CC BY
30
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЯ / PHYSICOCHEMICAL BIOLOGY Оригинальная статья / Original article УДК 579.695; 546.85; 502.55; 661.63 DOI: http://dx.doi.org/10.21285/2227-2925-2019-9-1 -81 -94
Генотоксичность и цитогенетическое действие белого фосфора
© А.З. Миндубаев*, Э.В. Бабынин**, Е.К. Бадеева*, Д.Б. Пискунов***, А.Н. Махиянов***, С.Т. Минзанова*, Л.Г. Миронова*, А.Д. Волошина*
** Институт органической и физической химии им. А.Е. Арбузова ФИЦ Казанского научного центра РАН,
г. Казань, Республика Татарстан, Российская Федерация
** Казанский (Приволжский) федеральный университет,
г. Казань, Республика Татарстан, Российская Федерация
*** Казанский национальный исследовательский технологический университет,
г. Казань, Республика Татарстан, Российская Федерация
Резюме: В предыдущих исследованиях авторами настоящей статьи продемонстрирован метаболизм белого фосфора культурами грибов. Тем не менее, токсические свойства веществ имеют различную природу. Большой интерес представляет исследование генотоксичности - возможного источника мутаций. В представленной работе проведена оценка генотоксичности белого фосфора при помощи теста Эймса, которая показала ее отсутствие. Однако при всех преимуществах данного метода применения одного теста Эймса недостаточно для достоверной оценки геноток-сичности. Для этой цели используется целый ряд тестов, в том числе SOS-lux тест на ДНК-повреждающую активность. В представленной работе SOS-lux тест продемонстрировал генотоксичность белого фосфора. Несмотря на то, что величина ДНК-повреждающей активности оказалась низкой, этот результат получен впервые: во всех найденных источниках сообщается об отсутствии генотоксических свойств у белого фосфора. Поскольку генетический аппарат у прокариот устроен иначе, чем у эукариот (включая человека), то результаты исследований на сальмонеллах нельзя полностью переносить на человека. Помимо генных мутаций, исследуемых тестом Эймса и SOS-lux-тестом, имеющих общую природу у всех живых организмов, существуют геномные перестройки, которые следует изучать на эукариотах. Для этой цели подходит Allium тест на корешках лука репчатого (Allium cepa L.). В представленной работе впервые исследовано негативное влияние белого фосфора на клеточный цикл эукариот методом Allium теста. Установлено, что белый фосфор даже в очень низких концентрациях (около 0,01%) на порядок увеличивает количество хромосомных аберраций.
Ключевые слова: белый фосфор, генотоксичность, тест Эймса, Salmonella typhimurium, ДНК-пов-реждающая активность, SOS-lux-тест, эукариоты, хромосомные аберрации, клеточный цикл, Allium тест
Информация о статье: Дата поступления 27 июля 2018 г.; дата принятия к печати 4 марта 2019 г.; дата онлайн-размещения 29 марта 2019 г.
Для цитирования: Миндубаев А.З., Бабынин Э.В., Бадеева Е.К., Пискунов Д.Б., Махиянов А.Н., Минзанова С.Т., Миронова Л.Г., Волошина А.Д. Генотоксичность и цитогенетическое действие белого фосфора // Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. 2019. Т. 9, N 1. С. 81-94. DOI: 10.21285/22272925-2019-9-1-81-94.
Genotoxicity and cytogenetic effects of white phosphorus
© Anton Z. Mindubaev*, Edward V. Babynin**, Elena K. Badeeva*, Dmitriy B. Piskunov***, Ayrat N. Makhiyanov***, SalimaT. Minzanova*, Lyubov' G. Mironova*, Alexandra D. Voloshina*
* A.E. Arbuzov Institute of Organic and Physical Chemistry of Kazan, FRC Scientific Center,
Russian Academy of Sciences, Kazan, Republic of Tatarstan, Russian Federation
** Kazan (Volga region) Federal University, Kazan, Republic of Tatarstan, Russian Federation
*** Kazan National Research Technological University, Kazan, Republic of Tatarstan, Russian Federation
Abstract: In previous studies, the authors of this article demonstrated the metabolism of white phosphorus by fungal cultures. However, the toxic properties of substances are characterised by a different nature. Therefore, research into genotoxicity as a possible source of mutations appears to be of a great interest. In the present work, the genotoxicity of white phosphorus was evaluated using the Ames test, which showed its absence. However, despite all the advantages of this method, the sole Ames test cannot be considered to be a reliable assessment of genotoxicity. For this purpose, a number of tests are frequently used, including the SOS-lux test for DNA damaging activity. In the present work, the SOS-lux test did demonstrate the genotoxicity of white phosphorus. Although the value of DNA-damaging activity for this substance was low, this result was obtained for the first time: all available literature sources had thus far reported no genotoxic properties of white phosphorus. Since the genetic apparatus in prokaryotes is distinct from that in eukaryotes (including humans), the results of studies on Salmonella cannot be directly extrapolated to humans. In addition to gene mutations studied by the Ames and SOS-lux tests and characterised by a common nature in all living organisms, there are genomic rearrangements that should be studied on eukaryotes. For this purpose, the Allium test applied in onion roots (Allium cepa L.) is suitable. In the present study, a negative effect of white phosphorus on the cell cycle of eukaryotes was studied for the first time by the Allium test. Even at very low concentrations of about 0,01%, white phosphorus is established to increase the number of chromosomal aberrations by an order of magnitude. Keywords: white phosphorus, genotoxicity, Ames test, Salmonella typhimurium, DNA damaging activity, SOS-lux test, eukaryotes, chromosomal aberrations, cell cycle, Allium test
Information about the article: Received July 27, 2018; accepted for publication March 4, 2019; available online March 29, 2019.
For citation: MindubaevA.Z., Babynin E.V., Badeeva E.K., Piskunov D.B., Makhiyanov A.N., Minzanova S.T., Mironova L.G., Voloshina A.D. Genotoxicity and cytogenetic effects of white phosphorus. Izvestiya Vuzov. Prikladnaya Khimiya i Biotekhnologiya [Proceedings of Universities. Applied Chemistry and Biotechnology]. 2019, vol. 9, no. 1, pp. 81-94. (In Russian). DOI: 10.21285/2227-2925-2019-9-1-81-94.
ВВЕДЕНИЕ
Фосфор относится к распространенным элементам - содержание его в земной коре составляет 0,08-0,09%. Данный химический элемент имеет важнейшее значение в существовании абсолютно всех форм жизни. Человеческое тело на 1,1% состоит из фосфора, играющего в организме целый ряд ролей - от составной части костной ткани и эмали зубов до фосфолипидов клеточных мембран, наследственного материала нуклеиновых кислот и макроэргических молекул, без которых невозможен энергообмен. Большинство веществ вступают в метаболизм только в фосфорилированной форме.
