составляла 41 и 33% от максимального значения.
Следует отметить, что значение рН 7,0 для активно -сти протеаз из Streptomyces fradiospiralis на казеинате натрия совпадает с рН для гидролиза кератина [15].
Температурный оптимум действия протеаз лежал в интервале 55-60оС (рис. 2). При 30, 40 и 50°С ПС составляла 11, 24 и 72% от максимальной. При температурах выше 60оС протеазы быстро инактивировались. При 65оС активность ферментов составила 67% от максимального значения ПС.
При изучении влияния ионов металлов на протеазы препарата его выдерживали в растворах различных со-
лей, а затем определяли протеолитическую актив-
ность. Таблица 1
Соли ПС, % к контролю, при концентрациях солей, М
3 • 10-4 3 • 10-3 3 • 10-2
ШС1 93,0 62,4 42,3
КС1 119,5 77,5 51,5
№С12 66,6 55,3 25,4
СаС12 108,4 100,0 41,6
ВаС12 113,9 92,3 88,4
MgS04 109,4 100,0 96,0
СоС12 134,4 89,6 34,3
Бе804 100,0 32,7 0
гп804 111,7 53,9 34,5
РЬ(СН3С00)2 66,6 58,8 21,6
А12(Э04)3 77,5 21,2 0
МпС12 108,3 81,0 51,4
СиС12 69,2 46,1 16,3
Результаты исследований (табл. 1) показывают, что активирующее действие на препарат протеаз оказывают ионы К+, Са2+, Ва2+, Mg2+, 2п2+, Мп2+ в концентрации 0,0003 М. Ионы Со2+ в той же концентрации активируют протеазы Streptomyces fradiospiralis ВКМ А-157 на 34%.
При увеличении концентрации до 0,003 М все ис -следованные ионы ингибировали препарат протеаз, за исключением Са2+ и Мg2+. Незначительно ингибировали препарат ионы Ва2+ (на 8%). При больших концентрациях ингибирующее действие ионов металлов возрастало. Остаточная активность при концентрации
0,03 М не превышала 54,4% от контроля. Устойчивыми оказались протеазы препарата при действии ионов Мg2+ (96%) и Ва2+ (88,4%). Сильными ингибиторами для протеаз Streptomyces fradiospiralis ВКМ А-157 являются ионы Бе2+ и А13+: при добавлении их в количе -стве 0,03 М активность теряется полностью. Ионы М2+, РЪ2+, Си2+ оказывают ингибирующее действие на препарат во всех указанных концентрациях.
Информацию о возможном присутствии в активном центре фермента тех или иных групп получали при обработке препарата специфическими ингибиторами.
Таблица 2
Реагент ПС, % к контролю, при концентрациях реагентов, М
6 ■ 10-3 6 ■ 10-4 6 ■ 10-5
ЭДТА 4,2 17,1 36,0
C2H3IO2 4,2 25,5 93,9
Na2S2O3 68,5 84,9 100,0
KMnO4 13,7 17,6 23,9
ФМСФ 17,1 48,7 66,1
Исследования показали (табл. 2), что препарат протеаз ингибировался тиосульфатом натрия. По-видимому, в препарате содержатся протеазы, структура которых стабилизирована дисульфидными связями. Влияние реагентов на сульфгидрильные группы было одинаковым. Монойодуксусная кислота и КМпО4 в концентрации 6 • 10-3 М вызывали подавление активности фермента на 95,8 и 86,3% соответственно. При концентрации 6 • 10-5 М эти реагенты снижали активность на 6,1 и 76,1%. Ингибитор на серин, ФМСФ, подавлял активность на 82,9% при концентрации 6 • 10-3 М, на 33,9% при концентрации 6 • 10-5 М. Хелатное соединение (ЭДТА) почти полностью инактивировало протеазы: при концентрации 6 • 10-3 М обнаружено было всего 4,2% от контроля. Добавление ЭДТА в концентрациях 10-4 и 10-5 М ингибировало фермент на 82,9 и 64% соответственно.
Таким образом, можно предположить, что в активном центре протеаз препарата имеются сульфгидрильные группы. Не исключено и присутствие серина. Как и многие нейтральные протеазы, протеазы Streptomyces/гаЛоі'рігаїіі' являются металлофермента-ми. Ингибирование ЭДТА протеаз было необратимым - при добавлении ионов Со2+, М^2+ активность не восстанавливалась.
