CC BY
49
24
ИЗВЕСТИЯ ВУЗОВ. ПИЩЕВАЯ ТЕХНОЛОГИЯ, № 4, 2002
-;!.;п:лпп^-'-ггг-.Ті 576.852.002.612
кератинрасщепляющаяактивность ::
V ... НЕКОТОРЫХ ГРУПП АКТИНОМИЦЕТОВ *'..2
Ч.Ю. ШАМХЛНОВ
Воронежская государственная технологическая академия
~ Получение ферментов и их использование в различных технологических процессах составляют сегодня один из важнейших разделов современной биотехнологии [1],
Протеолитические ферменты занимают ведущее место в общем объеме производства ферментных препаратов, из года в год расширяется сфера их применения. В настоящее время четко определилась возможность использования их для гидролиза склеропротеи-нов [2]. Полученные белковые гидролизаты находят широкое применение в медицинских, косметических и пищевых целях.
Поиск новых продуцентов кератинрасщепляющих протеаз вызван необходимостью создания промышленной технологии переработки кератинового сырья с применением ферментов определенной специфичности. Разнообразие продуцентов кератинрасщепляющих протеаз дает возможность получения комплексных и индивидуальных препаратов ферментов с самыми различными свойствами.
Среди микроорганизмов, по-видимому, только патогенные грибы (дерматофиты) и отдельные виды бактерий и актиномицетов обладают способностью вырабатывать внеклеточные, ферменты, разрушающие белки кератинов [3-5].
Продуценты кератинрасщепляющих протеаз часто встречаются среди почвенных микроорганизмов [6]. Активные штаммы обнаружены среди представителей розовой и бурой групп актиномицетов [7]. Отмечено [8], что актиномицеты обладают высокой (0,84-1,81 Е/мл) протеолитической активностью. Такие штаммы относятся к группам СЧоЫврошз и Спэеш.
Низкой активностью обладают штаммы из групп ОНуасеиБ, СоеНсоюг и АГош.
Цель настоящей работы - изыскание активного продуцента кератинрасщепляющих протеаз среди актиномицетов.
Для этого исследовали актиномицеты из групп киЬго-аигаппасиБ, Сгоп^епеэ, РгасНае и СпБеив. Штаммы культур были получены из музея отдела чистых культур Государственного научного центра антибиотиков и Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов. Чистые культуры актиномицетов поддерживали на плотных питательных средах с картофельными агарами.
Выращивание актиномицетов проводили глубинным способом в два этапа. На первом этапе готовили водно-споровую суспензию из 20-суточной чистой
культуры штамма и вносили ее в количестве 2% к объему питательной среды, состав которой был следую-
щим, %:
Крахмал растворимый 2,0 ,
Соевая мука 2,0
(>Ш4)2504 0,3
ЫаС1 0,25
• ? : ' • • “.і
КН2Р04 0,05
СаСОз 0,3
Посевной материал готовили в колбах емкостью 750 мл на лабораторной качалке при 180 об/мин, температуре 28-30°С, pH 7,4 в течение 48 ч до образования вегетативного мицелия; отношение объема среды к объему колбы 1 : 7,5.
На втором этапе осуществляли собственно культивирование продуцента с целью получения протеаз. Для этого питательные среды вносили в качалочные колбы с соотношением среды и колбы 1 : 7,5 и засевали вегетативным мицелием культуры, полученной на первом этапе; объем засевной культуральной жидкости составлял 5% к объему питательной среды. Исходное значение pH среды устанавливали с помощью 1 н. раствора ИаОН.
Культивирование актиномицетов осуществляли на питательной среде с компонентным составом, %:
Роговая мука 0,5
Крахмал растворимый 2,0
Янтарная кислота •; к .; -т - 0,4
КН2Р04 ' 0,045
(ЫН4)250 4 0,065
гп804 0,002
!с80. ........ ..’ 0,001
N^04 ; Г-: 0,090
Актиномицеты выращивали при 28°С в течение 168 ч. Исходное значение pH среды составляло 7,2-7,4. Для получения вегетативного мицелия использовали споровый материал, содержащий 108спор/мл, так как по данным [ 9] большая концентрация спор сокращает время ферментации на 23 ч и применение вегетативного мицелия вместо спор приводит к возрастанию протеолитической активности в 1,5 раза.
Затем культуральную жидкость отделяли от Мицелия центрифугированием (3500^000 об/мин), а надо-садочную жидкость - фильтрованием. В. фильтрате определяли протеолитическую активность (ПА) модифицированным методом Ансона с применением субстрата казеината натрия [10] и кератиназную активность (КА).