Однако в природных условиях фосфор встречается почти исключительно в предельно окисленной форме - в виде фосфатов, солей фосфорной кислоты. В виде простого вещества, включающего ряд аллотропных модификаций, фосфор производится химической промышленностью [1].
Наиболее термодинамически неустойчивая и химически активная модификация фосфора - белый фосфор, является краеугольным камнем всей химии фосфора, поскольку легко образуется при пиролизе фосфорных минералов, сравнительно дешев и вступает в разнообразные химические превращения. Поэтому, игнорируя опасность обращения с белым фосфором (а он, между прочим, относится к веществам первого, наивысшего класса опасности!),
его производят на химических предприятиях крупнотоннажно и превращают в огромнейшее разнообразие продуктов - от красного фосфора и полупроводников до фосфорной кислоты и пестицидов.
Фосфор и его соединения находят широкое применение в металлургии (его добавка увеличивает прочность сплава), используются в производстве спичек, красок, синтетических моющих средств и препаратов для уничтожения насекомых-вредителей и многое др. (рис. 1). Хорошо известно использование фосфатных удобрений: фосфат как предельно окисленная форма фосфора является подкормкой для растений, он ускоряет их развитие, повышает урожайность (рис. 2, а). Нельзя не сказать о том, что специфические свойства белого фосфора сделали его основой для создания многих видов особо опасного оружия: авиабомбы, ручные гранаты, артиллерийские снаряды и др. При взрыве снаряда (бомбы) частички горящего шлака и фосфора, попадая на тело человека, прилипают и обугливают органические ткани, вызывая ожоги, страшные увечья и болезненную смерть. При контакте с кислородом белый фосфор воспламеняется и горит до тех пор, пока не сгорит полностью, выделяя при этом густой ядовитый дым, вызывающий спазм и ожоги дыхательных путей, и отравляя организм. От воздействия удушающего газа не спасут никакие укрытия, так как смесь способна прожечь броню и даже бетонные перекрытия, шансов выжить практически нет (рис. 2, Ь).
Рис. 1. Применение фосфора (коллаж А.З. Миндубаева) Fig. 1. The use of phosphorus (collage of A.Z. Mindubaev)
а b
Рис. 2. Многоликость фосфора: а - предельно окисленная форма фосфора - фосфат - является составной частью всех живых организмов, в том числе и этих цветов [http://atomprof.spb.ru]; b - однако в виде просто вещества фосфор смертельно опасен - взрыв фосфорной бомбы в секторе Газа [www.pinterest.co.uk]
Fig. 2. Different forms of phosphorus: а - phosphorus in its final oxidation state, phosphate remains an integral part of all living organisms, including these flowers [http://atomprof.spb.ru];b - However, phosphorus in the form of a simple substance is deadly. Explosion of phosphorus bomb in Gaza [www.pinterest.co.uk]
Метод биодеградации используется для очистки сточных вод уже целый век. Тем не менее еще лет двадцать-двадцать пять назад считалось, что способность к метаболизму ксенобиотиков у микроорганизмов очень ограничена, и большинство из них ими не используется. Но в настоящее время убедительно показана способность как аэробных, так и анаэробных микроорганизмов к деградации ксенобиотиков [2]. Согласно данным, приведенным в работе [3], посвященной обзору патентов в области биореме-диации, за период с 1990 по 2013 годы в мире
вышло 443 патента по этому направлению (имеются в виду только международные патенты). Из них более 60% приходится на США, 23% - на страны Азии, 10% - на европейские страны.
Настоящее исследование, как и предыдущие, результаты которых частично опубликованы в работах [4-6], посвящено микробиологическому превращению токсичнейшего элементного (белого) фосфора в биогенный фосфат. По сути выполненная авторами работа является первым задокументированным примером усвоения белого фосфора биосферой.
Одним из показателей токсичности вещества является его генотоксичность, т.е. повреждающее действие на ДНК, увеличивающее частоту мутагенеза и канцерогенеза. Одной из целей представленной работы стало исследование генотоксичности культуральной среды, содержащей белый фосфор и его метаболиты для более углубленного изучения их токсичности вообще.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Генотоксичность белого фосфора определялась при помощи теста Эймса по методике, описанной в работе [7]. В тесте были использованы индикаторные штаммы Salmonella typhi-murium TAI 535 (генотип hisG46 rfa uvrB), TA1538 (генотип hisD3052 rfa uvrB). Штаммы имеют мутации в генах гистидинового оперона, в результате чего бактерии не могут расти на среде без гисти-дина [8, 9]. Однако, если мутагенный агент присутствует, он может вызвать обратные мутации, что приводит к появлению прототрофных ревер-тантов.
Штамм TA1535 содержит мутации в гене hisG, что приводит к аминокислотной замене лейцина на пролин (мутация замены пары оснований). Штамм TA1538 имеет делецию 1 пары оснований в гене hisD, что вызывает мутацию типа сдвига рамки считывания. Это приводит к изменению двух аминокислот и появлению стоп-кодона внутри гена. Таким образом, реверсии к His+ фенотипу у этих штаммов требуют различных молекулярных изменений в гене. Так как различные мутагены могут оказывать свое влияние на ДНК через разнообразные механизмы, то использование штаммов, содержащих разные мутации, позволяет определить мутагены, которые имеют различное влияние на ДНК. Тест Эймса: ночную культуры Salmonella typhimurium (109 клеток/мл) в 0,015 М фосфатном буфере (рН=7,4) инкубировали с тестируемым соединением в диапазоне концентраций при 37 °С 90 мин без встряхивания. После инкубации 2,5 мл расплавленного верхнего агара (0,6% агара, 0,6% NaCl, 0,05 мМ L-гистидина, 0,05 мМ биотина, рН 7,4 при 45 °С) добавляли в пробирки, смесь наносили на минимальную ага-ризованную среду (1,5% агар, среда Фогеля-Боннера, содержащая 2% глюкозы) и инкубировали при 37 °С в течение 66 ч. После этого срока подсчитывали число колоний His+ ревер-тантов, выросших на поверхности агара. В качестве позитивного контроля использовали 2,4-динитрофенилгидразин (ДНФГ) для штамма ТА1538, и этилметансульфонат (ЭМС) - для TA1535. Согласно методике, мутагенной считается та концентрация тестируемого вещества, когда число ревертантов в опыте будет выше контрольных значений более чем в два раза. Все эксперименты проводили в трех повторностях.
