CC BY
74
УДК 57.04; 575.2;579
ПЕРЕКИСЬ ВОДОРОДА И ГЕНОТОКСИЧНОСТЬ УЛЬТРАФИОЛЕТОВОГО ИЗЛУЧЕНИЯ С ДЛИНОЙ ВОЛНЫ 300-400 НМ
© 2012 г Е.В. Празднова, В.А. Чистяков, М.А. Сазыкина, И.С. Сазыкин, З.С. Кхатаб
Научно-исследовательский институт биологии Institute of Biology of Southern Federal University,
Южного федерального университета, Stachki Ave, 194/1, Rostov-on-Don, 344104,
пр. Стачки, 194/1, г. Ростов-на-Дону, 344104, [email protected]
Ультрафиолетовое излучение с длиной волны 300—400 нм, составляющее значительную часть ультрафиолетовой компоненты солнечного излучения, обладает генотоксическим эффектом, который частично обусловлен свободнорадикальными механизмами. Эксперименты с использованием батареи генно-инженерных бактериальных биосенсоров показывают, что первичным индуктором окислительного стресса, вызванного УФ-излучением, является перекись водорода.
Ключевые слова: ультрафиолет, биосенсоры, генотоксичность, перекись водорода, суиероксид-анион, окислительный стресс.
Ultraviolet radiation with a wavelength of300—400 nm, which constitutes a significant portion of the ultraviolet component of solar radiation, has genotoxic effects, which is partly caused by free-radical mechanisms. Experiments using the battery of gene-modified bacterial biosensors show that the primary inducers of oxidative stress caused by UV radiation may be hydrogen peroxide.
Keywords: ultraviolet, biosensors, genotoxicity, hydrogen peroxide, superoxide, oxidative stress.
Для разных частей ультрафиолетового спектра характерны различные механизмы генетических эффектов. Энергия квантов излучения с длиной волны ~260 нм и ниже достаточна для формирования циклобутановых димеров, поперечных сшивок, сшивок ДНК-белок. Однако повреждение ДНК способно индуцировать и более длинноволновое излучение, характерное для солнечного света у земной поверхности [1-3]. Генотоксичность УФ-излучения с длиной волны 300-400 нм может быть частично обусловлена свободно-радикальными механизмами. На это указывают данные по протекторному действию антиоксидантов [1, 2, 4]. Прооксидантный эффект ближнего ультрафиолетового излучения был впервые зарегистрирован в экспериментах с бактериями в 2004 г. Гомесом и соавторами [5]. Они показали, что облучение E. coli светом с длиной волны 290^320 нм с пиком 312 нм ведет к индукции Sox-оперона, считающегося «детектором»
внутриклеточной генерации супероксид-аниона. Механизмы выявленного феномена не вполне понятны. Супероксид-анион может образовываться из кислорода при взаимодействии с УФ-излучением таких распространенных биологических хромофоров, как фла-вины [6]. С другой стороны, супероксид-анион образуется как побочный продукт фентоновских процессов при разложении перекиси водорода [7].
Цель нашей работы - исследование механизмов гено-токсичности ультрафиолетового излучения длиной волны 300^400 нм при помощи батареи бактериальных биосенсоров. Использовали тест-системы, предназначенные для детекции внутриклеточного образования супероксид-аниона, перекиси водорода и повреждения ДНК [8].
В работе использованы люминесцентные биосенсоры E. coli AB1157 (pRecA-lux), E.coli MG1655 (pKatG-lux), E.coli MG1655(pSoxS-lux). Эти штаммы содержат плазмиды, в которых Lux-оперон поставлен
под контроль Sox-, Kat- и Rec-промоторов соответственно [8]. Штаммы были любезно предоставлены И.В. Мануховым.
Культуры клеток E. coli растили на полной среде LB [9]. Культивирование бактерий в жидкой питательной среде проводили при постоянной аэрации на круговой качалке при 30 оС. Для выращивания на твёрдой среде использовали LB-агар (LB + 20 г/л микробиологического агара). Как в жидкую, так и твердую среду добавляли ампициллин (100 мкг/мл).
Все химические препараты были аналитической чистоты. Для активации SoxS-промотора использовался паракват (anal. grade, «Sigma»), промотора KatG -перекись водорода 3 % (anal. grade, «Ferrain»).
Клетки культивировали при 28 оС на качалке до ранней или средней логарифмической фазы (OD = =0,2^0,4). Аликвоты этой культуры (по 45 мкл) переносили в стерильные ячейки (находящиеся в стрипах планшета) и добавляли в них по 5 мкл тестируемого вещества требуемой концентрации. В контрольные ячейки добавляли 5 мкл дистиллированной воды.
В экспериментах по изучению возможности опосредованного воздействия на культуру E. coli, обработанной УФ-излучением питательной среды, в стерильные ячейки добавляли по 50 мкл предварительно облученной питательной среды и 50 мкл культуры. Для изучения возможного протекторного действия различных препаратов их вносили в ячейки с 50 мкл культуры за 30 мин перед УФ-облучением.