Таблица
Наименование культур Номера штам- мов Конечное значение pH ПА-10'3, ел./мл КА, мкг/мл
S. purpurascens 516 8,2 0 0
S.roseus 1088 8,5 0 0
S. spororaveus А-318 8,6 0 . 0
S. fradiae 400 6,3 2 15
S. variabiiis 1095 7,7 6 89
S. griseolus 402 7,9 8 104
S.inkanus A-204 8,9 8 109
S.fradiorectus A-154 8,0 8 118
S. umbrinus 1283 8,5 8 121
S.lanatus 1055 8,2 12 161
S. rubescens 696 8,3 12 164
S. aurantiacus 1209 8,1 13 177
S. glomeroaurantiacus 1341 8,4 15 208
S. fungilytitus A-164 8,2 16 236
S. chromogenes 1335 7,7 19 275
S. capuensis 1216 8,0 27 382
S. roseochromogenes 1272 8,3 . 29 418
S. griseoaurantiacus 1342 8,2 35 517
S. galilaens 1361 8,3 35 518
S.purpurascens 1269 8,4 37 573
S. misakiensis 1166 8,3 41 609
S. althioticus 1005 6,9 47 683
S. filamentosus 1034 8,0 102 1583
S. microflavus 420 8,5 140 2100
S. roseolilacinus 1085 8,5 200 3018
S. microflavus 1254 8,6 247 606
S. fradiae 1040 8,6 264 3941
S. griseolus 1044 8,7 293 4464
S. roselus 1086 8,9 317 4697
S. roseofulvus 1084 8,1 339 5029
S. fradiae A-150 8,7 350 5201
S.daghestanicus 1028 8,8 419 6315
S. pseudofradiae А Л*7А / \J 8,7 509 7834
S. fradiospiralis A-157 8,6 520 7956
Для определения последней брали 200 мг измельченной шерсти, предварительно промытой хлороформом и водой, затем высушенной на воздухе. Добавляли 10 мл 0,5 М боратного буфера pH 9,0, содержащего количество фермента, эквивалентное 0,02 единицы общей ПА; энергично встряхивали и оставляли на 3 ч при 37°С для гидролиза кератина. Одновременно ставили два контроля: на растворение шерсти в буфере и На содержание растворимого белка в культуральной жидкости. По калибровочной кризои, построенной по растворам сывороточного альбумина, определяли количество расщепленного белка (мкг/мл культуральной жидкости) за I ч гидролиза. Описанный метод анало-
гичен использованному при определении активности кератиназы из Streptomyces fradiae [11].
Данные поиска продуцента кератинрасщепляющих протеаз (таблица) показывают, что все исследуемые штаммы, за исключением S.purpurascens 516, S. roseus 1088 и S. Spororaveus А-318, в той или иной степени обладают способностью к синтезу кератинрасщепляющих протеаз. Наиболее активными продуцентами являются представители группы Fradiae: S. fradiospiralis А-157, S. pseudofradiae А-270, S. daghestanicus 1028, S. fradiae A-150, S. roseofulvus 1084, S. rozelus 1086.
Штаммы группы Chromogenes синтезируют ферменты с активностью в диапазоне 89-4464 мкг/мл. Ак-тиномицеты из групп Rubro-aurantiacus и Griseus имеют незначительную активность или же не секретируют внеклеточных протеаз (штаммы 516, 1088, А-318). Во всех исследуемых опытах наблюдалась корреляция между общей ПА и КА.
Максимальной способностью к синтезу кератинрасщепляющих протеаз обладает штамм Streptomyces fradiospiralis ВКМА-157 из группы Fradiae. Общая ПА его составляет 520T0'J ед/мл, КА - 7956 мкг/мл.
Морфологические и культуральные признаки: спо-рангиеносцы с примитивными спиралями, имеющими 0,5-1,0 завиток на концах. Споры овальные, продолговатые. Колонии бесцветные, иногда имеют слабо-розоватую окраску. Воздушный мицелий розовый. Желатину разжижает, крахмал гидролизует, нитратов не восстанавливает, на клетчатке растет хорошо. Актино-мицет изолирован из почв, мезофильный, с оптимумом температуры около 28°С [12]. . .. .•
Таким образом, в результате изучения протеолити-ческой активности ряда актиномицет, выбран наиболее активный продуцент протеаз - штамм Streptomyces fradiospiralis ВКМА-157. Отмечена корреляция между протеолитической и кератиназной активностями.
ЛИТЕРАТУРА
1. Грачева И.М. Технология ферментных препаратов. -Пищевая пром-сть, 1975. - 392 с.
2. Волик В.Г. Биотехнологический способ выработки пищевого, лечебного и косметического белка // Мясная индустрия. -1999. - № 4. - С. 36-38.
3. Grappel S.F., Blank F. Role of Keratinases in Dermatophytosis // Dermatologica. - 1972,- 145.- P. 245-255.
4. Me Quade A.B. Microbiological degradation of woo! // Dermatologica. 1964. - 128. - 4. - P. 249-266.
5. Долидзе Д.А., Патарая Д.Т., Турманидзе Ц.С., Квеси-тадзе Г.И. Отбор продуцентов протеолитических ферментов у ак-тиномицетов//Микробиология. - 1983. - 52. - Вып. 1. - С. 83 -86.
6. Кунаева А.Г., Гешева РЛ., Таптикова С.Д., Красил-ников Н.А. За някои особенности на актиномицетите от розовата группа//Изв. Микробиол. ин-тБълг.АН. - 1963. - 15. - С, 59-62.