Для проведения SOS-lux-теста на генотоксичность использовались две среды. Одна из
них та же, что и в работе [10]. Эта среда хранилась в замороженном состоянии (-10 °С) 226 суток. Вторая среда передана на кафедру генетики Казанского федерального университета через несколько часов после приготовления. Затем она 12 дней хранилась в замороженном виде, в пробирке Эппендорфа. Генотоксичность первой среды исследовалась ранее при помощи теста Эймса на повышение частоты мутаций, возвращающих способность синтезировать гистидин у ауксотрофных штаммов Salmonella typhimurium. SOS-lux-тест позволяет напрямую определять ДНК-повреждающую активность веществ, т.е. служит дополнением к тесту Эймса, уточняющим оценку генотоксичности. Об активности SOS-регулона в SOS-lux-тесте судят по степени биолюминесценции. Для оценки индукции SOS-ответа использовали индикаторный штамм S. typhimurium TA1535/pDEW238, способный к биолюминесценции, в ответ на ДНК-повреждающие агенты. Штамм получен в результате трансформации штамма S. typhimurium ТА1535 плазмидой pDEW238, которая содержит luxCDABE - оперон под контролем recA промотора. Плазмида предоставлена Rachel Rozen (Израиль).
Эксперимент был выполнен, как описано в работе [11]. Делали серию разведений среды, содержащей вначале 0,2% белого фосфора (2000 мкг/мл). Полученную среду смешивали пополам с культурой сальмонелл, при этом концентрация падала до 1000 мкг/мл. С этой концентрации начинали измерение общей токсичности и генотоксичности. В конце серии разведений доводили концентрацию Р4 до 1 мкг/мл (0,0001%). Ночную культуру штамма, выращенную в питательном бульоне с ампициллином (100,0 мкг/мл), вносили в планшеты по 0,1 мл в лунку и добавляли в каждую раствор среды с Р4 в различных концентрациях. В работе использованы планшеты Greiner GR-675090. В качестве позитивного контроля выступил митомицин C [12]. Интенсивность биолюминесценции определяли с помощью микропланшетного ридера Infinite F200 Pro, Tecan (Австрия). Для каждой концентрации в каждой точке времени брали три пробы. Интенсивность биолюминесценции измеряли в относительных световых единицах (ОСЕ), рассчитанных как число световых единиц в секунду, деленное на оптическую плотность клеточной культуры (OD) при 550 нм.
Повторный SOS-lux-тест провели со свежеприготовленной средой (0,2% Р4). Методика аналогичная, но в качестве позитивного контроля использовали, помимо митомицина C, пе-роксид водорода в концентрации, в которой наблюдается наиболее выраженный мутагенный эффект (около 0,03%).
Перед проведением теста среды встряхивали, чтобы черный осадок на дне тоже был вовлечен в тестирование.
Для оценки цитогенетического действия фос-
фора в качестве тест-объекта использовали лук репчатый (Allium cepa). Предварительно отобранные стандартные луковицы проращивали в течение 2-3 дней в стеклянных стаканах. Когда длина корешков достигала 1 см (это условие выполняется для проверки способности луковиц к прорастанию), опытные луковицы на 48 ч помещали в стаканчики объемом 50 мл с белым фосфором в различной концентрации. В качестве контроля использовали отстоянную отфильтрованную водопроводную воду. Затем корешки отрезали ножницами на 1 см от кончика и помещали в фиксатор Кларка (смесь этилового спирта (95%) и ледяной уксусной кислоты в соотношении 3:1). Фиксатор мгновенно останавливает жизнедеятельность, в том числе клеточные циклы. Материал хранили при температуре 4 °С. Окрашивание проводили кармином (окрашивание в оранжевый цвет) или ор-сеином (красно-фиолетовый цвет), выдерживая фиксированные корешки в ступке с красителем, подогреваемой пламенем спиртовки. Препарат на стекле получали раздавливанием окрашенных корешков под грузом. Анализ клеток корневой меристемы проводили на микроскопе Axio Observer.A1 (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Германия) на временных давленых препаратах после окрашивания ацетокармином [13]. В каждом препарате учитывали общее количество клеток, количество делящихся клеток из зоны деления корешка, находящихся в той или иной стадии митоза. На основании полученных данных определили митотический индекс (MI), а также распределение клеток по стадиям митоза. Митотический индекс показывает отношение числа клеток, находящихся в митозе, к общему числу проанализированных клеток, и рассчитывается по формуле
MI, % = [[П+М+А+Т] /N]X100,
где [П+М+А+Т] - сумма клеток, находящихся на стадии профазы, метофазы, анафазы и тело-фазы соответственно1.
Частота хромосомных аберраций определялась как отношение суммы мутантных клеток с мостами, фрагментами и отставаниями хромосом в опытном варианте к общему количеству ана- и телофаз, выраженное в процентах (ана-телофазный метод учета хромосомных аберраций).
20 мл модифицированной культуральной
1
Прохорова И.М., Ковалева М.И., Фомичева А.Н. Генетическая токсикология: лабораторный
практикум. Ярославль: Изд-во Ярославского
государственного ун-та им. П.Г. Демидова,
2005. 132 с. / Prokhorova I.M., Kovaleva M.I.,
Fomicheva A.N. Geneticheskaya toksikologiya:
laboratornyi praktikum [Genetic toxicology: laboratory practicum]. Yaroslavl: P.G. Demidov Yaroslavl
State University Publ., 2005, 132 p.
среды Придхем - Готлиба с концентрацией белого фосфора 0,2% для проведения Allium теста готовили так же, как описано в методике [10].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В Токсикологическом профиле белого фосфора за 1997 год сообщается об отсутствии генотоксичности данного вещества2. Тест проводился на пяти ауксотрофных штаммах сальмонеллы - TA1535, TA1537, TA1538, TA98 и TAI00, и не выявил увеличение частоты мутаций. С целью проверки этих данных осуществили спот-тест (от англ. spot - пятно) - варианта теста Эймса, для качественного определения генотоксичности.
Первые же тестирования показали, что среда очень токсична для S. typhimurium TA1535 и TA1538. Они погибают в этой среде даже при ее разбавлении питательным мясным бульоном до 90%. В течение 1 ч плотность популяции падает с 2,47*108 клеток/50 мкл до 10 клеток/50 мкл. Это высокий показатель токсичности. При разбавлении бульоном до 50% через 1 ч исходная плотность популяции упала до 4*105 клеток/50 мкл.
Но при внесении капли среды объемом 10 мкл в чашку Петри с посевом сальмонеллы генотоксичность не наблюдалась (рис. 3, а). При разбавлении среды бульоном до концентрации 10% снижения жизнеспособности сальмонелл также не происходило, т.е. была достигнута субвитальная концентрация. При инкубировании в среде штамма ТА1535 в течение 1 ч число мутантов изменилось с 1,19 ± 0,29 до 1,310 ± 0,28. Различия недостоверны. При инкубировании в среде штамма ТА1538 в течение 1 ч число мутантов не возросло, а, напротив, упало с 10,09 ± 0,81 до 9,0 ± 0,72. В позитивном контроле с мутагеном 2,4-динитрофенилгидрази-ном их число выросло до 22,5 ± 3,1, т.е. генотоксичность у культуральной среды с белым фосфором и его метаболитами отсутствует.
