CC BY
39
УДК 579.695; 546.85; 502.55; 661.63
'А.З. Миндубаев, 2Э.В. Бабынин, 1А.Д. Волошина, 'И.Ф. Сахапов, 1Д.Г. Яхваров
'Институт органической и физической химии им. А.Е. Арбузова КазНЦ РАН,
mindubaev@iopc.ru 2 Казанский (Приволжский) федеральный университет
ИЗУЧЕНИЕ ГЕНОТОКСИЧНОСТИ БЕЛОГО ФОСФОРА
Наличие генотоксических свойств при исследованиях белого фосфора с использованием теста Эймса ранее не подтверждалось. Для этой цели необходимо использовать батарею тестов, включая SOS-lux тест на ДНК-повреждающую активность. В представленной работе SOS-lux тест с использованием индикаторного штамма Salmonella typhimurium впервые продемонстрировал гено-токсичность белого фосфора при отсутствии токсичности по тесту Эймса.
Ключевые слова: белый фосфор; генотоксичность; тест Эймса; Salmonella typhimurium; ДНК-повреждающая активность; SOS-lux тест.
Введение
Важным показателем токсичности вещества является его генотоксичность, т.е. повреждающее действие на ДНК, увеличивающее частоту мутагенеза и канцерогенеза. Одной из целей представленной работы стало исследование гено-токсичности культуральной среды, содержащей белый фосфор и его метаболиты, направленное на более углубленное изучение показателей их токсичности.
Методика исследования
Генотоксичность белого фосфора определялась при помощи теста Эймса по методике, описанной в работе (Mortelmans, Zeiger, 2000). В тесте использованы индикаторные штаммы Salmonella typhimurium TA1535 (генотип hisG46 rfa uvrB), TA1538 (генотип hisD3052 rfa uvrB). Штаммы имеют мутации в генах гистидиново-го оперона, в результате чего бактерии не могут расти на среде без гистидина. Однако, если мутагенный агент присутствует, он может вызвать обратные мутации, что приводит к появлению прототрофных ревертантов.
Штамм TA1535 содержит мутации в гене hisG, что приводит к аминокислотной замене лейцина на пролин (мутация замены пары оснований). Штамм TA1538 имеет делецию 1 пары оснований в гене hisD, что вызывает мутацию типа сдвига рамки считывания. Это приводит к изменению двух аминокислот и появлению стоп-кодона внутри гена. Реверсии к His+ фенотипу у этих штаммов, таким образом, требуют различные молекулярные изменения в гене. Так как различные мутагены могут оказывать свое влияние на ДНК через разнообразные механизмы, то использование штаммов, содержащих разные мутации,
позволяет определить мутагены, которые имеют различное влияние на ДНК.
Ночную культуру Salmonella typhimurium (109 клеток/мл) в 0.015 М фосфатном буфере (рН 7.4) инкубировали с тестируемым соединением в диапазоне концентраций при 37°С 90 мин без встряхивания. После инкубации 2.5 мл расплавленного верхнего агара (0.6% агара, 0.6% NaCl, 0.05 мМ L-гистидина, 0.05 мМ биотина, рН 7,4 при 45 ° С) добавляли в пробирки, и смесь наносили на минимальную агаризованную среду (1.5% агар, среда Фогеля-Боннера, содержащая 2% глюкозы) и инкубировали при 37 °С в течение 66 ч. После этого срока подсчитывали число колоний His+ ревертантов, выросших на поверхности агара. В качестве позитивного контроля использовали 2,4-динитрофенилгидразин (ДНФГ) для штамма ТА1538 и этилметансульфонат (ЭМС) для TA1535, соответственно. Согласно методике, мутагенной считается та концентрация тестируемого вещества, при которой число ревертантов в опыте выше контрольных значений более чем в два раза.
