CC BY
47
УДК 574, 579, 57.08
ДЕТЕКЦИЯ СЫРОЙ НЕФТИ ПРИ ПОМОЩИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ LUX-БИОСЕНСОРОВ © 2011 г. Е.В. Празднова1, А.В. Севрюков1, Е.В. Новикова2, З. С. Кхатаб1
Рассматривается новая методика детекции нефти и нефтепродуктов в водной среде при помощи бактериальных биосенсоров. Генноинженерный штамм E.coli (RecA-lux) и природный биолюминесцентный штамм Vibrio Fischeri, выделенный из вод Черного моря, позволяют определить концентрацию нефтепродуктов в пробах воды в диапазоне концентраций 10-7 — 101 мг/л. Принципиальная новизна данного метода по сравнению с уже существующими заключается в статусе нефтепродуктов в тест-системе, являющихся в данном случае не субстратом, а токсикантом.
Ключевые слова: нефть, нефтепродукты, токсичность, генотоксичность, биосенсоры, биолюминесценция.
The new method of bacterial biosensor-based detection of oil and petroleum products in water is proposed. Gene-modified strain of E.coli MG1655 (RecA-lux) and native strain of Vibrio Fischeri extracted from the Black Sea were used for determination of oil levels in water samples in a concentration range 1С7 — 101 mg / liter. The novelty of this method compared with the existing ones is in the status of oil in test system: it is assumed to be the toxicant rather than the substrate.
Keywords: oil, oil products, toxicity, genotoxicity, biosensors, bioluminescence.
1Научно-исследовательский институт биологии Южного федерального университета, пр. Стачки, 194/1, г. Ростов н/Д, 344090, niib@sfedu.ru
1Scientific Research Institute of Biology of Southern Federal University, Stachki Ave, 194/1, Rostov-on-Don, 344090, niib@sfedu.ru
Южный федеральный университет,
ул. Б. Садовая, 105/42, г. Ростов н/Д, 344006,
decanat@bio.sfedu.ru
2.
Southern Federal University, B. Sadovaya St., 105/42, Rostov-on-Don, 344006, decanat@bio.sfedu.ru
2i
Несмотря на значительный прогресс в обеспечении безопасности технологий добычи и транспортировки нефти, нефтяное загрязнение по-прежнему остается одним из основных видов негативного антропогенного воздействия на природные экосистемы. Для мониторинга нефтяного загрязнения используются разные методические подходы, которые условно можно разделить на две группы: методы химического анализа нефтепродуктов и методы биотестирования [1].
Авторы большинства работ по биодетекции нефти фактически копируют подход аналитической химии, разрабатывая биосенсоры на отдельные нефтепродукты, в основном на толуол и родственные ему ароматические углеводороды [2, 3]. Между тем главный недостаток биотестов - низкая специфичность, оборачивается при детекции сырой нефти преимуществом, поскольку этот минерал представляет собой сложную смесь представителей различных органических соединений: практически всех классов углеводородов, металоорганики, галогенорганики, соединений азота, серы и т.д. [4]. Эти вещества способны вызывать широкий спектр токсических эффектов, что, по нашему мнению, делает перспективным использование люминесцентных биосенсоров, предназначенных как для детекции различного рода специфических негативных эффектов (повреждения ДНК, индукции окислительного стресса, денатурации клеточных белков), так и общей токсичности нефти.