На рис. 3, а представлена чашка с внесенными в нее 10 мкл культуральной среды (полоса в середине - неравномерное нанесение культуры). Как видно на фото, место внесения капли определить невозможно. Токсичность и генотоксичность не регистрируются. Если же вещество обладает генотоксичностью, вокруг него образуется ореол из мутантных колоний, что является типичной картиной (рис. 3, b).
При внесении в чашку с посевом большего объема культуральной среды (50 мкл) в месте падения капли образовалось пятно мертвых клеток (рис. 4, а). Несмотря на то что капля растеклась по дну чашки в круг диаметром 1 см, гибель клеток наблюдалась только в месте ее падения, т.е. токсичность среды проявилась
Toxicological profile for white phosphorus. U.S. Department of health and human services. USA. 1997. 248 p.
только в месте нанесения капли (пятно мертвых клеток в центре культуры).
В другую чашку было внесено 10 мкл препарата белого фосфора (WPh), раствора канамици-на (Kan) и раствора налидиксовой кислоты (N)
(рис. 4, Ь). Антибиотики образовали зону подавления роста клеток, у белого фосфора зоны подавления роста не наблюдалось (круги из му-тантных клеток вокруг капли, специфичные для теста Эймса, в данном случае не образовались).
a b
Рис. 3. Спот-тест на генотоксичность Fig. 3. Qualitative test for genotoxicity (spot-test)
a b
Рис. 4. В чашки с посевом внесено: а - 50 мкл культуральной среды;b - 10 мкл препарата белого фосфора (WPh), раствора канамицина (Kan) и раствора налидиксовой кислоты (N)
Fig. 4. а - 50 mcl of culture medium was added; b - applied 10 mcl of white phosphorous (WPh)solution, solution of kanamycin (Kan) and nalidixic acid (N)
Предположительно, такая картина наблюдается потому, что белый фосфор при нанесении на поверхность агаризованной среды быстро окисляется кислородом воздуха и теряет токсические свойства. Он попадает в среду вместе с каплей локально, но не успевает растечься по чашке вместе с ней. В норме, в случае более стабильных веществ, вокруг упавшей капли (рис. 4, Ь) (или пропитанной испытуемым веществом фильтровальной бумаги, как на рис. 3, Ь) образуется круговая зона подавления, в которой бактерии не растут. Она тем шире, чем токсичнее вещество.
Спустя 45 суток провели второй спот-тест, где в качестве положительного контроля выступил известный мутаген этилметансульфонат (рис. 5). В этом опыте был использован штамм 5. 1урЫтипит ТА1535 (поскольку у 5. typhimurium ТА1538 другой тип мутации гистидинового оперо-на и иная реакция на присутствие этилметан-сульфоната). Спот-тест на генотоксичность не показал мутагенной активности препарата белого фосфора (см. рис. 4, а), в то время как этилме-тансульфонат дал характерный рисунок распределения мутантных колоний вокруг точки нанесения мутагена (рис. 5Б).
Рис. 5. Спот-тест на генотоксичность. 10 мкл тестируемого соединения нанесены в центр чашки Петри на поверхность агаризованной селективной среды с нанесенными на нее бактериями. А - белый фосфор; Б - этилметансульфонат
Fig. 5. Spot-test on genotoxicity. 10 mcl of test substance applied on the center of the petri dish on the surface of agar selective medium with bacteria deposited on it. A - white phosphorus; Б - ethylmethanesulfonate
ш
о о
b ^
m a> s J
о о
X <D <U x I— s
Ü c; о
18000 16000 14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000
-2000
Контроль
1 2 3 4 5 6 7 Время, ч
Ф 62,5 мкг/мл -Ф 1000 мкг/мл
Н2О2
0
Рис. 6. Влияние белого фосфора на SOS-индукцию с перекисью водорода и негативным контролем (среда без мутагена)
Fig. 6. Comparison of white phosphorus influenceon SOS-induction with hydrogen peroxide and negative control (medium without mutagen)
В оценке мутагенных и антимутагенных свойств белого фосфора с помощью SOS-lux-теста в качестве контроля использовался сильный мутаген - противоопухолевый антибиотик митомицин С [14]. Помимо митомицина С в качестве позитивного контроля использовался другой сильный ДНК-повреждающий агент -пероксид водорода. Несмотря на сходный эффект механизмы мутагенного действия этих веществ различны: если митомицин С образует аддукты с азотистыми основаниями ДНК [14],
то перекись водорода является окислителем и оказывает разрушительное воздействие на большинство органических веществ, в том числе и нуклеиновые кислоты [15].
Диаграмма, представленная на рис. 6, демонстрирует, что по сравнению с перекисью белый фосфор является слабым ДНК-повреж-дающим агентом. Здесь необходимо внести поправку. Концентрация Н2О2 в эксперименте составляла 0,03%, а концентрация белого фосфора - 0,00625% (62,5 мкг/мл), что в 4,8 раза
меньше по сравнению с концентрацией перекиси. Поскольку более высокие концентрации белого фосфора оказывают губительное влияние на сальмонелл, достоверно оценивать их гено-токсичность сложно, хотя можно предположить, что с ростом концентрации ДНК-повреждающая активность Р4 должна только возрастать. То есть, следует говорить о том, что общая токсичность белого фосфора для клеток намного выше, чем его генотоксичность [16]. Наибольшей силы БОБ-ответ достигает через 6-8 ч после начала эксперимента, поэтому все последующие измерения проводились через это время (6 часов после внесения культуры сальмонелл в лунку планшета). Р4 в концентрации 62,5 мкг/мл является слабым мутагеном по сравнению с пе-роксидом, а в концентрации 1000 мкг/мл убивает культуру за 9 ч эксперимента. В контроле БОБ-индукция также незначительно возрастает, что связано с ростом культуры и накоплением ДНК (соответственно растет и число ее повреждений даже в отсутствие мутагена).
Работа со средой, содержащей 0,2% белого фосфора, хранившейся при температуре -25 °С (в морозильнике), показала, что даже после ее разведения питательным бульоном до 5% (при этом концентрация белого фосфора снизилась до 0,01%) она проявляет слабые мутагенные и токсические свойства.
Интересно было сравнить генотоксичность среды, хранившейся около 8 месяцев в морозильнике, и свежеприготовленной среды с Р4, чтобы установить влияние продолжительного хранения на токсические свойства белого фосфора. Работа со свежеприготовленной средой
с 0,2% белого фосфора показала, что ее токсические и мутагенные свойства практически не отличаются от свойств среды после длительного хранения.