SOS-тест позволяет напрямую определять ДНК-повреждаюшую активность веществ, т.е. служит дополнением к тесту Эймса, уточняющим оценку генотоксичности. Об активности SOS-регулона в SOS-lux тесте судят по степени биолюминесценции. Для оценки индукции SOS-ответа использовали индикаторный штамм S. typhimurium TA1535/pDEW238, способный к биолюминесценции в ответ на ДНК-повреждающие агенты. Штамм получен в результате трансформации штамма S. typhimurium ТА1535 плазмидой pDEW238, которая содержит luxCDABE - оперон под контролем recA промотора. Плазмида предоставлена Rachel Rozen (The Hebrew University of
42
российский журннл им! экологии
Jerusalem, Jerusalem 91904, Israel).
Для проведения SOS-теста на генотоксичность использовались две среды. Одна из них та же, что использовалась в тесте Эймса (Миндубаев и др., 2016 а). Эта среда хранилась в замороженном состоянии (-10 °С) 226 суток. Вторая среда была заморожена в пробирке Эппендорфа через несколько часов после приготовления и хранилась в замороженном виде 12 дней.
Эксперимент был выполнен по схеме, описанной в работе (Cooper, Lovett, 2011). Делали серию разведений среды, содержащей вначале 0.2% белого фосфора (2000 мкг/мл). Сначала смешивали пополам с культурой сальмонелл, при этом концентрация падала до 1000 мкг/мл. С этой концентрации начинали измерение общей токсичности и генотоксичности. В конце серии разведений доводили концентрацию Р4 до 1 мкг/мл (0.0001%). Ночную культуру штамма, выращенную в питательном бульоне с ампициллином (100 мкг/мл), вносили в планшеты по 0.1 мл в лунку и добавляли в каждую раствор среды с Р4 в различных
концентрациях. В качестве позитивного контроля использовали митомицин C (Davidov et al., 2000). Определяли интенсивность биолюминесценции с помощью микропланшетного ридера Infinite F200 Pro, Tecan (Австрия). Для каждой концентрации в каждой точке времени брали три пробы. Интенсивность биолюминесценции измеряли в относительных световых единицах (ОСЕ) (Relative Light Units, RLU), рассчитанных как число световых единиц в секунду, деленное на оптическую плотность клеточной культуры (OD) при 550 нм.
Повторный SOS-lux тест провели со свежеприготовленной средой (0.2% Р4). В качестве позитивного контроля использовали, помимо ми-томицина C, пероксид водорода в концентрации, в которой наблюдается наиболее выраженный мутагенный эффект (около 0.03%).
Перед проведением теста среды встряхивали, чтобы черный осадок распределялся в объеме, а не скапливался на дне.
Все эксперименты выполнены в трех повтор-ностях.
Рис. 1. Качественный тест на генотоксичность (спот-тест):
a) внесено 10 мкл культуральной среды; b) кусочки фильтровальной бумаги, пропитанные испытуемыми веществами, демонстрируют зоны подавления роста; с) внесено 50 мкл культуральной среды; d) внесено 10 мкл раствора белого фосфора (WPh), раствора канамици-на (Kan) и раствора налидиксовой кислоты (N)
Результаты и их обсуждение
В Токсикологическом профиле белого фосфора (Тохшо^ша1 ..., 1997) сообщается об отсутствии генотоксичности данного вещества. Тест проводился на пяти ауксотрофных штаммах сальмонеллы ТА1535, ТА1537, ТА1538, ТА98 и ТА100 и не выявил увеличение частоты мутаций. Мы решили проверить эти данные, начав с проведения спот-теста -варианта теста Эймса для качественного определения генотоксичности.
При внесении капли среды объемом 10 мкл в чашку Петри с посевом сальмонеллы генотоксичность не наблюдается (рис. 1а). Но первые же тестирования показали, что среда очень токсична для & гурЫтигтт ТА1535 и ТА1538. Они погибают в этой среде даже при ее разбавлении питательным мясным бульоном до 90%. В течение 1 часа плотность популяции падает с 2.47*108 клеток/50 мкл до 10 клеток/50 мкл. При разбавлении бульоном до 50% через час исходная плотность популяции упала до 4*105 клеток/50 мкл.
Как видно из рисунка 1а, невозможно даже определить место внесения капли. При внесении в чашку с посевом капли большего объема (50 мкл), в месте падения капли образуется пятно мертвых клеток (рис. 1с). Несмотря на то, что ка-
h
а
г
2/2017
43
пля растекается по дну чашки в круг диаметром 1 см, гибель клеток наблюдается только в месте ее падения. Круги из мутантных клеток, специфичные для теста Эймса (рис. Ы), в случае белого фосфора вокруг капли не образовались.
