CC BY
13
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 539-022.532:539.2:575.224.4 DOI 10.24411/0235-2516-2018-10075
ОЦЕНКА МУТАГЕННЫХ И АНТИМУТАГЕННЫХ СВОЙСТВ НАНОСТРУКТУРНОГО ФОСФОРИТА - КОМПОНЕНТА КОМПЛЕКСНОГО УДОБРЕНИЯ
1И.А. Дегтярева, д.б.н., 2Э.В. Бабынин, к.б.н., 1Т.Ю. Мотина, к.б.н., 1А.Я. Давлетшина, к.с.-х.н., 1И.А. Яппаров, д.б.н.
1 Татарский научно-исследовательский институт агрохимии и почвоведения ФИЦКазанский научный центр РАН, e-mail: niiaxp2@mail.ru 2Казанский (Приволжский) федеральный университет, e-mail: public.mail@kpfu.ru
Мутации являются первым существенным шагом в процессе канцерогенеза, поэтому тесты на мутагенность должны широко использоваться для выявления мутагенов/канцерогенов. В статье представлен материал об оценке эффектов, вызванных наноструктурным фосфоритом на мутационный процесс у штаммов Salmonella typhimurium. В настоящем исследовании использованы штаммы S. typhimurium TA1535, TA1538, без метаболической активации. Полученные данные по оценке мутагенных свойств нанофосфорита в тесте Эймса указывают на то, что тестируемое вещество не повышает частоту ни мутаций замены пар оснований у штамма TA1535, ни типа сдвига рамки считывания у штамма TA1538. Следовательно, нанофосфорит не обладает мутагенной активностью. Кроме того, полученные данные свидетельствуют о наличии антимутагенной активности в отношении этилметансульфоната и 2,4-динитрофенилгидразина (38,0 и 60,0% при концентрации 200,0 мкг/мл соответственно). Результаты SOS-lux теста с использованием S. typhimurium TA1535/pDEW238 свидетельствуют об отсутствии ДНК-повреждающих свойств у нанофосфорита. Таким образом, в тесте Эймса и SOS-lux тесте показано отсутствие мутагенных свойств наноструктурного фосфорита, поэтому его можно считать безопасными для окружающей среды и использовать по агропромышленному назначению, в частности, в качестве компонента комплексного удобрения.
Ключевые слова: наноструктурный фосфорит, тест Эймса, SOS-lux тест, мутагенная активность, биобезопасность.
ESTIMATION OF MUTAGENIC AND ANTIMUTAGENIC PROPERTIES OF NANOSTRUCTURED PHOSPHORUS - COMPONENT OF COMPLEX FERTILIZER
lDr.Sci. I.A. Degtyareva, 2Ph.D. E.V. Babynin, lPh.D. T.Yu. Motina, lPh.D. A.Ya. Davletshina, lDr.Sci. I.A. Yapparov
lTatar Scientific Research Institute of Agrochemistry and Soil Science, FRC Kazan Scientific Center, Russian Academy of Sciences, e-mail: niiaxp2@mail.ru 2Kazan (Volga region) Federal University, e-mail: public.mail@kpfu.ru
Mutations are the first significant step in the carcinogenesis process, so mutagenicity tests should be widely used to detect mutagens/carcinogens. The article presents the material on the estimation of the effects of nanostructured phosphorite on the mutation process in the strains of Salmonella typhimurium. In this study, strains S. typhimurium TA1535, TA1538, without metabolic activation were used. The data concerning the estimation of mutagenic properties of nanophosphate in the Ames test indicate that the test substance does not increase the frequency nor the mutation of base-pair substitutions at the TA1535 strain, no type of shift reading frames from strain TA1538. Consequently, nanofactory does not possess mutagenic activity. In addition, the data indicate the presence of antimutagenic activity against ethylme-thanesulfonate and 2,4-dinitrophenilhydrazine (38,0 and 60,0% at a concentration of 200.0 ng/ml, respectively). Results of SOS-lux test using S. typhimurium TA1535/pDEW238 indicate the absence of DNA-damaging properties of nanophosphate. Thus, in the Ames and SOS-lux test, the test shows the absence of
mutagenic properties of nanostructured phosphorite, so it can be considered safe for the environment and used for agro-industrial purposes, in particular, as a component of complex fertilizer.
Keywords: nanostructured phosphorite, Ames test, SOS-lux test, mutagenic activity, biosafety.