Так, в контроле интенсивность люминесценции составила 10026 ОСЕ, в присутствии белого фосфора (100 мкг/мл) поднялась до 12590 ОСЕ, а в позитивном контроле с антибиотиком составила 45186 ОСЕ. То есть ДНК-повреждающая активность белого фосфора оказалась слабой, но достоверной, и это при разбавлении среды (изначально содержавшей 0,2% Р4) до 5%. При более высоких концентрациях белого фосфора его токсические свойства проявляются сильнее.
Эксперимент с Н2О2 ставился с целью определения антимутагенных свойств белого фосфора. На диаграмме (рис. 7) синяя линия -влияние на ДНК белого фосфора в концентрациях от 2 до 1000 мкг/мл, красная - влияние смеси Р4 и перекиси. Судя по результатам, антимутагенным действием белый фосфор не обладает. Напротив, наблюдается значительное усиление SOS-ответа у смеси белого фосфора с пероксидом по сравнению с одним белым фосфором. Возможно, продукты окисления белого фосфора (Н2О2) обладают более выраженной генотоксичностью, чем исходный Р4.
Как видно из графиков, представленных на рис. 7, наибольший мутагенный эффект наблюдается при концентрации Р4 62,5 мкг/мл. Обращает внимание более выраженная БОБ-индукция у смеси Р4 и Н2О2. Снижение индукции при более высоких концентрациях связана не с антимутагенной активностью, а с гибелью клеток.
20000
ш 18000 О
16000
о О)
с о s ю л
Ё о
X
m s о
14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000
0 1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1
1000 500 250 125 62,5 31 16 8 4 2 К
мкг/мл
—Фосфор -И- Фосфор Н2О2
Рис. 7. Влияние белого фосфора на SOS-индукцию, вызванную перекисью водорода Fig. 7. Effect of white phosphorus on the SOS-induction induced by hydrogen peroxide
Тем не менее исследование генотоксических свойств на том этапе не было завершено. Дело в том, что в качестве тест-объектов применялись прокариоты - бактерии Salmonella typhimurium, а для оценки генотоксического воздействия вещества на организм человека следует изучать его на эукариотах, к числу которых относится сам человек. Идеальными кандидатами на роль тест-объектов являются растения, поскольку их хромосомы структурно и морфологически сходны с хромосомами млекопитающих, включая и человека. Оптимально подходящим для скрининга мутагенов с этой точки зрения является лук репчатый (Allium cepa L., семейство луковые Alliaceae) - растение небольших размеров, неприхотливое, легкодоступное, с быстрым жизненным циклом. Кроме того, у лука репчатого всего 16 хромосом, что облегчает их подсчет, и быстрый клеточный цикл - менее 18 ч у интенсивно делящихся клеток корешков [17]. На основании этих преимуществ был разработан Allium тест на генотоксичность веществ для эукариот. Он позволяет оценивать не столько повреждения отдельных генов (как тест Эймса) или произвольных фрагментов ДНК (как SOS-lux-тест), сколько повреждения хромосом (хромосомные аберрации) и нарушения расхождения хромосом в ходе клеточного цикла у многоклеточных эукариот (ге-
номные нарушения).
Проведена оценка цитогенетического действия белого фосфора на клетки меристемы корешков лука с помощью Allium теста. Учитывалась динамика роста его корней, т.е. оценивалось не только генотоксическое, но и фитоток-сическое действие Р4. Также оценивался показатель митозмодифицирующего действия - ми-тотический индекс. Опыт проводили при концентрации Р4 0,016%. Снимок, представленный на рис. 8, сделан через двое суток после начала проращивания.
Фото на рис. 8 - наглядная демонстрация фитотоксичности белого фосфора: в его присутствии (правая луковица) корешки достоверно отстают в росте по сравнению с контролем (левая луковица). Показателем уровня митоти-ческой активности тканей является митотиче-ский индекс (MI), указывающий либо на нормальное протекание митоза, либо на угнетение процесса деления клеток, либо на усиление митотической активности тканей. На основании этого можно сделать заключение о митотиче-ском или митозстимулирующем действии изучаемого фактора. Зависимое от концентрации белого фосфора ингибирование митотического индекса демонстрирует цитотоксический потенциал данного вещества (таблица).
Рис. 8. Проращивание лука репчатого в водной среде (луковица слева, контроль) и с добавлением белого фосфора (луковица справа)
Fig. 8. Sprouting of onion in water (control bulb is on the left) and in the presence of white phosphorus (the experimental bulb is on the right)
Таблица
Цитотоксический потенциал белого фосфора при его различных концентрациях
Table
Mitotic index (MI) at different concentrations of white phosphorus
Характер митозов в клетках корешка лука репчатого Контроль Белый с юсфор в концентрации, %
0,008 0,012 0,016
Число проанализированных клеток Митотический индекс (MI) M/P (соотношение метафаза/профаза) Процент аберрантных клеток (тип аберраций) 6181 7,25 ± 1,15 0,77 0,78 (мост) 3378 3,31 ± 0,88 0,72 1,79 (отставание) 4483 2,35 ± 0,65 0,64 5 (отставание, фрагмент) 5426 1,35 ± 0,25 0,42 7,69 (мост)
Данные, представленные в таблице, являются статистически значимыми: установлено, что препарат белого фосфора по сравнению с контролем (р<0,001) существенно снижает ми-тотическую активность тканей и, следовательно, обладает митотоксической активностью.
Анализ соотношений фаз митоза (рис. 9, 10) показал увеличение доли клеток на стадии профазы с соответствующим уменьшением про-
центного отношения других стадий [18]. Это может быть связано с блокировкой деления клеток в конце стадии профазы в результате накопления повреждений генома. Подобное накопление профазных клеток наблюдалось ранее, например, в экспериментах с применением пестицидов [19]. Поскольку на этой стадии формируется веретено деления, возможно, белый фосфор угнетает его образование.
Рис. 9. Клеточный цикл в корешке лука репчатого: 1 - интерфаза; 2, 3 - профаза; 4 - метафаза; 5, 6 - анафаза; 7, 8 - телофаза; 9 - образование двух клеток [https://studfiles.net]
Fig. 9. Cell cycle in onion root of: 1 - interphase; 2, 3 - prophase; 4 - metaphase; 5, 6 - anaphase; 7, 8 - telophase; 9 - two cell formation
Контроль
0,016% белого фосфора
Рис. 10. Соотношение клеток в различных фазах митоза: П - профаза; М - метафаза; А - анафаза; Т - телофаза
Fig. 10. Cells ratio in different phases of mitosis: П - prophase; M - metaphase; A - anaphase; T - telophase
Таким образом, показано, что обработка препаратом белого фосфора при всех тестируемых концентрациях увеличивала процент аберраций хромосом в митотических клетках (данные о частоте клеток с хромосомными аберрациями см. в таблице). При этом частота митотических аномалий увеличивается с ростом концентрации белого фосфора: обработка белым фосфором в концентрации 0,008-0,016% примерно в 10 раз увеличивала процент клеток с аберрациями по сравнению с контролем. То есть негативное влияние белого фосфора на расхождение хромосом при митозе очень вели-
ко [20]. Все концентрации были способны индуцировать различные типы хромосомных аномалий. Не было обнаружено какого-либо пропорционального или значительного увеличения или уменьшения количества определенных типов аберраций (рис. 11).
