CC BY
236
23. Drew R.J., Fonseca-Kelly Z., Eogan M. A Retrospective Audit of Clinically Significant Maternal Bacteraemia in a Specialist Maternity Hospital from 2001 to 2014. Infect. Dis. Obstet. Gynecol. 2015; 2015: 518562. Doi: 10.1155/2015/518562.
Поступила 12.05.16
Kuzmin VN, Arslanyan K.N., Kharchenko EI, Adamyan L.V.
THE ROLE OF GROUP B STREPTOCOCCUS IN THE DEVELOPMENT OF NOSOCOMIAL INFECTIONS
Department of reproductive medicine and surgery University of Medicine and Dentistry, 127473, Moscow, Russia
In the article the role of group B streptococcus in the development of nosocomial infection in the maternity hospitals is covered. Its features, prevalence, infection risk factors, various forms of bacterial infection in infants, pregnant women, women in childbirth were considered. The world's data and the data of own research on the role of group B streptococcus in obstetrics and perinatology are presented. Keywords: group B streptococcus, nosocomial infections, obstetrics, perinatology.
DOI 10.18821/0208-0613-2016-34-4-142-149
For correspondence: Elmira L Kharchenko, PhD, Assistant of the Department of Reproductive Medicine and Surgery, Faculty of Postgraduate Education, E-mail: hadeeva_elmira@inbox.ru
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016 УДК 615.281.015.8.07
Мазанко М.С.1, Чистяков В.А.1>3, Празднова Е.В.1, Покудина И.О.1, Чурилов М.Н.1,
Чмыхало В.К.1, Батюшин М.М.2
диоксидин индуцирует антибиотикорезистентность бактерий
'ФГАОУ ВО «Южный федеральный университет», Академия биологии и биотехнологии им. Д.И. Ивановского, 344090,
Ростов-на-Дону, Россия
2ГБОУ ВПО «Ростовский государственный медицинский университет» Минздрава России, 344022, Ростов-на-Дону, Россия 3ООО «Ростовский научно-исследовательский институт биотехнологии», 344038, Ростов-на-Дону, Россия
Изучалась способность медицинского препарата диоксидина вызывать образование антибиотикорезистентности у бактерий. Исследование проводилось с помощью биолюминесцентного теста с использованием рекомбинантных штаммов Escherichia coli MG 1655 (pSoxS-lux), MG1655 (pKatG-lux), MG1655 (pRecA-lux), MG1655 (pColD-lux), в геном которых введены плазмиды с опероном luxCDABE фотобактерии Photorhabdus luminescens, поставленным под контроль соответствующих стресс-индуцируемых промоторов E. coli, а также классических методик учета частоты образования устойчивых мутантов для непатогенных и условнопатогенных штаммов Escherichia coli, Bacillus amyloliquefaciens и Klebsiella pneumoniae. Показано, что диоксидин вызывает индукцию промоторов PrecA и Pcda у Escherichia coli MG1655, что свидетельствует об индукции SOS-ответа в бактериальной клетке. Индукция промотора Pcda была выше, чем PrecA. Максимального значения коэффициент индукции достигал при концентрации диоксидина 2,25 •10"5 М. Кроме того, данный препарат вызывал усиление индукции промоторов SoxS и KatG, реагирующих на присутствие супероксид-анион-радикала и перекиси водорода, что говорит о возможном участии окислительных механизмов в реализации повреждающего ДНК действия диоксидина. Максимальный коэффициент индукции также был зарегистрирован при концентрации 2,25 •10-5 М.
Диоксидин индуцирует мутации антибиотикорезистентности у всех исследованных штаммов бактерий. Было зарегистрировано увеличение частоты мутаций устойчивости к рифампицину в два раза, к ципрофлоксацину — до шести раз, к азитромицину — в четыре раза.
Исходя из приведенных данных, при назначении антибиотика необходимо проведение антибиотикограммы для всех лиц, принимающих или когда-либо принимавших диоксидин. Ключевые слова: антибиотикорезистентность, lux-биосенсоры, частота мутагенеза, диоксидин.
DOI 10.18821/0208-0613-2016-34-4-149-154
Антимикробные препараты, применение которых в целом вполне оправданно и эффективно при лечении социальнозначимых заболеваний, нередко обладают способностью индуцировать мутации у микроорганизмов. Последние могут быть причиной появле-
Для корреспонденции: Мазанко Мария Сергеевна, старший научный сотрудник лаборатории экспериментального мутагенеза Академии биологии и биотехнологии ЮФУ, e-mail: Mary.bio@list.ru
ния форм, устойчивых к целому ряду антимикробных агентов.