Предположительно, такая картина наблюдается в связи с нерастворимостью белого фосфора в воде. Он попадает в среду вместе с каплей локально, но не растекается по чашке вместе с ней. В норме, в случае растворимых веществ, вокруг упавшей капли (рис. Ы) или пропитанной испытуемым веществом фильтровальной бумаги (рис. 1Ь) образуется круговая зона подавления, в которой бактерии не растут. Она тем шире, чем токсичнее вещество.
Спустя 45 суток был проведен повторный спот-тест (рис. 2). В качестве положительного контроля выступал известный мутаген этилме-тансульфонат. Спот-тест на генотоксичность не показал мутагенной активности раствора белого фосфора (рис. 2а), в то время как этилметансуль-фонат дал характерный рисунок распределения мутантных колоний вокруг точки нанесения мутагена (рис. 2б).
При разбавлении среды бульоном до концентрации 10% снижение жизнеспособности сальмонелл не наблюдается, т.е. достигнута субвитальная концентрация. При инкубировании в среде штамма ТА1535 в течение 1 часа число мутантов изменилось с 1.19±0.29, до 1.31±0.28, однако различия были статистически недостоверны. При инкубировании в ней штамма ТА1538 в
течение 1 часа число мутантов не выросло, а упало с 10.1±0.81 до 9.0±0.72. В позитивном контроле с мутагеном 2.4-динитрофенилгидразином их число выросло до 22.5±3.1. То есть, генотоксич-ность у культуральной среды с белым фосфором и его метаболитами отсутствовала.
При оценке мутагенных и антимутагенных свойств белого фосфора с помощью SOS-lux теста в качестве контроля использовался сильный мутаген, противоопухолевый антибиотик мито-мицин С (Bueren-Calabuig et al., 2012). Помимо митомицина С, в качестве позитивного контроля использовался другой сильный ДНК повреждающий агент - пероксид водорода. Несмотря на сходный эффект, механизмы мутагенного действия этих веществ различны. Если митомицин С образует аддукты с азотистыми основаниями ДНК (Bueren-Calabuig et al., 2012), то перекись водорода является окислителем и оказывает разрушительное воздействие на большинство органических веществ, в том числе и нуклеиновые кислоты (Linley et al., 2012).
По сравнению с перекисью белый фосфор является слабым ДНК- повреждающим агентом (рис. 3). Наиболее выраженный мутагенный эффект наблюдается при концентрации Р4 62.5 мкг/ мл. Р4 в данной концентрации является слабым мутагеном, по сравнению с пероксидом. Р4 в концентрации 1000 мкг/мл убивает культуру за 9 часов эксперимента. В контроле SOS-индукция также незначительно возрастает, что связано с ростом культуры и накоплением ДНК (соответственно,
Рис. 2. Спот-тест на генотоксичность: а - белый фосфор, б - этилметансульфонат
g 10000
7 8 9 Время, час.
-Контроль
-Ф 62,5 мкг/мл
Ф 1000 мкг/мл
Н2О2
Рис. 3. Сравнение влияния белого фосфора (Ф)
на &0&-индукцию с перекисью водорода и негативным контролем (среда без мутагена)
20000 18000 я 16000 | 14000
я 12000
Е
I 10000
^ 8000
! 6000
| 4000
Ц 2000 0
1000 500 250 125 62,5 31 16 8 4 2 К мкг/мл
Фосфор Фосфор + Н202
Рис. 4. Влияние белого фосфора на &0&-индукцию, вызванную перекисью водорода
растет и число ее повреждении даже в отсутствие мутагена). При исследованиях генотоксичности значимой величиной считается только рост вдвое по сравнению с контролем; меньшие различия дозволительно игнорировать. Здесь, однако, следует внести поправку. Концентрация Н2О2 в эксперименте составляла 0.03%, а концентрация белого фосфора 62.5 мкг/мл соответствует 0.00625%. Таким образом, концентрация Р4 была меньше в 4.8 раза по сравнению с концентрацией перекиси. Поскольку более высокие концентрации белого фосфора оказывают губительное влияние на сальмонелл, достоверно оценивать их гено-токсичность сложно. Хотя можно предполагать, что с ростом концентрации ДНК повреждающая активность Р4 должна только возрастать. Отсюда, следует говорить не о низкой генотоксичности белого фосфора, а о том, что его общая токсичность для клеток намного выше, чем его геноток-сичность. Наибольшей силы SOS ответ достигает через 6-8 часов после начала эксперимента, поэ-
тому все последующие измерения мы проводили через это время (6 часов после внесения культуры сальмонелл в лунку планшета).