В контроле количество хромосомных аберраций в делящихся клетках существенно меньше. В одном из исследованных корешков насчитано четыре аномальных митоза на 178; в другом - один «мост» на 411 нормальных митоза и 4507 клеток из апикальной меристемы, потенциально способных делиться.
Рис. 11. Различные типы хромосомных аберраций, обнаруженные в клетках корней Allium сера, обработанных препаратом белого фосфора: A, Б - отставание; B - фрагмент; Г - мост
Fig. 11. Various types of chromosomal aberrations found in Allium cepa root cells treated with white phosphorus: A and Б - lagging; B - a fragment; Г - bridge
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Обнаружение у белого фосфора геноток-сических свойств не является неожиданностью. Тем не менее в более ранних исследованиях генотоксичность у Р4 обнаружена не была. Возможно, это результат недостаточно глубокого изучения: до сих пор генотоксичность белого фосфора определялась только тестом Эймса, который всегда показывал отрицательный результат. Авторами настоящей статьи впервые для этой цели применен SOS-lux-тест, который также определяет генотоксичность, но не по косвенному признаку (увеличение количества мутантов, способных к выработке гистидина в культуре, как тест Эймса), а по прямому - повреждению ДНК. Этим методом генотоксичность белого фосфора была продемонстрирована.
Представленный результат имеет большое практическое значение, так как показывает еще большую степень угрозы техногенных загрязнений этим веществом. Отметим, что до сих пор исследования генотоксичности белого фосфора
проводились исключительно на бактериях. На практике же наибольший интерес представляет его токсическое действие на организм человека. Поэтому очень важно было исследовать генотоксичность на эукариотическом организме, стоящем в более близком родстве с человеком, чем бактерии. Известно, что генетический аппарат эукариот организован более сложно, чем у прокариот [21], и генотоксичность для них проявляется не только в повреждении ДНК, но и в хромосомных и геномных перестройках. Для их исследования очень эффективен Allium тест, использованный в данной работе.
Как показали проведенные исследования, белый фосфор резко увеличивает количество геномных аномалий, причем даже в очень низкой концентрации. Если в контроле количество аберрантных клеток составляет примерно 0,8%, то при наличии 0,01% белого фосфора оно достигает 5%, а при концентрации 0,02% -почти 8% (см. таблицу). То есть генотоксичность белого фосфора, как и его токсичность в
целом, исключительно велика. Следовательно, есть основания рассматривать белый фосфор как мутаген и канцероген. Уменьшение числа клеток на поздних стадиях митоза, возможно, свидетельствует о том, что белый фосфор угнетает формирование веретена деления клеток. Подобным действием обладает, например, инсектицид этион [19].
Механизм генотоксического действия основан, вероятно, на высокой реакционной способности Р4. Вполне возможно, что и обнаруженная генотоксичность белого фосфора обусловлена образованием реакционноспособных метаболитов, образующих аддукты с азотисты-
ми основаниями ДНК (о такой возможности подробно рассказано в обзоре [22]).
Итоги проведенного исследования можно резюмировать следующим образом:
1. SOS-lux-тест показал наличие ДНК-повреждающей активности у белого фосфора. Однако общая токсичность этого вещества намного выше.
2. Allium тест продемонстрировал, что белый фосфор вызывает хромосомные и геномные нарушения в клетках эукариот.
3. Белый фосфор подавляет поздние стадии митоза клеток. Возможно, он нарушает формирование веретена деления.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИМ СПИСОК
1. Миндубаев А.З., Яхваров Д.Г. Фосфор: свойства и применение // Бутлеровские сообщения. 2014. Т. 39. № 7. С. 1-24.
2. Миндубаев А.З. Кто съел полиэтилен? // Наука и жизнь. 2018. N. 4. С. 32-38.
3. Saraswat S. Patent Analysis on Bioremedi-ation of Environmental Pollutants // Journal of Bio-remediation and Biodegradation. 2014. Vol. 5. No. 251. P. 1-6. DOI:10.4172/2155-6199.1000251.
4. Пат. на изобретение № 2603259, РФ. Способ детоксикации белого фосфора с применением штамма микроорганизмов Trichoderma asperellum ВКПМ F-1087 / А.З. Миндубаев, Ф.К Алимова, А.Д. Волошина, Е.В. Горбачук, Н.В. Кулик, С.Т. Минзанова, Р.И. Тухбатова, Д.Г. Яхваров. Дата приоритета 28.07.2015, регистрационный номер 2015131380 (048333). Решение о выдаче патента от 29.08.2016. Бюл. 33.
5. Миндубаев А.З., Волошина А.Д., Вали-дов Ш.З., Яхваров Д.Г. Биодеградация белого фосфора // Природа. 2017. N 5. С. 29-43.
6. Миндубаев А.З., Волошина А.Д., Бабынин Э.В., Бадеева Е.К., Хаяров Х.Р., Минзанова С.Т., Яхваров Д.Г. Микробиологическая деградация белого фосфора // Экология и промышленность России. 2018. Т. 22. N 1. С. 33-37.
7. Mortelmans K., Zeiger E. The Ames Sal-monella/microsome mutagenicity assay // Mutation Research. 2000. Vol. 455. No. 1-2. P. 29-60.
8. Thoma R., Schwander M., Liebl W., Sterner R. A histidine gene cluster of the hyperthermophile Thermotoga maritima: sequence analysis and evolutionary significance // Extremophiles. 1998. Vol. 2. No. 4. P. 379-389.
9. Grifoni A., Bazzicalupo M., Di Serio C., Fancelli S., Fani R. Identification of Azospirillum strains by restriction fragment length polymorphism of the 16S rDNA and of the histidine operon // FEMS Microbiology Letters. 1995. Vol. 127. No. 1-2. P. 85-91.
10. Миндубаев А.З., Волошина А.Д., Кулик Н.В., Минзанова С.Т., Миронова Л.Г., Яхваров Д.Г., Бабынин Э.В., Валидов Ш.З., Аккизов А.Ю., Оценка генотоксичности белого фосфора. Развитие бактериальной культуры в среде с фосфитом калия в качестве единственного ис-
точника фосфора // Бутлеровские сообщения. 2016. Т. 47. N 7. С. 1-20.
11. Cooper D.L., Lovett S.T. Toxicity and tolerance mechanisms for azidothymidine, a replication gap-promoting agent, in Escherichia coli // DNA Repair (Amst). 2011. Vol. 10. No. 3. Р. 260-270.