В серии работ Я.Т. С1те и соавт. [1] было показано, что применение фторхинолонов ведет к прогрессирующей потере их эффективности не только за счет отбора имеющихся в микробной популяции устойчивых вариантов, но и в результате более чем 20 000-кратного повышения частоты их возникновения за счет мутагенеза. При этом ципрофлоксацин и другие фторхинолоны не образуют аддуктов, интермедиатов, повреждающих ДНК, и не являются аналогами оснований. Подавление этими веществами ДНК-гиразы ведет к изменению топологии бактериальной хромосомы, которое и индуцирует SOS-ответ [2, 3]. В данном случае возможен химический мутагенез, развивающийся без появления разрывов, ДНК-аддуктов, модификации оснований и других серьезных изменений структуры ДНК за счет повышения активности ферментов SOS-репарации. Существует множество антимикробных препаратов, запускающих бактериальный SOS-ответ более распространенным способом, через генерацию активных форм кислорода (АФК) с последующим появлением разрывов ДНК и окислительной модификации оснований. Одним из наиболее активных в этом плане соединений является 1,4-диоксид 2,3-хиноксалиндиметанол, широко применяемый в России и странах СНГ под названием «диоксидин» [4—9]. Высокая антимикробная эффективность препаратов-окислителей во многом обусловлена тем, что АФК не имеют специфических молекулярных мишеней, и поэтому устойчивые к ним мутанты образуются с низкой частотой. Однако если препараты-окислители способны эффективно запускать у бактерий SOS-репарацию, то ввиду ненаправлености процессов классического мутагенеза они должны вызывать у микроорганизмов мутации устойчивости к другим антибиотикам и антимикробным препаратам. Целью нашего исследования была проверка справедливости данного предположения для диоксидина.
Материал и методы
Штаммы микроорганизмов. Для анализа экспрессии стресс-индуцибельных оперонов использовали рекомбинантные штам-
мы Escherichia coli MG1655 (pSoxS-lux), MG1655 (pKatG-lux), MG165 5 (pRecA-lux), MG165 5 (pColD-lux), содержащие плазмиды с опероном luxCDABE фотобактерии Photorhabdus luminescens, поставленным под контроль соответствующих промоторов E. coli. Данный оперон содержит гены люциферазы и их регуляторы и обеспечивает биолюминесценцию, используемую в данном тесте в качестве репортерной функции. Биосенсоры с промоторами PkatG и PsoxS позволяют регистрировать экспрессию оперо-нов, управляющих защитой от окислителей, образующих в клетке соответственно гидроперекиси и супероксид-анион-радикал [10, 11]. Биосенсоры с плазмидами pRecA, pColD фиксируют наличие в клетке факторов, вызывающих индукцию SOS-ответа.
Штамм Escherichia coli MG1655 (pColD-lux) был использован также для исследования индуцированного мутагенеза. Помимо этого использовали штаммы Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae ATCC 700603. Штамм Bacillus amyloliquefaciens B-1895 был использован нами в связи с устойчивостью бактерий семейства Enterobacteriaceae к макролидам. Штаммы Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae ATCC 700603 были получены нами у American Type Culture Collection. Bacillus amyloliquefaciens B-1895 был выделен в Исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов (Москва) и охарактеризован нами [12].
Биолюминесцентный тест. Нами был использован незначительно модифицированный протокол биолюминесцентного теста, подробно описанный в работах [13, 14].
Культивирование бактерий в жидкой питательной среде проводили при 37 °C до ранней или средней логарифмической фазы. Ночную культуру разбавляли свежей средой до плотности 0,01—0,1 единицы Мак-Фарланда (концентрация 3 • 107—3 • 106 клеток/мл).
Измерения проводили при помощи денситометра DEN-1B «Biosan» (Латвия). Затем суспензию подращивали в течение 2 ч до ранней логарифмической фазы. Аликвоты этой культуры (по 90 мкл) переносили в стерильные ячейки, находящиеся в стри-пах планшета, и добавляли в них по 10 мкл раствора диоксидина в деионизированной воде (кроме контрольных ячеек). Диоксидин использовали в диапазоне концентраций 2,25 • 10-2—2,25 • 10-8. В контрольные ячейки добавляли 10 мкл деионизированной воды.
После обработки планшет с пробами помещали в люмино-метр и инкубировали при 30 °C. Интенсивность биолюминесценции измеряли каждые 10—15 мин.
Для измерений люминесценции использовали микропланшетный люминометр LM-01T «Immunotech Co.» (Латвия). Как в жидкую, так и твердую среду добавляли антибиотик ампициллин (100 мкг/мл).
Коэффициент индукции (КИ) ответа биосенсоров (Is) вычисляли по формуле:
Is = L/Lk - 1, (1)
где Lk — интенсивность люминесценции контрольной пробы (в условных единицах); Lc — интенсивность люминесценции опытной пробы (в условных единицах).
Среднее квадратичное отклонение КИ вычисляли по формуле:
= IxV(——^ +(——^
(2)
где индексы e и k относятся к опыту и контролю соответственно.
Статистически значимые отличия от контроля определяли по значениям доверительных интервалов, рассчитанных по формуле:
(I ■
- t X —— I + t X —-),
кр V« кр V«
(3)
где I среднее значение коэффициента индукции; tк определяется по таблице распределения Стьюдента.