Работа со средой с 0.2% белого фосфора, хранившейся в морозильнике, показала, что даже после разведения питательным бульоном до 5% (0.01% белого фосфора) она проявляет слабые мутагенные и токсические свойства.
Имелась возможность сравнить генотоксич-ность среды, хранившейся около 8 месяцев в морозильнике, и свежеприготовленной среды с Р4, чтобы установить влияние продолжительного хранения на токсические свойства белого фосфора. Работа со свежеприготовленной средой с 0.2% белого фосфора показала, что ее токсические и мутагенные свойства практически не отличаются от свойств среды после длительного хранения. Так, в контроле интенсивность люминесценции составила 10026 ОСЕ, в присутствии белого фосфора (100 мкг/мл) - до 12590, а в позитивном контроле с антибиотиком - 45186 ОСЕ. В целом ДНК-повреждающая активность белого фосфора оказалась слабой, но достоверной, и это при разбавлении среды (изначально содержавшей 0.2% Р4) до 5%. При более высоких концентрациях белого фосфора его токсические свойства проявляются сильнее.
Эксперимент с Н2О2 ставился с целью определить антимутагенные свойства белого фосфора (рис. 4). Судя по результатам, антимутагенным действием белый фосфор не обладает. Напротив, наблюдается значительное усиление SOS ответа у смеси белого фосфора с пероксидом по сравнению с одним белым фосфором. Бросается в глаза более выраженная SOS-индукция у смеси Р4 и Н2О2. Снижение индукции при более высоких концентрациях связана не с антимутагенной активностью, а с гибелью клеток. Возможно, продукты окисления белого фосфора и Н2О2 обладают более выраженной генотоксичностью, чем у исходного Р4.
Заключение
Ряд наших предыдущих публикаций (Минду-баев и др., 2011; Миндубаев и др., 2015; Минду-баев и др., 2016а-в, Миндубаев и др., 2017б) был посвящен микробиологическому превращению токсичнейшего элементного (белого) фосфора в биогенный фосфат. Обнаружение у белого фосфора генотоксических свойств в рамках данного исследования не явилось неожиданностью, несмотря на то, в более ранних работах (Toxicolog-ical ..., 1997) генотоксичность у Р4 обнаружена не была. Возможно, это результат недостаточной глубины исследования: до сих пор генотоксич-
0
0
2
3
4
5
6
2/2017
45
ность белого фосфора определялась только тестом Эймса, который всегда показывал отрицательный результат. Судя по всему, мы первые применили для этой цели SOS-lux тест (Миндубаев и др., 2017a), который также определяет генотоксич-ность, но не по косвенному признаку (увеличение количества мутантов, способных к выработке гистидина, в культуре), как тест Эймса, а по прямому - повреждению ДНК. И этим методом гено-токсичность была продемонстрирована.
Список литературы
1. Миндубаев А.З., Акосах Й.А., Алимова Ф.К., Афор-доаньи Д.М., Болормаа Ч., Кагиров Р.М., Минзанова С.Т., Миронова Л.Г., Яхваров Д.Г. О разложении белого фосфора осадком сточных вод // Учен.зап. Казан. ун-та. Сер. Естеств. науки. 2011. Т. 153, кн. 2. С. 110-119.
2. Миндубаев А.З., Бабынин Э.В., Волошина А.Д., Вали-дов Ш.З., Кулик Н.В., Минзанова С.Т., Миронова Л.Г., Ак-кизов А.Ю., Яхваров Д.Г. Оценка генотоксичности белого фосфора. Развитие бактериальной культуры в среде с фосфитом калия в качестве единственного источника фосфора // Бутлеровские сообщения. 2016а. Т. 47, №7. С. 1-20.