12. Davidov Y., Rozen R., Smulski D.R. Van Dyk T.K., Vollmer A.C., Elsemore D.A., LaRossa L.A., Belkin S. Improved bacterial SOS promoter&Co-lon; lux fusions for genotoxicity detection // Mutation Research. Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 2000. Vol. 466. No. 1. Р. 97-107. https://doi.org/10.1016/S1383-5718(99) 00233-8.
13. Fiskesjo G. Allium test for screening chemical evaluation of cytological parameters. In: Plants for Environmental Studies. New York: Lewis Publishers, 1997. P. 300-333.
14. Bueren-Calabuig J.A., Negri A., Morreale A. Gago F. Rationale for the opposite stereochemistry of the major monoadducts and interstrand crosslinks formed by mitomycin C and its decar-bamoylated analogue at CpG steps in DNA and the effect of cytosine modification on reactivity // Org. Biomol. Chem. 2012. Vol. 10. No. 8. P. 1543-1552.
15. Linley E., Denyer S.P., McDonnell G. Simons C., Maillard J.-Y. Use of hydrogen peroxide as a biocide: new consideration of its mechanisms of biocidal action // Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 2012. Vol. 67. No. 7. P. 1589-1596.
16. Миндубаев А.З., Волошина А.Д., Кулик Н.В., Минзанова С.Т., Миронова Л.Г., Яхваров Д.Г., Бабынин Э.В., Сахапов И.Ф., Валидов Ш.З., Аккизов А.Ю. Генотоксичность белого фосфора // Бутлеровские сообщения. 2017. Т. 49. N 1. С. 1-20.
17. Иванов В.Б. Клеточные основы роста растений. М.: Наука. 1974. 231 с.
18. Тейлор Д., Грин Н., Стаут У. Биология: в 3 т.; 3-е изд. / пер. с англ.; под ред. Р. Сопера. М.: Мир. 2004. Т. 3. 451 с.
19. Lamsal K., Ghimire B.K., Sharma P., Ghi-miray A.K., Kim S.W., Yu C.Y., Chung I.M., Lee Y.S., Kim J.-S., Shakya S.R. Genotoxicity evaluation of the insecticide ethion in root of Allium cepa L. // Afr. J. Biotechnol. 2010. Vol. 9. No. 27. P. 4204-4210.
20. Миндубаев А.З., Бадеева Е.К., Минзанова С.Т., Миронова Л.Г., Волошина А.Д. Бабынин Э.В., Акосах Й.А., Пискунов Д.Б., Махиянов А.Н. Цитогенетическое действие белого фосфора // Бутле-ровские сообщения. 2018. Т. 55. N 9. С. 1-21.
21. Тейлор Д., Грин Н., Стаут У. Биология:
в 3 т.; 3-е изд. / пер. с англ.; под ред. Р. Сопера. М.: Мир. 2004. Т. 1. 454 с.
22. Миндубаев А.З., Яхваров Д.Г., Акосах Й.А. Фосфиноксид как предполагаемый интер-медиат биологических процессов // Бутлеров-ские сообщения. 2018. Т. 53^ 3. С. 1-34.
1. Mindubaev A.Z., Yakhvarov D.G. Phosphorus: Properties and Applications. Butlerovskie soobshcheniya. 2014, vol. 39, no. 7, pp. 1-24. (In Russian)
2. Mindubaev A.Z. Who ate the polyethylene? Nauka i zhizn'. 2018, no. 4, pp. 32-38. (In Russian)
3. Saraswat S. Patent Analysis on Bioremedi-ation of Environmental Pollutants. Journal of Bio-remediation and Biodegradation. 2014, vol. 5, no. 251, pp. 1-6. DC>I:10.4172/2155-6199.1000251.
4. Mindubaev A.Z., Alimova F.K., Voloshina A.D., Gorbachuk E.V., Kulik N.V., Minzanova S.T., Tukhbatova R.I., Yakhvarov D.G. Sposob detoksi-katsii belogo fosfora s primeneniem shtamma mikroorganizmov Trichoderma asperellum VKPM F-1087 [Method for detoxification of white phosphor-rus using microorganism strain Trichoderma asperel-lum VKPM F-1087]. Patent of RF, no. 2603259, 2015.
5. Mindubaev A.Z., Voloshina A.D., Validov Sh.Z., Yakhvarov D.G. Biodegradation of white phosphorus. Priroda. 2017, no. 5, pp. 29-43. (In Russian)
6. Mindubaev A.Z., Voloshina A.D., Babynin E.V., Badeeva E.K., Khayarov Kh.R., Minzanova S.T., Yakhvarov D.G. Microbiological degradation of white phosphorus. Ekologiya i promyshlennost' Ros-sii. 2018, vol. 22, no. 1, pp. 33-37. (In Russian)
7. Mortelmans K., Zeiger E. The Ames Sal-monella/microsome mutagenicity assay. Mutation Research. 2000, vol. 455, no. 1-2, pp. 29-60.
8. Thoma R., Schwander M., Liebl W., Sterner R. A histidine gene cluster of the hyperthermophile Thermotoga maritima: sequence analysis and evolutionary significance. Extremophiles. 1998, vol. 2, no. 4, pp. 379-389.
9. Grifoni A., Bazzicalupo M., Di Serio C., Fancelli S., Fani R. Identification of Azospirillum strains by restriction fragment length polymorphism of the 16S rDNA and of the histidine operon. FEMS Microbiology Letters. 1995, vol. 127, no. 1-2, pp. 85-91.
10. Mindubaev A.Z., Voloshina A.D., Kulik N.V., Minzanova S.T., Mironova L.G., Yakhvarov D.G., Babynin E.V., Validov Sh.Z., Akkizov A.Yu. Evaluation of white phosphorus genotoxicity. Growth of bacterial culture in a medium with potassium phosphite as a sole source of phosphorus. Butlerovskie soobshcheniya. 2016, vol. 47, no. 7, pp. 1-20. (In Russian)
11. Cooper D.L., Lovett S.T. Toxicity and tolerance mechanisms for azidothymidine, a replication gap-promoting agent, in Escherichia coli. DNA Repair (Amst). 2011, vol. 10, no. 3, pp. 260-270.
12. DavidovY., Rozen R., Smulski D.R. Van Dyk
T.K., Vollmer A.C., Elsemore D.A., LaRossa L.A., Bel-kin S. Improved bacterial SCS promoter∷ lux fusions for genotoxicity detection. Mutation Research. Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 2000, vol. 466, no. 1, pp. 97-107. https://doi.org/10.1016/S1383-5718(99)00233-8.
13. Fiskesjo G. Allium test for screening chemical evaluation of cytological parameters. In: Plants for Environmental Studies. New York: Lewis Publishers, 1997, pp. 300-333.