Расчеты доверительных интервалов проводили дляр < 0,05. Определение параметров спонтанного и индуцированного мутагенеза. Ночные культуры исследуемых микроорганизмов растили в среде ЬВ (900 мкл) с добавлением 100 мкл физраствора (контроль) либо раствора диокисдина нужной концентрации при 37 °С в течение 18—20 ч.
Затем культуры штаммов разводили свежей LB до 1—2 единиц Мак-Фарланда (36 •lO8 КОЕ). Оптическую плотность раствора измеряли при помошц денситометра DEN-1B «Biosan» (Латвия). Затем готовили ряд последовательных разведений культуры в физрастворе 1:10.
Производили поверхностный посев 100 мкл культуры на чашки с агаризованной средой LB с добавлением и без добавления антибиотика, согласно стандартной методике [15]. Для определения выживаемости использовали по 3 мутагенеза по 4 чашки. Подсчет колоний производили через 48 ч.
Выживаемость считали по формуле:
Выживаемость, % = n /n • 100%,
' опыт контроль '
где попыт — число клеток после инкубирования с индуктором, n — число клеток после инкубирования без индуктора.
контроль
Частоту мутантов считали по формуле:
Частота = n /n ,
опыт контроль
где n — число клеток на среде с антибиотиком, n —
опыт контроль
число клеток на среде без антибиотика.
Достоверность мутагенного эффекта оценивали по статистической значимости отличий (f-тест p < 0,05) по числу колоний между опытом и контролем с учетом разведения.
Результаты и обсуждение
На рис. 1 представлена типичная картина индукции свечения штамма сенсора (SOS-ответа) E. coli pRecA-Lux MG1655 диоксидином в эффективной концентрации 2,25 • 10-5 М.
Как видно на рис. 1, биолюминесценция штамма увеличивается в присутствии диоксидина.
На рис. 2 и 3 представлена полученная в опытах на штаммах E. coli pRecA-Lux MG1655 и E. coli pColD-Lux MG1655 зависимость КИ от концентрации диоксидина.
Видно, что, начиная с концентрации 2,25 • 10-6 М, диоксидин проявляет статистически значимую SOS-индукцию. Максимального значения в опытах с обоими биосенсорами этот показатель достигает для концентраций 2,25 *10"5 М. Далее эффект снижается, по-видимому, в результате подавления АФК ферментов SOS-репарации. Величина КИ при действии на штамм MG1655 (pColD-lux) значительно выше таковых для штамма MG1655 (pRecA-lux). Более высокая чувствительность первого штамма проявляется и при действии других ДНК-тропных веществ [11]. Основ-
Рис. 1. Индукция биолюминесценции штамма E. coli (pRecA-Lux) MG1655 диоксидином.
1 — люминесценция в контроле; 2 — люминесценция под действием диоксидина в концентрации 2,25 •lO"5 М. Отклонения от контроля статистически значимы на промежутке 50—120 мин. По оси абсцисс — время, мин; по оси ординат — интенсивность биолюминесценции, усл. ед.
S
Рис. 2. Индукция биолюминесценции штамма E. coli (pRecA-Lux) MG1655 диоксидином.
По оси абсцисс — концентрация, М; по оси ординат — коэффициент индукции (то же на рис. 3-5)
1,4 1,2 1
0,8 0,6 0,4 0,2 0 -0,2 -0,4
> 0,28
2,25 10"* 2,25-10"' 2,2 5-10"e 2,25-10"s 2,2 5-10"4 1Д25-10"3 2,25-М-3 0,00
Коцентрация, М
Рис. 4. Индукция биолюминесценции штамма E. coli (pKatG-lux) MG1655 диоксидином.
ным отличием в работе промоторов PrecA и Pcda (из плазмиды pColD) является наличие фоновой активности PrecA при нормальном метаболизме, без SOS-индукции, поскольку продукт регулируемого им гена — белок RecA необходим для нормального протекания процесса репликации хромосомы. Продукт же гена ColD, колицин, необходим клеткам только в стрессовых условиях, и выделяется во внешнюю среду в качестве киллера [11, 16].
Таким образом, диоксидин является эффективным индуктором SOS-ответа. Данное заключение, полученное с помощью методов биосенсорики, подтверждает вывод о зависимости диоксидинового мутагенеза от SOS-репарации, сделанный авторами работы [17] на основании генетических данных. Результаты, полученные с помощью биосенсоров MG1655 (pSoxS-lux), MG1655 (pKatG-lux), иллюстрируют важность окислительных механизмов для индуцируемого диоксидином повреждения ДНК. Для штаммов, реагирующих на присутствие супероксид-анион-радикала и перекиси водорода, были получены статистически значимые эффекты усиления свечения (рис. 4, 5).