Планшет с ячейками, объединенными в стрипы, облучали ультрафиолетовым светом с длиной волны 300^400 нм на установке УФ-1, использующей в качестве излучателя ртутную лампу низкого давления (HG-125). Для предотвращения действия жестких компонент излучения в лампе использовано стекло, не пропускающее такие составляющие. Этот факт был проверен при разработке, регулировке и калибровке прибора путем использования светофильтров в виде оптических стекол БК-10, К-8 и обычного оконного стекла (толщиной 1 мм). Указанные материалы имеют соответственно коротковолновую отсечку на 330, 320 и 316 нм [1012]. Проведенные измерения плотности потока мощности дали показания в пределах аппаратной погрешности. Последнее позволило сделать заключение об отсутствии составляющих с X < 300 нм.
Лампа была помещена в фокусе параболического отражающего зеркала, и УФ-поток с целью снижения угла рассеяния передавался к облучаемому объекту через алюминиевую направляющую систему. Это позволило сформировать осесимметричный и равномерный поток излучения на расстояниях от 20 см до 2 м, в котором минимальная площадь облучаемой поверхности составляет 80x80 мм, а неравномерность (при отклонении от оси на 50 мм) не превышала 20 %.
Доза при облучении в течение 1 мин составляла 600 Дж/м2. Облучение производилось в течение разных промежутков времени (1, 10, 15, 30 мин). Измерение биолюминесценции проводилось в течение 200 мин.
После облучения планшет с пробами помещали в люминометр LM-01T_ (Immunotech) и инкубировали 180 мин при 30 °С, через каждые 15 мин измеряя интенсивность биолюминесценции.
Фактор индукции 808-ответа (Г) вычисляли по „ £
формуле I -1, где Ьь, Ье - интенсивности лю-
£к
минесценции контрольной и опытной проб [13].
Признаком достоверности эффекта 808-индукции считали статистически значимое превышение Ье над Ьь. При построении зависимостей доза/эффект использовали максимальное значение коэффициента индукции, достигнутое для данной дозы.
Статистические значимые эффекты индукции свечения зарегистрированы для всех биосенсоров в диапазоне доз исследованного УФ-излучения от 600 до 9000 Дж/м2. Как видно на рисунке, полученные кривые имеют характерную для действия прооксидантов коло-колообразную форму. Максимальные эффекты индукции отмечены для дозы 6000 Дж/м2.
Сходная форма зависимости 8ох-ответа, репортером которого служила Р-галактозидаза (хромотест), была зарегистрирована и в [5].
Максимальный эффект с фактором индукции до 9 (что соответствует 8 при расчете по использованной нами формуле) был зафиксирован ими для дозы 1000 Дж/м2. Различия в чувствительности с нашими результатами объясняются, по-видимому, как особенностями использованных биосенсоров, так и условиями облучения. В [5] облучали культуру биосенсора, распределенную максимально тонким слоем в чашке Петри, мы - в ячейках планшета люминометра, где суспензия бактерий образовывала слой толщиной 2-3 мм, что, возможно, снижало эффективность облучения. Материал чашек Петри и ячеек планшетов люминометра имеет разные отражающие характеристики, что также могло сказаться на эффективности облучения.
Зависимость эффектов от доз при обработке биосенсоров
УФ-излучением с длиной волны 300^400 нм. 1- E.coli MG1655(pSoxS-lux); 2 - E. coli AB1157 (pRecA-lux); 3 -E.coli MG1655 (pKatG-lux)
Резюмируя результаты, представленные на рисунке, можно утверждать, что повреждение ДНК, детектируемое по Rec-индукции, развивается на фоне генерации и супероксид-аниона, и перекиси водорода. Для интерпретации этих данных необходимо учесть, что, хотя перекись водорода является продуктом как ферментативной, так и неферментативной дисмутации супероксидных радикалов, чувствительные к децимикромолярным концентра-
циям перекиси биосенсоры не фиксируют ее образования даже при интенсивной генерации супероксид аниона. В табл. 1 приведены данные по биолюминесценции культур
биосенсоров Мв1655(р8ох8-1их); АВ1157 (рЯесА-1их ) и М01655 (рКа1в-1их) при действии эндогенного генератора супероксид-аниона - параквата.
Таблица 1
Фактор индукции при действии на биосенсоры параквата и перекиси водорода
Индуктор Концентрация, моль/л Фактор индукции
E.coli MG1655 (pSoxS-lux) E.coli MG1655 (pKatG-lux) E. coli AB1157 (pRecA-lux)
Паракват 1-10"3 130,1+4,5* 0,4+0,3** 0
Перекись водорода 0,5-1(Г3 5,9+1,1* 2,5 +0,6* 3,8+0,7*
* - отличия от контроля статистически значимы, р < 0,05 (тест множественных сравнений Даннетта [14]). Здесь и далее величину и стандартную ошибку фактора индукции рассчитывали по данным четырех независимых опытов; ** - ошибку фактора индукции рассчитывали как ошибку результата деления косвенных измерений [15].