Агрономические руды, эффективность применения которых заключается в комплексном воздействии на почву и растения целым рядом макро-, микроэлементов, являются перспективными в решении многих проблем - восполнения недостатка фосфорного питания у растений, известкования кислых почв и др. Помимо этого, являясь недорогими и натуральными компонентами, они не оказывают негативного воздействия на почвенную среду. Расположенная в Среднем Поволжье Республика Татарстан обладает большими запасами различных агроруд.
Нанотехнологии перспективны в создания безопасных средств защиты и стимуляторов роста растений. Так, экологически безопасная наноразмерная сера по антифунгальным свойствам не уступает большинству известных и распространенных препаратов, а по рострегулирующим свойствам их превосходит [1]. Возможность замены традиционных бентонитовых глин на экологически безопасный наноразмерный бентонит представлена в работе A.M. Ежковой с соавторами [2]. При модификации питательных сред использование наноструктурного фосфорита в качестве источника питания оказывает высокий стимулирующий эффект на численность микроорганизмов - диазотрофных в 16,7, фосфатмо-билизующих бактерий - в 10,4 раза [3].
Биотехнологии с использованием микроорганизмов обеспечивают повышение урожаев путем регуляции поступления в растения питательных веществ [4, 5]. Поэтому на основе перспективного консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов и наноструктурного фосфорита нами создается комплексное удобрение. Однако любые соединения перед внедрением в сельскохозяйственное производство должны проверяться на наличие или отсутствие токсичности и генотоксич-ности для окружающей среды и человека.
Использование бактериальных тест-систем позволяет быстро и с высокой степенью надежности получать сведения о мутагенном потенциале тестируемых материалов. В настоящее время для проверки мутационной активности на биобезопасность существует много методов. При этом в качестве индикатора используют различные биологические объекты, однако наиболее широко применяются бактериальные тест-системы [6, 7], что обусловлено преимуществом микроорганизмов перед другими объектами: хорошая изученность генетического аппарата; высокая скорость размножения; экономичность экспериментов; возможность регистрации типа мутаций и механизма ее возникновения; высокая чувствительность штаммов; разнообразие тест-объектов: представители раз-
личных групп прокариот и низших прокариот; единая химическая организация нуклеиновых кислот как в клетках прокариот, так и эукариот.
Цель исследования - выявление и количественная оценка потенциальной генотоксичности нано-структурного фосфорита, являющегося компонентом комплексного удобрения.
Объекты и методы исследования. Нанострук-турный фосфорит получен методом ультразвукового диспергирования в научно-исследовательском инновационно-прикладном центре «Наноматериалы и нанотехнологии» г. Казани [8].
Мутагенную активность нанофосфорита исследовали методом теста Эймса [9] с использованием индикаторных штаммов Salmonella typhimurium TA1535 (генотип hisG46 rfa uvrB) и S. typhimurium TA 1538 (генотип hisD3052 rfa uvrB), имеющих мутации в генах гистидинового оперона, в результате чего бактерии не могут расти на среде без гистидина. Присутствие мутагенного агента может вызвать обратные мутации и привести к появлению прототрофных ревертантов. Штамм TA1535 содержит мутацию замены пары оснований в гене hisG, что ведет к аминокислотной замене лейцина на пролин. Штамм TA1538 имеет деле-цию одной пары оснований в гене hisD, что вызывает мутацию типа сдвига рамки считывания. Это приводит к изменению двух аминокислот и появлению стоп-кодона внутри гена. Для реверсии к His+ фенотипу у этих штаммов необходимы различные молекулярные изменения в гене. Поскольку различные мутагены могут оказывать свое влияние на ДНК через разные механизмы, то использование штаммов, содержащих мутации, позволяет определить мутагены, которые имеют влияние на ДНК.
Ночную культуру S. typhimurium (109 кл/мл) в 0,015 М фосфатном буфере (рН 7,4) инкубировали с тестируемым соединением (наноструктурный фосфорит) в различных концентрациях (от 0,4 до 200,0 мкг/мл) при 37°С 90 минут без встряхивания. После инкубации в пробирки добавляли 2,5 мл расплавленного верхнего агара (0,6% агара, 0,6% NaCl, 0,05 мМ L-гистидина, 0,05 мМ биотина, рН 7,4 при 45°С), смесь наносили на минимальную агаризованную среду (1,5% агара, среда Фогеля-Боннера, содержащая 2,0% глюкозы) и инкубировали при 37°С в течение 66 ч. После этого подсчитывали число колоний His+ - ревертантов, выросших на поверхности агара. В качестве позитивного контроля использовали этилметансульфонат (ЭМС) для штамма TA1535 и 2,4-динитрофенилгидразин (ДНФГ) - для штамма ТА1538. Согласно методике, мутагенной считается концентрация тестируемого вещества, при которой число ревертантов в опыте будет выше
контрольных значений более чем в два раза. Эксперименты проводили в трех повторностях.