Для штамма E. coli MG1655 (KatG-lux) КИ составил 3,96; для штамма E. coli MG1655 (SoxS-lux) — 4,97. Максимальные эффекты для данных биосенсоров были также получены для концентрации 2,25 • 10-5 М. Концентрация диоксидина, дающая максимальный SOS-
180 160
-е-
V
,<Ь > ,Л <о Jo *> <9 ,> ,> Р> Р> Д Д
ответ, была выбрана для исследования его способности вызывать мутации антибиотикорезистентности у бактерий (см. таблицу).
Как видно из таблицы, диоксидин индуцирует мутации антибиотикорезистентности у всех исследованных штаммов, в том числе и условнопатогенных. Кроме ожидаемых эффектов для E. coli MG1655, частота мутантов E. coli ATCC 25922 устойчивых к ци-профлоксацину увеличивается в 6 раз. Незначительно (примерно в 2 раза), однако статистически значимо, увеличивается частота мутантов данного штамма, устойчивых к рифампицину. Увеличение частоты мутантов Klebsiella pneumoniae subsp. pneumonia ATCC 700603, устойчивых к рифампицину, зарегистрировано не было, однако для ципрофлоксацина было зарегистрировано увеличение числа мутантов в 4 раза. Отмечено также более чем 4-кратное увеличение частоты мутантов Bacillus amyloliquefaciens B-1895, устойчивых к азитромицину.
Генотоксичность диоксидина подробно исследовалась отечественными авторами. В 70—80-е годы прошлого века было показано, что этот препарат способен повреждать ДНК E. coli (тест на дифференциальную выживаемость) и индуцировать реверсии к прототроф-ности у E. coli и S. typhimurium [19, 20]. Позже была описана способность диоксидина повреждать ДНК в клетках легких мышей [21]. В этих опытах мутагенез был эффективным в диапазоне концентраций от 4 до 16 мкг/мл. Использованная нами концентрация 5 мкг/мл
Коцентрация, М
Рис. 3. Индукция биолюминесценции штамма E. coli (pColD-Lux) MG1655 диоксидином.
Рис. 5. Индукция биолюминесценции штамма E. coli (pSoxS-lux) MG1655 диоксидином.
Частоты образования устойчивых мутантов
Штамм Выживаемость Мутагенез
разведение, контроль разведение, опыт среднее число колоний на чашке, контроль среднее число колоний на чашке, опыт вы-живае- мость % Спонтанный Индуцированный
разведение, контроль среднее число колоний на чашке, контроль частота спонтанных мутантов разведение, опыт среднее число колоний на чашке, опыт, при внесении антибиотика частота индуцированных мутантов
E. coli MG1655 10-7 10-7
E. coli ATCC 25922 10-7 10-7
Klebsiella 10-6 10-6
pneumoniae subsp. pneumonia ATCC 700603
E. coli MG1655 10-6 10-6
E. coli ATCC 25922 10-7 10-7
Klebsiella 10-7 10-7
pneumoniae subsp. Pneumonia ATCC
700603
Bacillus 10-7 10-7
amyloliquefaciens B-1895
Частоты образования мутантов, устойчивых к рифампицину 120 ± 7,4* 101 ± 11,8 131 ± 8,3 98 ± 9,1 154 ± 9,2 137 ± 13,4
Частоты образования мутантов, устойчивых к ципрофлоксацину
84% 10-1 117 ± 16,3 9.7 •■Ю-7 10-2 64 ± 7,3 6,4 •■Ю-6
75% 10-2 273 ± 16,4 2,1 •■Ю-5 10-3 39 ± 6,4 4 •■Ю-5
89% 10-1 123 ± 9,6 8 •■Ю-5 10-1 84 ± 8,3 6,1 •■Ю-5
63 ± 4,9 283 ± 16,7 135 ± 12,4
56 ± 6,4 232 ± 15,1 124 ± 5,3
89% 82% 92%
10-1 10-1 10-1
145 ± 13,8 18 ± 3,9 127 ± 15,1
2,3 -10-5 6.5 -10-s 94 •■Ю-7
Частоты образования мутантов, устойчивых к азитромицину 115 ± 10,1 104 ± 6,4 91% 10-1 90 ± 8,1 7,8 • 10-7
10-1 10-1 10-1
10-2
274 ± 19,3 91 ± 11,9 48 ± 8,8
36 ± 9,9
4,9 3,9 3,9
10-5 10-7 10-6
3,4 • 10-6
* ошибка репрезентативности среднего [17].
попадает в данный диапазон. Ее близость к его минимальной границе, по-видимому, объясняется тем, что в нашей экспериментальной системе клетки росли в присутствии мутагена 18—20 ч, а в опытах наших коллег время обработки составляло 30 мин. Степень усиления мутагенеза, зарегистрированная в ранних работах по реверсиям к прототрофности, сопоставима с нашими данными. Исключение составляют варианты, в которых исследовали высокие дозы, вызывающие значительное падение выживаемости [18].
Использованная нами концентрация диоксидина в тысячи раз меньше концентраций, рекомендуемых для аппликаций или внутриполостного введения (официальная инструкция к препарату «Диоксидин»). Разбавление ди-оксидина до уровня, эффективно вызывающего обогащение популяций бактерий генами антибиотикорезистент-ности, вполне вероятно не только в очаге инфекции, но и в удаленных от него тканях и органах. Однако это предположение требует проверки в условиях клиники.