3. Миндубаев А.З., Бабынин Э.В., Волошина А.Д., Саха-пов И.Ф., Кулик Н.В., Валидов Ш.З., Минзанова С.Т., Миронова Л.Г., Аккизов А.Ю., Яхваров Д.Г. Генотоксичность белого фосфора // Бутлеровские сообщения. 2017а. Т. 49, №1. С. 1-20.
4. Миндубаев А.З., Волошина А.Д., Горбачук Е.В., Кулик Н.В., Минзанова С.Т., Миронова Л.Г., Алимова Ф.К., Яхваров Д.Г. Возможность обезвреживания промышленных стоков, содержащих белый фосфор, при помощи микрофлоры // Российский журнал прикладной экологии. 2015. № 3. С. 42-47.
5. Миндубаев А.З., Минзанова С.Т., Миронова Л.Г., Яхваров Д.Г. Влияние зеленой массы амаранта на скорость деградации белого фосфора // Российский журнал прикладной экологии. 2017б. №1. С. 50-54.
6. Миндубаев А.З., Сапармырадов К.А., Алимова Ф.К. Сравнение антагонистических свойств стрептомицетов из различных биотопов // Российский журнал прикладной экологии. 2016б. № 3. С. 28-32.
7. Миндубаев А.З., Сапармырадов К.А., Горбачук Е.В., Панкова А.В. Селекция микроорганизмов на устойчивость к белому фосфору // Российский журнал прикладной экологии. 2016в. №2. С. 42-46.
8. Bueren-Calabuig J.A., Negri A., Morreale A., Gago F. Rationale for the opposite stereochemistry of the major monoad-
ducts and interstrand crosslinks formed by mitomycin C and its decarbamoylated analogue at CpG steps in DNA and the effect of cytosine modification on reactivity // Org. Biomol. Chem. 2012. V. 10, №8. P. 1543-1552.
9. Cooper D.L., Lovett S.T. Toxicity and tolerance mechanisms for azidothymidine, a replication gap-promoting agent, in Escherichia coli //DNA Repair (Amst). 2011. V. 10, №3. P. 260-270.
10. Davidov Y., Rozen R., Smulski D.R., Van Dyk T.K., Vollmer A.C., Elsemore D.A., LaRossa L.A., Belkin S. Improved bacterial SOS promoter∷ lux fusions for genotoxicity detection // Mutation Research / Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 2000. V. 466, №1. P. 97-107.
11. Linley E., Denyer S.P., McDonnell G., Simons C., Maillard J.-Y. Use of hydrogen peroxide as a biocide: new consideration of its mechanisms of biocidal action // J. Antimicrob Chemother. 2012. V. 67, №7. P. 1589-1596.
12. Mortelmans K., Zeiger E. The Ames Salmonella/mic-rosome mutagenicity assay // Mutation Research. 2000. V. 455, №1-2. P. 29-60.
13. Toxicological profile for white phosphorus. U.S. Department of health and human services, 1997. 248 p.
A.Z. Mindubaev, E.V. Babynin , A.D. Voloshina, I.F. Sakhapov, D.G. Yakhvarov. Study of the white phosphorus genotoxicity.
Our previous studies have demonstrated the absence of white phosphorus toxicity for Aspergillus niger AMI. However, the toxic properties of the substances are of different nature. It is of great interest to study the genotoxicity - a possible source of mutations. In the present study the genotoxicity of white phosphorus is evaluated using the Ames test, which demonstrated the absence of toxicity. However, with all the advantages of this method, the use of the Ames test only is not enough to reliably assess the genotox-icity. For this purpose a whole battery of tests is used, and the SOS-lux test for the DNA damaging activity is among them. In the present work the SOS-lux test has demonstrated the result of the white phosphorus genotoxicity properties for the first time.
Keywords: white phosphorus; genotoxicity; Ames test; Salmonella typhimurium; DNA-damage activity; SOS-lux test.
46
российский ЖУРНАЛ лриклллной экологии