В настоящее время для детекции нефти и нефтепродуктов уже применяют бактериальные флуоресцентные и биолюминесцентные биосенсоры. Бактериальные Lux-биосенсоры часто используются для определения общей токсичности в районах аварийных разливов нефти и местах добычи нефти и газа [5 - 9]. В частности, разработаны Lux-биосенсоры для определения толуола, в которых использованы промоторы генов, разлагающих толуол почвенных бактерий Pseudomonas putida и Ralstonia pickettii, а в качестве репортерных генов - гены GFP (ген Aequorea victoria) и luxCDABE (ген Vibrio fischeri), отвечающие за флуоресценцию и биолюминесценцию [2, 3]. Различные нефтепродукты, такие как этилбензол, бензальдегид, фенол, в воде и экстрактах почвы определяются при помощи этих методов в концентрациях порядка 10 ммоль/л (1,0610-5, 1,0610-5, 9,4 • 10-5 мг/л). С учетом того, что ароматические углеводороды составляют до 40 % сырой нефти, чувствительность по нефти будет примерно в 2 раза ниже.
На наш взгляд, принципиальным недостатком данного подхода является статус нефтепродуктов, которые детектируются как субстрат, а не как токсин и возможный генотоксин в бактериальной тест-системе. Промоторы оперонов, функция которых состоит в утилизации некого вещества, не отличаются высокой чувствительностью, поскольку утилизация имеет смысл лишь при достаточно высокой концентрации субстрата, в то время как «защитные опероны», чтобы обеспечить оперативность защиты, должны реагировать на как можно меньшие концентрации индукторов.
Цель данной статьи - разработка методов детекции нефти на основе генно-инженерных биосенсоров, чувствительных к повреждению ДНК и окислительному стрессу, а также природного штамма морской фотобактерии Vibrio fisheri.
Материалы и методы
В работе использовали сырую нефть из Октябрьского месторождения в Ростовской области из скважины № 41, пласта XXII. Эмульсию нефти разбавляли в 1%-м растворе TWEEN-80 (Amresco, США) в дистиллированной воде.
В качестве тест-объектов применяли биолюминесцентные биосенсоры на основе штаммов Escherichia coli AB1157 и MG1655, содержащие плазмиды pKatG-lux, pSoxS-lux и pRecA-lux, несущие отвечающий за люминесценцию оперон Photorhabdus luminescens, поставленный под контроль соответствующих промоторов katG, soxS и recA [10], а также природный штамм V.fisheri NB 15, выделенный из акватории Черного моря. Рекомбинантные штаммы предоставлены сотрудниками ГосНИИ генетики, Москва.
Культуры генно-инженерных штаммов выращивали в среде Луриа-Бертани (LB) [11] при 37 °C. Ночную культуру разбавляли в свежей среде до концентрации 107 кл/мл и подращивали в течение 2,5 ч.
В лунки планшета добавляли 180 мкл свежей культуры и 20 мкл суспензии нефти. Конечная концентрация нефти составляла 2 10-4 мг/л.
Для определения промутагенной активности использовали метаболическую активацию. В лунки планшета дополнительно добавляли по 10 мкл смеси, содержащей микросомную фракцию печени крыс.
Смесь для метаболической активации готовили следующим образом: к 200 мкл 0,2 N калий-фосфатного буфера (pH=7,4) добавляли 800 мкл дистиллированной воды, 6 мг НАДФ (AppliChem, Германия), 7 мг глюкозо-6-фосфата (AppliChem, Германия), 200 мкл раствора солей (123 г/л KCl (Реахим, Россия, т.ч.), 120 г/л MgSO4-7H2O (Реахим, Россия, х.ч.)), 800 мкл S9, приготовленной из лиофилизированного препарата согласно инструкции производителя (Moltox, США).
V.fisheri культивировали в среде LB с 3%-м NaCl при 27 °C. Суточную культуру V.fisheri разбавляли в 20 раз и культивировали в течение 1 ч.
100 мкл свежей культуры добавляли к 20 мл смеси, содержащей 16,4 мл дистиллята, 3,5 мл 17%-го раствора NaCl (Реахим, Россия, т.ч.), 20 мкл 10%-й глюкозы (Медис, Россия, х.ч.), 20 мкл 1 М калий-фосфатного буфера.
Интенсивность биолюминесценции измеряли на планшетном люминометре LM-01 T (Immunotech) в течение 130 мин.