Помимо ингибиторов ДНК-гиразы, генераторов АФК и веществ, непосредственно атакующих генетический аппарат бактерий, способностью запускать SOS-ответ обладают бета-лактамы. В работе [22] описан механизм запуска этими веществами мутагенеза, ведущего к образованию устойчивых штаммов. В уже цитируемой нами работе [1] была поставлена задача синтеза блокаторов SOS-ответа, которые при введении дополнительно к антибиотикам подавляли бы процессы мутагенеза, ведущие к накоплению устойчивости к антибиотикам. К сожалению, эта задача далека от решения. Полученные нами данные являются дополнительным подтверждением ее актуальности.
В заключение позволим себе сформулировать практические рекомендации, вытекающие из полученных нами результатов. Как упоминалось выше, время обработки бактерий в нашей экспериментальной системе составило 18—20 ч, в то время как в медицинской практике диоксидин применяется недельными курсами. Можно
предположить, что накопление устойчивых к другим антимикробным препаратам мутантов идет при его использовании достаточно интенсивно. Ясно, что полученные данные не могут являться основанием для запрещения такого эффективного препарата, как диоксидин, однако они указывают на то, что при его применении следует учитывать риск обогащения метагенома больного генами устойчивости не только к диоксидину, но и к препаратам, которые больной никогда до этого не получал. Хотя в современных клиниках выделение патогенного микроорганизма с последующей постановкой антибио-тикограммы является тривиальной процедурой [23], по ряду причин это делается далеко не всегда. Наличие в истории болезни записи о лечении диоксидином, независимо от давности применения этого препарата, делает проведение такого анализа крайне необходимым.
Выражаем благодарность Серикбаю Каримовичу Абилеву за ценные замечания, высказанные в ходе обсуждения работы.
Финансирование. Работа выполнена при поддержке Министерства науки и образования РФ (проект 6.1202.2014/K).
ЛИТЕРАТУРА
1. Cirz R.T., Chin J.K., Andes D.R. et al. Inhibition of mutation and combating the evolution of antibiotic resistance. PLoS biology. 2005; 3(6): 1024—33. DOI: 10.1371journal.pbio.0030176
2. Diver J.M. Quinolone uptake by bacteria and bacterial killing. Review of Infectious Diseases. 1989; 11(5): S941—6.
3. Drlica K., Malik M., Kerns R.J., Zhao X. Quinolone-mediated bacterial death. Antimicrobial agents and chemotherapy. 2008; 52(2): 385—92. doi: 10.1128/AAC.01617-06.
4. Большаков Л.В. Изменения в чувствительности клинических штаммов бактерий к диоксидину с 1984 по 1988. Антибиотики и химеотерапия. 1990; 35(9): 17—9.
5. Попов Д.А., Анучина Н.М., Терентьев А.А. Костюк Г.В., Блатун Л.А., Русанова Е.В. и др. Диоксидин: антимикробная активность и перспективы клинического применения на современном этапе. Антибиотики и химиотерапия. 2013; 58(3—4): 37—42.
6. Глушков Р.Г., Соколова Г.В., Крылова Л.Ю., Стебаева Л.Ф., Шарова С.А. и др.. Новый комбинированный противотуберкулезный препарат: оригинальный комбинированный противотуберкулезный препарат диоксазид. Проблемы туберкулеза и болезней легких. 2007; (3): 20—5.
7. Мусаев П.И., Мамедов Л.А., Караева Г.З. Лечение экспериментальных травм роговицы растворами диоксидина и уротропина. Вестник Офтальмологии. 2000; 116(6): 20—3.
8. Пономарева Т.Р. Чувствительность клинических бактериальных штаммов к диоксидину в аэробных и анаэробных условиях in vitro. Антибиотики и медицинская биотехнология. 1987; 32(3): 199— 202.
9. Бекбергенов Б.М., Антипов А.В., Данильянц Е.В., Королев П.Н., Глезер Г.А. Клиническое и экспериментальное изучение диоксидина. Бактериальная активность. Антибиотики. 1982; 27(5): 349—52.
10. Farr S.B., Kogoma T. Oxidative stress responses in Escherichia coli and Salmonella typhimurium Microbiol. Rev. 1991; 55: 561—85.
11. Котова В.Ю., Манухов И.В., Завильгельский Г.Б. Lux-биосенсоры для детекции SOS-ответа, теплового шока и окислительного стресса. Биотехнология. 2009; (6): 16—25
12. Karlyshev A.V., Melnikov V.G., Chistyakov V.A. Draft genome sequence of Bacillus amyloliquefaciens B-1895. Genome announcements. 2014; 2(3): e00633-14. DOI: 10.1128genomeA.00633-14
13. Чистяков В.А., Семенюк Ю.П.,. Морозов П.Г, Празднова Е.В., Чмыхало В.К. и др. Синтез и биологические свойства производных нитробензоксадиазолов — потенциальных доноров оксида азота (II): SOX-индукция, токсичность, генотоксичность и ДНК-протекторная активность в опытах на lux-биосенсорах Escherichia coli. Изв. АН, Сер. Химия. 2015; (6): 1369—77.