ВЫВОДЫ
1. Протеазы Streptomyces fradiospiralis проявляют наибольшую активность в нейтральной зоне с оптимумом действия при рН 7,0. В кислой (рН 5,0) и щелочной (рН 9,0) зонах активность резко падает - 41 и 33% от максимального значения. Температурный оптимум действия протеаз лежит в интервале 55-60оС. При температурах выше 60 оС протеазы быстро инактивируются.
2. Протеазы препарата ингибируются ионами №2+, РЬ2+, Си2+.
3. Изучение влияния различных специфических реагентов на протеазы препарата, синтезируемого ак-тиномицетом, свидетельствует, что протеолитические
ферменты изучаемого микроорганизма отличаются друг от друга строением активных центров и содержат различные группировки и связи, необходимые для сохранения каталитически активной структуры.
4. Сопоставление результатов электрофореза фракции II комплексного препарата и ингибирования специфическими реагентами дает основание предполагать наличие в препарате металлозависимых пептидаз и сериновых протеаз широкого спектра действия.
ЛИТЕРАТУРА
1. Грачева И.М., Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов. 3-е изд., перераб. и доп. - М.: Изд-во Элевар, 2000. -512 с.
2. Chattaway F.W., Ellis D.A., Barlow A.E. Peptidases of dermatophytes // J. Invest. Dermatol. - 1963. -41. - № 1. - P. 31-37.
3. Yu R.J., Harmon S.R., Blank F. Hair digestion of Trichophyton mentagrophytes // J. Invest. Dermatol. - 1969. -53. - № 3.
- P. 166-171.
4. Ziegler H. Die Ektoenzyme der Dermatomyceten // Arch. Klinische experim. Dermatol. - 1966. -№ 226. - P. 282-299.
5. Makoto N., Ryoji T., Tomiko M., Hideoki O. Isolation and characterization of proteinase from Candida albicans: substrate specificity // J. Invest. Dermatol. - 1984. -83. - № 1. - P. 32-36.
6. Рид Д. Ферменты в пищевой промышленности: Пер. с англ. - М.: Пищевая пром-сть, 1971. - 413 с.
7. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. В 3 т.: Пер. с англ. - М.: Мир, 1982.
8. Петрова И.С. Протеолитические ферменты актиноми -цетов. - М.: Наука, 1976. - 60 с.
9. Долидзе Д.А., Петрова И.С., Фениксова Р.В. Исследо -вание комплекса протеолитических ферментов Actinomyces fradiae 119 // Приклад. биохимия и микробиология. - 1974. - 10. - Вып. 5. -С. 721-728.
10. Mizusawa K. Iochida F. Thermophilic streptomyces Alkaline Proteinase. I. Isolation, crystallization and physiko-chemical properties // J. Biological Chemistry. - 1972. -№ 247. - P. 6978-6983.
11. Протеолитические ферменты некоторых актиномице -тов из вида белых / И.С. Петрова, Р.В. Фениксова, Е.В. Казакова и др. // Приклад. биохимия и микробиология. - 1971. - 7. - Вып. 4. -С. 451-455.
12. Шамханов Ч.Ю., Антипова Л.В. Применение вторичных кератиновых отходов в питательных средах при культивирова -нии актиномицета Streptomyces fradiospiralis ВКМ А-157 // Хранение и переработка сельхозсырья. - 2003. - № 1. - С. 21-23.
13. Антипова Л .В., Глотова И.А., Рогов И.А. Методы ис -следования мяса и мясных продуктов. - М.: Колос, 2001. - 376 с.
14. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. - М.: Наука, 1985. - 536 с.
15. Гааль Э., Медьеши Г., Верецкая Л.С. Электрофорез в разделении биологических макромолекул. - М.: Наука, 1982. - 446 с.
16. Meevootisom V., Niederpruem D.I. Control of exocellular proteases in dermatophytes and especially: Trichophyton rubrum // Sabouraudia. - 1979. - 17. - № 2. - P. 91-106.
Кафедра технологии мяса и мясных продуктов
Поступила 09.04.03 г.