14. Bueren-Calabuig J.A., Negri A., Morreale A. Gago F. Rationale for the opposite stereochemistry of the major monoadducts and interstrand crosslinks formed by mitomycin C and its decar-bamoylated analogue at CpG steps in DNA and the effect of cytosine modification on reactivity. Org. Biomol. Chem. 2012, vol. 10, no. 8, pp. 1543-1552.
15. Linley E., Denyer S.P., McDonnell G. Simons C., Maillard J.-Y. Use of hydrogen peroxide as a biocide: new consideration of its mechanisms of biocidal action. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 2012, vol. 67, no. 7, pp. 1589-1596.
16. Mindubaev A.Z., Voloshina A.D., Kulik N.V., Minzanova S.T., Mironova L.G., Yakhvarov D.G., Babynin E.V., Sakhapov I.F., Validov Sh.Z., Akkizov A.Yu. Genotoxicity of white phosphorus. Butlerovskie soobshcheniya. 2017, vol. 49, no. 1, pp. 1-20. (In Russian)
17. Ivanov V.B. Kletochnye osnovy rosta ras-tenii [Cellular bases for plant growth]. Moscow: Nauka Publ., 1974, 231 p.
18. Taylor D., Green N., Stout W. Biological Science. Cambridge: Cambridge University Press Publ., 2001. (Russ ed.: Teilor D., Grin N., Staut U. Biologiya. Moscow: Mir Publ., 2004, vol. 3, 451 p.)
19. Lamsal K., Ghimire B.K., Sharma P., Ghimiray A.K., Kim S.W., Yu C.Y., Chung I.M., Lee Y.S., Kim J.-S., Shakya S.R. Genotoxicity evaluation of the insecticide ethion in root of Allium cepa L. Afr. J. Biotechnol. 2010, vol. 9, no. 27, pp. 4204-4210.
20. Mindubaev A.Z., Badeeva E.K., Minzanova S.T., Mironova L.G., Voloshina A.D. Babynin E.V., Akosakh I.A., Piskunov D.B., Makhiyanov A.N. Cytogenetic effect of white phosphorus. Butlerovskie soobshcheniya. 2018, vol. 55, no. 9, pp. 1-21. (In Russian)
21. Taylor D., Green N., Stout W. Biological Science. Cambridge: Cambridge University Press Publ., 2001. (Russ ed.: Teilor D., Grin N., Staut U. Biologiya. Moscow: Mir Publ., 2004, vol. 1, 454 p.)
22. Mindubaev A.Z., Yakhvarov D.G., Akosakh I.A. Phosphine oxide as a prospective intermediate of biological processes. Butlerovskie soobshcheniya. 2018, vol. 53, no. 3, pp. 1-34. (In Russian)
Критерии авторства
Миндубаев А.З., Бабынин Э.В., Бадеева Е.К., Пискунов Д.Б., Махиянов А.Н., Минзанова С.Т., Миронова Л.Г., Волошина А.Д. выполнили экспериментальную работу, на основании полученных результатов провели обобщение и написали рукопись. Миндубаев А.З., Бабынин Э.В., Бадеева Е.К., Пискунов Д.Б., Махиянов А.Н., Мин-занова С.Т., Миронова Л.Г., Волошина А.Д. имеют на статью равные авторские права и несут равную ответственность за плагиат.
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ
Миндубаев Антон Зуфарович СЕЗ,
к.х.н., доцент, старший научный сотрудник Институт органической и физической химии им. А.Е. Арбузова КазНЦ РАН e-mail: [email protected]
Бабынин Эдуард Викторович,
к.б.н., доцент кафедры генетики Казанский федеральный университет e-mail: [email protected]
Бадеева Елена Казимировна,
к.х.н., научный сотрудник Институт органической и физической химии им. А.Е. Арбузова КазНЦ РАН, e-mail: [email protected]
Пискунов Дмитрий Борисович,
магистрант кафедры химической кибернетики Казанский национальный исследовательский технологический университет e-mail: [email protected]
Махиянов Айрат Наилевич,
магистрант кафедры химической кибернетики Казанский национальный исследовательский технологический университет e-mail: [email protected]
Минзанова Салима Тахиятулловна,
кандидат технических наук, доцент, старший научный сотрудник Институт органической и физической химии им. А.Е. Арбузова КазНЦ РАН e-mail: [email protected]
Миронова Любовь Геннадьевна,
инженер-исследователь Институт органической и физической химии им. А.Е. Арбузова КазНЦ РАН e-mail: [email protected]
Волошина Александра Дмитриевна,
к.б.н., старший научный сотрудник, заведующая лабораторией микробиологии Институт органической и физической химии им. А.Е. Арбузова КазНЦ РАН e-mail: [email protected]
Contribution
Anton Z. Mindubaev, Edward V. Babynin, Elena K. Badeeva, Dmitriy B. Piskunov, Ayrat N. Makhiyanov, SalimaT. Minzanova, Lyubov' G. Mironova, Alexandra D. Voloshina carried out the experimental work, on the basis of the results summarized the material and wrote the manuscript. Anton Z. Mindubaev, Edward V. Babynin, Elena K. Badeeva, Dmitriy B. Piskunov, Ayrat N. Makhiyanov, SalimaT. Minzanova, Lyubov' G. Mironova, Alexandra D. Voloshina have equal author's rights and bear equal responsibility for plagiarism.
Conflict of interests
The authors declare no conflict of interests regarding the publication of this article.
AUTHORS' INDEX
Anton Z. Mindubaev IS]
Ph.D. (Chemistry), Associate Professor,
Senior Researcher
A.E. Arbuzov Institute of Organic and Physical Chemistry of Kazan Scientific Center RAS e-mail: [email protected]
Edward V. Babynin
Ph.D. (Biology), Associate Professor Kazan (Volga region) Federal University e-mail: [email protected]
Elena K. Badeeva
Ph.D. (Chemistry), Researcher A.E. Arbuzov Institute of Organic and Physical Chemistry of Kazan Scientific Center RAS e-mail: [email protected]
Dmitriy B. Piskunov
Master Student
Chemical Cybernetic Department
Kazan National Research Technological University
e-mail: [email protected]
Ayrat N. Makhiyanov
Master Student
Chemical Cybernetic Department
Kazan National Research Technological University
e-mail: [email protected]
Salima T. Minzanova
Ph.D. (Engineering), Associate Professor, Senior Researcher
A.E. Arbuzov Institute of Organic and Physical Chemistry of Kazan Scientific Center RAS e-mail: [email protected]
Lyubov' G. Mironova
Research-engineer
A.E. Arbuzov Institute of Organic and Physical Chemistry of Kazan Scientific Center RAS e-mail: [email protected]
Alexandra D. Voloshina
Ph.D. (Biology), Senior Researcher, Head of Microbiological laboratory A.E. Arbuzov Institute of Organic and Physical Chemistry of Kazan Scientific Center RAS e-mail: [email protected]