Для оценки индукции SOS-ответа использовали индикаторный штамм S. typhimurium TA1535/pDEW 238, способный к биолюминесценции в ответ на ДНК-повреждающие агенты. Штамм получен в результате трансформации штамма S. typhimurium ТА1535 плазмидой pDEW238, которая содержит luxCDABE - оперон под контролем recA промотора. Плазмида предоставлена Rachel Rozen (The Hebrew University of Jerusalem, Израиль). Ночную культуру штамма, выращенную в питательном бульоне с ампициллином (100,0 мкг/мл), разделяли на пробирки и добавляли в каждую раствор наноструктурного фосфорита в различных концентрациях. В качестве позитивного контроля использовали митомицин C [10]. Через каждый час по 0,1 мл культуры переносили в микропланшеты и определяли интенсивность биолюминесценции с помощью микропланшетного ридера Infinité® Pro200, Tecan (Австрия). Для каждой концентрации в каждой точке времени брали три пробы. Интенсивность биолюминесценции измеряли в относительных световых единицах (Relative Light Units, RLU), рассчитанных как число световых единиц в секунду, деленное на оптическую плотность клеточной культуры (OD) при 550 нм.
Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы Microsoft Excel 2000.
Результаты. Тесты на мутагенность должны широко использоваться для выявления мутагенов/канцерогенов, так как мутации являются первым существенным шагом в процессе канцерогенеза. В настоящем исследовании использованы штаммы S. typhimurium TA1535, TA1538, без метаболической активации.
Полученные данные по оценке мутагенных свойств наноструктурного фосфорита представлены на рисунках 1 и 2. Результаты теста Эймса указывают на то, что тестируемое вещество в концентрациях 100,0 и 200,0 мкг/мл в агаризованной среде не повышает частоту ни мутаций замены пар оснований у ТА1535, ни типа сдвига рамки считывания у штамма ТА1538. Следовательно, нанофосфорит не обладает мутагенной активностью.
В экспериментах, по определению антимутагенной активности нанофосфорита в тесте Эймса использованы соответствующие для каждого штамма мутагены. Результаты также представлены на рисунках 1 и 2. Полученные данные свидетельствуют о наличии у наноструктурного фосфорита антимутагенной активности в отношении этилметансульфо-ната (38,0% при концентрации 200,0 мкг/мл) (рис. 1).
Результаты эксперимента в присутствии нанофос-форита со штаммом ТА1538 (рис. 2) показывают наличие более сильной антимутагенной активности в отношении 2,4-динитрофенилгидразина (60,0% при концентрации 200,0 мкг/мл, различия достоверны).
Следующим этапом исследований стало изучение влияния наноструктурного фосфорита на индукцию SOS-ответа. Плазмида pDEW238, которая была внесена в штамм TA1535, содержит гены биолюминесценции ¡ихСВАБЕ под контролем гесА промотора, который активируется при запуске SOS-ответа, когда в клетке появляются разрывы ДНК. Интенсивность биолюминесценции, таким образом, отражает степень активации генов SOS-ответа в бактериальной культуре.
Вначале установили оптимальное время для определения индукции SOS-ответа. Динамика био-
Рис. 1. Влияние наноструктурного фосфорита на число генных мутаций у штамма ТА1535 Salmonella typhimurium
По оси ординат: среднее число His+ - ревертантов на чашку Петри. По оси абсцисс: ПК - позитивный контроль (ЭМС, 1,0 мкг/мл); +М - наноструктурный фосфорит + ЭМС.
Рис. 2. Влияние наноструктурного фосфорита на число генных мутаций у штамма ТА1538 Salmonella typhimurium
По оси ординат: среднее число His+ - ревертантов на чашку Петри. По оси абсцисс: ПК - позитивный контроль (ДНФГ, 20,0 мкг/мл); + М - наноструктурный фосфорит + ДНФГ.