14. Prazdnova E.V., Chistyakov V.A., Churilov M.N., Mazanko M.S., Bren A.B. et al. DNA-protection and antioxidant properties of fermentates from Bacillus amyloliquefaciens B-1895 and Bacillus subtilis KAT-MIRA1933. Letters in Applied Microbiology. 2015; 61(6): 549—54.
15. Семина Н.А., Сидоренко С.В., Резван С.П. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. Методические указания МУК. 2004; (4): 1890—904.
16. Манухов И.В., Котова В.Ю., Мальдов Д.Г., Ильичев А.В., Бельков А.П., Завильгельский Г.Б. Индукция окислительного стресса и SOS-ответа в бактериях Escherichia coli растительными экстрактами: роль гидроперекисей и эффект синергизма при совместном действии с цисплатиной. Микробиология. 2008; 77(5): 18.
17. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа; 1990.
18. Абилев С.К., Сурайкина Т.И., Фонштейн Л.М. Изучение инкти-вирующего и мутагенного действия диоксидина на внеклеточный бактериофаг Т4 и индикаторные штаммы Escherichia coli. Хим. фарм. журнал. 1978; 10: 18—22.
19. Фонштейн Л.М., Абилев С.К., Облапенко Н.Г. О характере мутагенного действия диоксидина на бактерии. Цитология и генетика (Киев). 1980; 14(1): 60—4.
20. Фонштейн Л.М., Абилев С.К., Акиньшина Л.П., Захарова И.А., Иванова Н.А., Олапенко Н.Г. и др. Исследование генетических эффектов лекарственных веществ и других биологически активных соединений в тестах на мутагенез и ДНК-повреждающее действие. Хим. фарм. журнал. 1978; (10): 11—6.
21. Абилев С.К., Абдразаков М.М. Органоспецифичность ДНК-повреждающего действия диоксидина. Генетика. 1991; 27(11): 2039—41.
22. Miller C., Thomsen L.E., Gaggero C. et al. SOS response induction by Blactams and bacterial defense against antibiotic lethality. Science. 2004; 305(5690): 1629—31. DOI: 10.1126science.1101630
23. Инструкция по медицинскому применению препарата Диоксидин, регистрационный номер: Р №00253402—2003 от 10.04.2008.
Поступила 01.04.16
REFERENSES
1. Cirz R.T., Chin J.K., Andes D.R. et al. Inhibition of mutation and combating the evolution of antibiotic resistance. PLoS biology. 2005; 3(6): 1024—33. DOI: 10.1371journal.pbio.0030176
2. Diver J.M. Quinolone uptake by bacteria and bacterial killing. Review of Infectious Diseases. 1989; 11(5): S941—6.
3. Drlica K., Malik M., Kerns R.J., Zhao X. Quinolone-mediated bacterial death. Antimicrobial agents and chemotherapy. 2008; 52(2): 385—92. doi: 10.1128/AAC.01617-06.
4. Bol'shakov L.V. Changes in sensitivity of bacteria clinical strains to dioxidine from 1984 to 1988. Antibiotiki i himeoterapiya. 1990; 35(9): 17—9. (in Russian)
5. Popov D.A., Anuchina N.M., Terent'ev A.A., Kostyuk G.V., Blatun L.A., Rusanova E.V. et al. Dioxidine: antimicrobial activity and prospects for clinical use at the present stage. Antibiotiki i himioterapiya. 2013; 58(3—4): 37—42. (in Russian)
6. Glushkov R.G., Sokolova G.V., Krylova L.Yu., Stebaeva L.F., Sharova S.A. et al. The new combined anti-TB drug: The original combined anti-TB drug. Dioxazide. Problemy tuberkuleza i bolezney legkikh. 2007; (3): 20—5. (in Russian)
7. Musaev P.I., Mamedov L.A., Karaeva G.Z. Corneal injury experimental treatment by dioxidine and hexamine solutions. Vestnik Oftal'mologii. 2000; 116(6); 20—3. (in Russian)
8. Ponomareva T.R. Sensitivity of clinical bacterial strains to dioxidine under aerobic and anaerobic conditions in vitro. Antibiotiki i medicinskaya biotehnologiya. 1987; 32(3): 199—202. (in Russian)
9. Bekbergenov B.M., Antipov A.V., Danil'janc E.V., Korolev P.N., Glezer G.A. et al. Dioxidine clinical and experimental study. Bacterial Activity Antibiotiki. 1982; 27(5): 349—52. (in Russian)
10. Farr S.B., Kogoma T. Oxidative stress responses in Escherichia coli and Salmonella typhimurium. Microbiol. Rev. 1991; 55: 561—85.