Расчет токсичности проводили по стандартной формуле для биолюминесцентного теста на токсичность [12].
Статистическая обработка данных проводилась по стандартной методике [13]. Достоверность отличия биолюминесценции в опыте от контрольной величины оценивали по t-критерию.
Результаты и их обсуждение
Следует отметить, что при изучении влияния сырой нефти на люминесценцию штаммов - носителей sox- и kat-оперонов наблюдалось подавление люминесценции в 4^10 раз концентрациями нефти 1103-2 104 мг/л, что можно объяснить общей токсичностью нефти. Индукцию не вызывала ни одна из изученных концентраций.
Без метаболической активации, при воздействии относительно низкими концентрациями нефти (10-3^10-1 мг/л) RecA-биосенсор (E. coli AB1157 (pRe-cA-lux)) также не демонстрирует статистически значимой индукции, а при действии более высоких концентраций наблюдается подавление свечения культуры биосенсора.
На рис. 1 приведена динамика биолюминесценции штамма E. coli AB1157 (pRecA-lux) при действии концентраций нефти в диапазоне 10-7^10-2 мг/л при метаболической активации. Концентрации регистрируются тест-системой. Генотоксичность более высоких концентраций (10-1^104) маскируется токсическим эффектом, проявляющимся как подавление свечения. Время, за которое развивается максимальный ответ биосенсора, составляет 110^130 мин.
На рис. 2 представлена динамика биолюминесценции V. fishe-ri при действии разных концентраций нефти. Статистически значимые изменения биолюминесценции регистрируются для концентраций от
вызывают
^контроль
Рис. 1
■10
■1СГ
■1СГ
-Ж—1*103
110 120 130 Время, мин •1*104
Ответ штамма E. coli AB 1157 (pRecA-lux) на действие нефти, мг/л при метаболической активации
250
£
о и н
200
150
10"6-2 104 мг/л,
индук-103 мг/л и выше -
100
50
10"'
10"
Рис.
10-6-10-1 мг/л цию свечения, ее подавление.
Следовательно, вышеприведенные результаты свидетельствуют, что методика с использованием Ьих-оперона под контролем гесА промотора позволяет достоверно определить нефть в среде в диапазоне концентраций 10-7^10-1 мг/л. Предельно допустимая концентрация (ПДК) сырой нефти в воде объектов культурно-бытового пользования и хозяйственно-питьевого назначения не более 10-1^3 10-1 мг/л; водных объектов рыбохозяйственного назначения -не более 0,05 мг/л [14]. Таким образом, чувствительность использованного нами ЯесА-биосенсора позволяет определять присутствие нефти в концентрациях, сопоставимых с ПДК, экстраполировать полученные нами данные на многоклеточные организмы, так как данная методика частично воспроизводит механизм взаимодействия ксенобиотика с ферментативными системами многоклеточных.
Использованный в работе штамм V. /мквп также отличается высокой чувствительностью к нефти. Концентрации до 10 мг/л вызывают индукцию свечения, большие концентрации - ее подавление. Аналогичные результаты получены и при использовании других методов [15, 16]. Минимальная действующая концентрация
10"6 10"5 10"4 10"1 10"2 10"1 10° 101 102 103 104 2-104
Концентрация нефти, мкг/мл
2. Изменение биолюминесценции Vibrio fisheri при действии нефти. Биолюминесценция контрольной пробы - 5952 усл. ед.
составляет 10-5 мг/л, что на несколько порядков ниже ПДК для рыбохозяйственных водоемов.
Расчеты, проведенные по стандартным формулам для токсичности в биолюминесцентном тесте [12], свидетельствуют, что токсичность минимальной действующей концентрации нефти - 37,7; максимальная степень индукции зарегистрирована для концентрации 10-3 мг/л (токсичность при этом равняется 94,5).