7. Влахов С.С. Биосинтез кератинолитических ферментов почвенными актиномицетами//Докл. Болгарской АН. - 1979. - 32. -5.-С. 655-658.
8. Репечкене Ю.П., Лугаускас А.Ю., Амоитене М.М. Протеолитическая активность аггиномицегов, выделенных из син-
тетических полимерных материалов // Экология микроорганизмов и продукты их обмена. - Вильнюс. 1983. - С. 79-82.
9. Яковлева М.Б., Усайте И.А. Влияние посевного материала и условий культивирования на протеолитическую активность Т'пегтоасипотусе$ уи1ёаги> РА П 4 а // Прикл. биохимия и микро-биол. - 1981. - 17. - Вып. 1. - С, 96-101.
10. ГОСТ 20264.2-74. Препараты ферментные. Метод определения протеолитической активности. - М.: Изд-во стандартов, 1975.
11. Nickerson W.J., Noval J.J., Robison R.S. Keratinase. 1. Properties of the ensime conjugate elaborated by strcptomyces fradiae // Biochem. Biophys. Acta. - 1963. - 77. - P. 73 - 86.
12. Красильников H.A. Лучистые грибки. - M: Наука, 1970. - 534 с.
Кафедра технологии мяса и мясных продуктов . •
Поступила 06.12.01 г.
663.53.002.2
* ВЛИЯНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ОБРАБОТКИ ' ; ВОДНО-СПИРТОВЫХ СМЕСЕЙ И ДУБОВОЙ ДРЕВЕСИНЫ ;
НА ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПОНЕНТОВ ВИСКИ ,
С. В. ВОСТРИКОВ, И. В. НОВИКОВА
Воронежская государственная технологическая академия
Ускоренное созревание крепкоалкогольных спиртных напитков может быть достигнуто с помощью искусственных приемов старения, таких как озонирование и ультразвуковая обработка [1].
Химическая и термическая обработка древесины дуба - основного источника образования соединений, формирующих специфический букет и аромат спиртных напитков, оказывает существенное влияние на изменение состава и качества полученных из нее экстрактов [2].
Исследовали влияние способа обработки дубовой древесины и действия ультразвука на интенсивность экстрагирования из нее веществ, а также воздействие озона на состав и количество примесей в водно-спиртовой смеси, используемой для настаивания. Проводили сравнивание экстрактов эталонного образца виски и полуфабрикатов по содержанию примесей и органолептическим показателям.
Для экстракции веществ из дубовой стружки использовали спирт-сырец, полученный из зернового сырья, разбавленный дистиллированной водой до крепости 50% об.
Дубовую стружку получали из наружных слоев древесины дуба черешчатого. Фракции частиц с размерами 1,5-2,5 мм выделяли путем рассева стружки на ситах. Экстракцию веществ проводили из древесных частиц, обработанных различными способами, и из повторно используемой стружки, которую получали следующим образом: необработанную стружку заливали водно-спиртовым раствором с концентрацией спирта 60% об., выдерживали в течение 10 сут, затем отделяли от раствора и высушивали в сушильном шкафу при температуре 120°С. При термической обработке стружку выдерживали в течение 24 ч при температуре 140°С в сушильном шкафу, затем вымачивали в горячей воде, сушили, снова обрабатывали в течение 30 ч при температуре 140°С. Химическую обработку стружки производили в течение 1 ч горячим 1%-м рас-
твором кальцинированной соды, затем выдерживали ее в 2%-м растворе серной кислоты в течение 1-2 ч, после чего промывали сначала горячей, затем холодной водой [3].
Массовая концентрация дубовой стружки в вод-но-спиртовом растворе составляла во всех опытах 2%.
Для озонирования сортировки применяли экспериментальную установку, обеспечивающую контроль подачи и количества озона. При исследовании влияния ультразвуковых колебаний на показатели настоев использовали ультразвуковой диспергатор УЗДН-2Т.
Качественное и количественное содержание примесей определяли на лабораторном хроматографе ЛХМ-80 [4].
Об эффективности извлечения веществ из дубовой стружки судили по цветности экстрактов, которую определяли фотоэлектроколориметрическим методом. Профильтрованный образец экстракта помещали в кювету на 5 мм и измеряли оптическую плотность на ФЭК-56 со светофильтром № 4 при длине волны 440 нм. По калибровочной кривой, характеризующей зависимость оптической плотности от концентрации раствора йода, определяли цветность экстракта в см' 0,1 н. раствора йода на 100 см3 экстракта [5].
Эксперименты проводили при температуре 45°С, ультразвуковую обработку экстрактов осуществляли с частотой 22 кГц каждые 30 мин в течение 5 мин. После залива дубовых стружек водно-спиртовым раствором производили предварительное настаивание в течение 16 ч без ультразвуковой обработки.
Результаты показывают (табл. 1), что при использовании ультразвука процесс экстракции проходит с большей интенсивностью. При обычном настаивании на необработанной стружке максимальное значение цветности наблюдали на 10-е сут. При настаивании с применением ультразвука процесс экстракции завершился через 10 ч. За счет обработки ультразвуком происходят увеличение взаимодействия между веществами, содержащимися в древесине, и спиртом, а также