11. Kotova V.Yu., Manuhov I.V., Zavil'gel'skiy G.B. Lux-biosensors for the detection of SOS-response, heat shock, and oxidative stress. Biotehnologiya. 2009; (6): 16—25. (in Russian)
12. Karlyshev A.V., Melnikov V.G., Chistyakov V.A. Draft genome sequence of Bacillus amyloliquefaciens B-1895. Genome announcements. 2014; 2(3): e00633-14. DOI: 10.1128genomeA.00633-14):
13. Chistyakov V.A., Semenyuk Yu.P.,. Morozov P.G, Prazdnova E.V., Chmyhalo V.K. et al. Synthesis and biological properties of the nitrobenzene derivatives of oxadiazoles — potential nitric oxide donors (II): SOX-induction, toxicity, genotoxicity and DNA tread activity in experiments on lux-biosensors Escherichia coli. Izv. AN, Ser. Him. 2015; (6): 1369—77. (in Russian)
14. Prazdnova E.V., Chistyakov V.A., Churilov M.N., Mazanko M.S., Bren A.B. et al. DNA-protection and antioxidant properties of fermentates from Bacillus amyloliquefaciens B-1895 and Bacillus subtilis KATMIRA1933. Letters in Applied Microbiology. 2015; 61(6): 549—54.
15. Semina N.A., Sidorenko S.V., Rezvan S.P. Determination of the microorganisms sensitivity to antibiotics. Metodicheskie ukazaniya MUK. 2004; (4): 1890—904. (in Russian)
16. Manuhov I.V., Kotova V. Yu., Mal'dov D.G., Il'ichev A.V., Bel'kov A.P., Zavil'gel'skiy G.B. The induction of oxidative stress and the SOS-response in the Escherichia coli by plant extracts: the role of hydroperoxide and synergy under the combined action with cisplatin. Mikrobiologiya. 2008; 77(5): 18. (in Russian)
17. Lakin G.F. Biometriya. Moscow: 1990. (in Russian)
18. Abilev S.K., Suraykina T.I., Fonshtejn L.M. Study inactivating and mutagenic action of dioxidine to extracellular bacteriophage T4 and indicator strains of Escherichia coli. Him. farm. zhurnal. 1978; (10): 18—22. (in Russian)
19. Fonshteyn L.M., Abilev S.K., Oblapenko N.G. The nature of the dioxidine mutagenic effect on bacteria. Citologiya i genetika (Kiev). 1980; 14(1): 60—4. (in Russian)
20. Fonshteyn L.M., Abilev S.K., Akin'shina L.P., Zaharova I.A., Ivanova N.A., Olapenko N.G. et al. Study of genetic effects of drugs and other biologically active compounds in tests for mutagenesis and DNA-dam-aging effect. Him. farm. zhurnal. 1978; 10: 11—6. (in Russian)
21. Abilev S.K., Abdrazakov M.M. Organ specificity of dioxidine DNA-damaging action. Genetika. 1991; 27(11): 2039—41. (in Russian)
22. Miller C., Thomsen L.E., Gaggero C., Mosseri R., Ingmer H., Cohen S.N. SOS response induction by ßlactams and bacterial defense against antibiotic lethality. Science. 2004; 305(5690): 1629—31. DOI: 10.1126science.1101630
23. Instruction for medical use drug Dioxidine, registration number: P №002534 02—2003 dated 10.04.2008. (in Russian)
M.S. Mazanko', VA. Chistyakov1,3, E.V. Prazdnova1, I.O. Pokudina', M.N. Churilov1, V.K. Chmyhalo1, M.M. Batyushin2
DIOXIDINE INDUCE ANTIBIOTIC-RESISTANT BACTERIA
Southern Federal University, the Academy of Biology and Biotechnology n.a. D.I. Ivanovsky, 2Rostov State Medical University 3Rostov Research Institute of Biotechnology
The ability of dioxidine to cause the formation of antibiotic resistance in bacteria was investigated. The study was conducted through the bioluminescence test using recombinant strains of Escherichia coli MG 1655 (pSoxS-lux), MG1655 (pKatG-lux), MG1655 (pRecA-lux), MG1655 (pColD-lux), whose genome contains a plasmid with operon luxCD-ABE from photobacteria Photorhabdus luminescens under the control of the appropriate stress-inducible promoters of E. coli. Classical methods of resistance mutation frequency determination were also allowed in non-pathogenic and conditionally-pathogenic strains of Escherichia coli, Bacillus amyloliquefaciens and Klebsiella pneumoniae. It is shown that dioxidine can cause induction of the promoters
PrecA and Pcda in Escherichia coli MG 1655, which indicates the induction of SOS-response in the bacterial cell. Induction of Pcda promoter was higher than of PrecA. The maximum induction was observed under the action of 2,25 • 10-5 M dioxidine solution. The drug also causes increased induction of psoxS and pkatG promoters, reacting to the presence of superoxide anion radical and hydrogen peroxide. That allows suggesting the possible involvement of oxidative mechanisms in DNA-damaging action of dioxidine. Maximum induction ratio was also registered at a concentration of 2,25 • 10"5 M.