Природный штамм У./и'квп выделен из Черного моря, на берегах и акватории которого ведутся нефтеразведка, нефтедобыча и транспортировка нефти. Высокая чувствительность свечения данного штамма к присутствию нефти, проявляющаяся в форме индукции люминесценции ее низкими концентрациями, может быть связана с развитием адаптации природных светящихся бактерий к хроническому нефтяному загрязнению. Механизмы этих процессов требуют дальнейшего изучения.
Таким образом, генно-инженерные биосенсоры, созданные на основе генома E.coli, а также природный штамм V. fisheri обладают высокой чувствительностью к сырой нефти и могут быть использованы в экологическом мониторинге.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и образования РФ (проект по аналитической ведомственной целевой программе «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2010 гг.) », гранты № 2.1.1/5028, № 2.1.1/5232).
Литература
1. Кузнецов В.В. Химические основы экологического мониторинга // СОЖ. Химия. 1999. № 1. C. 35-40.
2. Construction and comparison of fluorescence and bioluminescence bacterial biosensors for the detection of bioavail-able toluene and related compounds / Y.-F. Li [et al.] // Environmental Pollution. 2008. № 152. P. 123-129.
3. Stiner L., Halverson L.J. Development and Characterization of a Green Fluorescent Protein-Based Bacterial Biosensor for Bioavailable Toluene and Related Compounds // Appl. Environ. Microbiology. 2002. Vol. 68, № 4. P. 1962-1971.
4. Сергиенко С.Р. Высокомолекулярные соединения нефти. М., 1964. 541 с.
5. Оценка токсичности среды обитания в юго-восточной части Азовского моря методами биологического тестирования / И.Г. Корпакова [и др.] // Защита окружающей среды в нефтегазовом комплексе. 2008. № 11. С. 62-69.
6. О проблеме оценки токсичности компонентов водной среды методами биологического тестирования / И.Г. Корпакова [и др.] // Вопросы рыболовства. 2008. Т. 9, № 4. С. 839-846.
7. Оценка токсичности воды и донных отложений Керченского пролива и прилегающих акваторий Черного и Азовского морей по данным биотестирования / И.Е. Цы-бульский [и др.] // Керченская авария: последствия для водных экосистем / под ред. И.Г. Корпаковой, С.А. Агапова. Ростов н/Д, 2008. С. 106-124.
8. Методологические проблемы оценки токсичности компонентов среды методами биотестирования / И.Г. Корпакова [и др.] // Защита окружающей среды в нефтегазовом комплексе. 2007. № 9. С. 23 - 29.
9. Оценка токсичности среды обитания гидробионтов в районе лицензионного участка ООО «НК «Приазовнефть» методами биологического тестирования / И.Г. Корпакова [и др.] // Защита окружающей среды в нефтегазовом комплексе. 2006. № 9. С. 98 - 106.
10. Zavilgelsky G.B., Kotova V.Yu., Manukhov I. V. Action of 1,1-dimethylhydrazine on bacterial cells is determined by hydrogen peroxide // Mutation Research. 2007. № 634. P. 172-176.
11. Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook J. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. N.Y., 1982. 545 p.
12. Определение общей токсичности почв по интенсивности биолюминесценции бактерий : МР № 11-1/134-09 от 08 июня 2000 г. М., 2000. 8 с.
13. Лакин Г.Ф. Биометрия. М., 1990. 352 с.
14. ГОСТ РФ 51858-2002 «Нефть. Общие технические условия». М., 2006. 7 с.
15. Пат. РФ 2346035. Штамм бактерий Vibrio fischery, используемый в качестве тест-культуры для определения токсичности объектов окружающей среды / Сазыкина М.А., Цыбульский И.Е.
16. Пат. РФ 2342434. Штамм бактерий Vibrio fischery, используемый в качестве тест-культуры для определения токсичности объектов окружающей среды / Сазыкина М.А., Цыбульский И.Е.
Поступила в редакцию_15 октября 2010 г.