Концентрация этого вещества, равная 1 • 10-3 моль/л, вызывает более чем стократное усиление свечения биосенсора с Sox-промотором, в то время как свечение биосенсора с Kat-промотором не отличается от контроля. Данная доза параквата не вызывает и Rec-индукции. При введении в культуры бактерий перекиси водорода наблюдается генерация супероксид-аниона, детектируемая по Sox-индукции, и повреждение ДНК, детектируемое по SOS-индукции. Эти данные позволяют предположить, что свободнорадикальные реакции при действии ближнего ультрафиолетового света запускаются генерацией перекиси водорода либо других органических перекисей.
Для изучения вклада в наблюдаемые эффекты образования перекиси водорода в питательной среде были проведены эксперименты по предварительному облучению среды с последующим добавлением ее к культуре биосенсора. Они показали, что такое воздействие позволяет зарегистрировать индукцию каталазного оперона (табл. 2), но не Sox-индукцию (данные не приводятся). Максимальный коэффициент индукции при обработке клеток биосенсора облученной средой, полученный для дозы 9000 Дж/м2, равен 3,5, что незначительно отличается от максимального уровня Kat-индукции, наблюдающегося при облучении клеток.
Таблица 2
Индукция свечения при обработке биосенсора E.coli MG1655 (pKatG-lux) облученной средой LB
Доза УФ, Дж/м2 Фактор индукции
9 000 3,5 +0,6*
12 000 0,7+0,2*
* - статистически значимый эффект индукции ^-критерий р<0,05), среднее значение и ошибку фактора индукции рассчитывали по данным 4 независимых экспериментов.
Таким образом, перекись водорода, вызывающая повреждение бактериальной ДНК при действии исследованного вида излучения, образуется не только вклетках, но и в окружающей их культуральной среде. По-видимому, генерация перекисей при облучении среды является результатом сравнительно простых реакций, протекающих без участия ферментов, что
Поступила в редакцию_
облегчает исследование химизма данных процессов. Полученные нами результаты позволяют предположить, что наиболее эффективными протекторами от генотоксического действия «солнечного» ультрафиолета могут быть вещества, катализирующие разложение перекиси водорода без образования гидроксиль-ных радикалов либо индукторы/активаторы каталазы неперекисной природы.
Литература
1. Kinetics of DNA strand breaks and protection by antioxi-
dants in UVA- or UVB-irradiated HaCaT keratinocytes using the single cell gel electrophoresis assay / J. Lehmann [et al.] // Mutat Res. 1998. Vol. 2. P. 97-108.
2. Hochberg M., Kohen R., Enk C.D. Role of antioxidants in
prevention of pyrimidine dimer formation in UVB-irradiated human HaCaT keratinocytes // Biomed. Pharmacother. 2006. Vol. 5. P. 233-237.
3. Sensitized formation of oxidatively generated damage to
cellular DNA by UVA radiation / J. Cadet [et al.] // Photochem. Photobiol. Sci. 2009. Vol. 7. P. 903-911.
4. Аллантоин и урат как супрессоры генотоксического
эффекта ультрафиолетового излучения длиной волны 300 - 400 нм / М.А. Сазыкина [и др.] // Экологическая генетика. 2009. Т. 7, № 2. С. 44-46.
5. Does UVB radiation induce SoxS gene expression in Esche-
richia coli cells? // A.A. Gomes [et al.] // Radiat Environ Biophys. 2004. Vol. 43, № 3. P. 219-222.
6. Imlay A. Cellular Defenses against Superoxide and Hydrogen
Peroxide // Ann. Rev. Biochem. 2008. Vol. 77. P. 4.11-4.22.
7. Владимиров Ю.А., Потапенко А.Я. Физико-химические
основы фотобиологических процессов. М., 2006. 285 с.
8. Zavilgelsky G.B., Kotova V.Yu., Manukhov I.V. Action of 1,1-
dimethylhydrazine on bacterial cells is determined by hydrogen peroxide // Mut. Res. 2007. Vol. 634. P. 172-176.
9. Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook J. Molecular Cloning:
a Laboratory Manual. N.Y., 1982. 545 p.
10. Калверт Дж., Питтс Дж. Фотохимия. М., 1968. 671 с.
11. Пейсахсон И.В. Оптика спектральных приборов. Л.,
1970. 270 с.
12. Кикоин И.К Таблицы физических величин. М., 1976. 1008 с.
13. Птицын Л.Р. Биолюминесцентный анализ SOS-ответа
клеток E.coli // Генетика. 1996. Т. 32, № 3. С. 354-358.
14. Гланц C. Медико-биологическая статистика. М., 1998. 460 с.
15. Ацюковский В. А. Философия и методология техниче-
ского комплексирования. М., 2005. 221 с.
27 апреля 2011 г