Dioxidine induces antibiotic resistance mutations in all studied strains of bacteria. The increasing in a the frequency of mutations have been reported for rifampicin resistance (twice), ciprofloxacin (up to six times) and azithromycin (four times). Based on these data, the antibiotic designation is necessary to conduct antibiogram for all patients who take, or ever took dioxidine. Keywords: antibiotic resistance, lux-biosensors, mutagenesis frequency, dioxidine
DOI 10.18821/0208-0613-2016-34-4-149-154
For correspondence: Mazanko Maria sergeevna, a senior researcher at the laboratory of experimental mutagenesis, Academy of biology and biotechnology, Southern Federal University
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016 УДК 578.821.51:578.1].083.2:615.277.3
Зонов Е.В.1, Кочнева Г.В.2, Тупицына А.В.1, Рябчикова Е.И.1
противоопухолевый эффект апоптин-продуцирующего рекомбинантного штамма вируса осповакцины IN VIVO свяэан
с блокированием митотического деления опухолевых клеток
'Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской Академии наук, 630090,
Новосибирск, Россия;
2Государственный научный Центр биотехнологии и вирусологии «Вектор», 630559, Кольцово, Россия
Вирус осповакцины (ВОВ) обладает природной онколитической активностью, для усиления которой в геном вируса встраивают гены, кодирующие различные эффекторные молекулы, в частности, индуцирующие апоптоз опухолевых клеток. Одним из таких трансгенов является белок апоптин. Цель данной работы: изучить на модели сингенной опухоли мышей противоопухолевое действие рекомбинантного апоптин-продуцирующего штамма VVdGF-ApoS24/2 ВОВ.
Мышам линии С57В1 подкожно или внутрибрюшинно прививали мышиную карциному Эрлиха, после формирования опухолей однократно интратуморально вводили 107 БОЕ/мышь штамма VVdGF-ApoS24/2, мышам контрольной группы вводили 0.9% раствор ЫаС1. Животных выводили из эксперимента в различные сроки после введения ВОВ. Образцы опухолевых узлов и клетки асцитической жидкости фиксировали в 4% параформальдегиде, проводили светооптическое, иммуноги-стохимическое и ультраструктурное исследование опухолей; определяли титр вируса в опухолевых клетках методом БОЕ. Штамм VVdGF-ApoS24/2 ВОВ вызывал отчетливое уменьшение объема и солидной, и асцитной карцином Эрлиха по сравнению с опухолями мышей группы контроля, несмотря на низкий уровень репродукции вируса в опухолевых клетках. Противоопухолевый эффект штамма VVdGF-ApoS24/2 не был связан с вирус-индуцированными деструкцией, некрозом и апоптозом опухолевых клеток, а также с накоплением эффекторных клеток иммунной системы в опухолях. На срезах карциномы наблюдалось снижение числа опухолевых клеток в состоянии митоза, а анализ количества Кь67- и РСЫА-позитивных клеток показал, что штамм VVdGF-ApoS24/2
Для корреспонденции: Рябчикова Елена Ивановна, д-р биол. наук, профессор, руководитель группы микроскопических исследований, Институт химической биологии и фундаментальной Медицины СО РАН, E-mail: lenryab@yandex.ru.
останавливает клеточный цикл в S-фазе, тормозя деление опухолевых клеток и замедляя рост опухоли. Полученные результаты свидетельствуют, что встройка гена, кодирующего апоптин, в геном исходного штамма Л-ИВП ВОВ усиливает его способность останавливать клеточный цикл опухолевых клеток карциномы Эрлиха.
Ключевые слова: рекомбинантный вирус осповакцины, апоптин, онколитическое действие, карцинома Эрлиха.
DOI 10.18821/0208-0613-2016-34-4-154-159 Введение
Противоопухолевые свойства ряда вирусов, получивших название онколитических (ОВ), описаны в многочисленных публикациях [1—3]. Одним из перспективных ОВ является вирус осповакцины (ВОВ), природные онколитические свойства которого отмечены много лет назад [4]. Современные исследования направлены на усиление эффекторных свойств ВОВ, в том числе — путем встройки в его геном трансгенов, индуцирующих апоптоз опухолевых клеток, например, гена апоптина, кодирующего неструктурный белок вируса анемии цыплят, который избирательно индуцирует апоптоз в опухолевых клетках [5]. В ГНЦ вирусологии и биотехнологии «Вектор» был сконструирован рекомбинантный штамм ВОВ VVdGF-ApoS24/2, несущий ген апоптина и делецию гена вирусного ростового фактора, обладающий усиленным онколитическим действием на опухолевые клетки in vitro по сравнению с исходным штаммом Л-ИВП [6]. Сравнительное изучение противоопухолевого действия этого штамма с исходным штаммом Л-ИВП на модели карциномы человека А431, привитой