Рис. 3. Динамика активности генов SOS-ответа штамма TA1535/pDEW238 Salmonella typhimurium в присутствии наноструктурного фосфорита (200,0 мкг/мл) и мутагена - митомицина С
Нанофосфорит
..Uli!
lllllllllll
400 200 100 50 25 12,5
1,5 0,75 К
Рис. 4. Интенсивность биолюминесценции штамма TA1535/pDEW238 Salmonella typhimurium при различных концентрациях наноструктурного фосфорита
люминесценции штамма TA1535/pDEW238 представлена на рисунке 3. Согласно полученным результатам интенсивность биолюминесценции тестерного штамма в контроле нарастает в течение 5 часов с момента переноса на свежую среду и далее существенно не меняется. Данные показаны в сравнении со стандартным мутагеном митомицином С, под действием которого биолюминесценция непрерывно продолжает увеличиваться в течение 7 часов, и уже за 5 часов инкубации существенно отличается от контроля.
Далее с помощью SOS-lux теста мутагенную активность нанофосфорита анализировали на 6-ом часу инкубации в диапазоне концентраций 0,75-400,0 мкг/мл (рис. 4). Установлено, что тестируемое вещество не показывает достоверных отличий с контро-
В результате проведенных исследований определена безопасность применения наноструктурного фосфорита с использованием бактериальных тест-систем. У него установлено отсутствие мутагенных и генотоксичных свойств. Воспроизводимость результатов подтверждается двумя различными бактериальными тестами (тест Эймса и SOS-lux тест) на генотоксичность.
Таким образом, наноструктурный фосфорит в исследованиях на бактериальных тест-системах не проявил мутагенной активности. Поэтому его можно считать безопасными для окружающей среды и использовать по агропромышленному назначению, в частности, в качестве компонента комплексного удобрения.
лем в исследуемом диапазоне концентраций.
Литература
1. Массалимов И.А., Давлетшин Р.Д., Гайфуллин Р.Р., Зайнитдинова Р.М., Мусавирова Л.Р. Сравнение биологических свойств наночастиц серы и известных пестицидов // Башкирский химический журнал, 2013, Т. 20, № 3. - С. 142-144.
2. Ezhkova A.M., Yapparov A.Kh., Ezhkov V.O., Yapparov I.A., Sharonova N.L., Degtyareva I.A., Khisamutdinov N.Sh., Bik-kinina L.M.-Kh. Fabrication of nanoscale bentonite, study of its structure and toxic properties, and determination of safe doses // Nanotechnologies in Russia, 2015, Vol. 10, Issue 1-2. - Р. 120-127.
3. Дегтярева И.А., Хидиятуллина А.Я., Хисамутдинов Н.Ш., Шаронова Н.Л. Оценка влияния нативных и созданных на их основе наноразмерных веществ на рост коллекционных микроорганизмов / Перспективы использования новых форм удобрений, средств защиты и регуляторов роста растений в агротехнологиях сельскохозяйственных культур: Мат-лы 8-й Междунар. научн. конф. Москва-Анапа, 2014. - С. 97-99.
4. Дегтярева И.А., Ильясов М.М., Храмов И.Т. Микробиологический мониторинг почв агроценозов // Агрохимический вестник, 2003, № 4. - С. 30-32.
5. Яппаров А.Х., Дегтярева И.А., Мотина Т.Ю., Давлетшина А.Я. Влияние комплексного биоудобрения на основе нано-структурной водно-фосфоритной суспензии и консорциума микроорганизмов при выращивании кукурузы // Агрохимический вестник, 2016, Т. 1, № 1. - С. 34-38.
6. Гераськин С.А., Сарапульцева Е.И., Цаценко Л.В., Глазер В.М., Абилев С.К. Биологический контроль окружающей среды: генетический мониторинг. - М.: Издательский центр «Академия», 2010. - 208 с.
7. Degtyareva I.A., Ezhkova A.M., Yapparov A.Kh., Yapparov I.A., Ezhkov V.O., Babynin E.V., Davletshina A.Ya., Motina T.Yu., Yapparov D.A. Production of Nano-Bentonite and the Study of Its Effect on Mutagenesis in Bacteria Salmonella typhimurium // Nanotechnologies in Russia, 2016, Vol. 11, Issue 9-10. - Р. 663-670.
8. Ежков В.О., Яппаров А.Х., Нефедьев Е.С. Наноструктурные минералы: получение, химический и минеральный составы, структура и физико-химические свойства // Вестник Казанского технологического университета, 2014, Т. 17, № 11. - С. 41-45.
9. Maron D.M., Ames B.N. Revised methods for the Salmonella mutagenicity test // Mutat. Res., 1983, Vol. 113. - Р. 173-215.
10. Davidov Y., Rozen R., Smulski D.R. Improved bacterial SOS promoter∷ lux fusions for genotoxicity detection // Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, 2000, V. 466 (1). - Р. 97-107.
