CC BY
35
УДК 577.2.04
И. И. Горянин2, В. Ю. Котова2, Е. Д. Краснопеева1,2, П. А. Чубуков1,2,
В. П. Балабанов2, С. Ф. Чалкин?, Т. Я. Шатров3, Г. Б. Завилъгелъский2,
1,2
1 Московский физико-технический институт (государственный университет), Научно-образовательный центр «Вионанофизика»
ФГУП «Государственный НИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов»
3000 «Экон»
Определение генотоксического действия 1,1-диметилгидразина алкилирующими соединениями, возникающими при его окислении, и перекисью
водорода
Проведено исследование механизмов токсического действия 1,1-диметилгидразина (несимметричного диметилгидразина (НДМГ)) на живые системы на примере бактериальной клетки с помощью /ыж-биосепсоров. В настоящей работе были сконструированы гибридные плазмиды, содержащие /ыжСОАВЕ-гепы-репортёры, кодирующие бактериальную люциферазу под контролем стрессовых индуцируемых промоторов. Клетки Escherichia coli, содержащие данные гибридные плазмиды, являются /ыж-биосепсорами. Благодаря полученным /ыж-биосепсорам, специфически детектирующим окислительный стресс, повреждения белков и ДНК, было показано, что основными промоторами, открывающимися при действии на бактериальную клетку НДМГ, являются промоторы PkatG, PcolD (или РгесА) и PalkA. Активация промоторов PkatG, PcolD в присутствии НДМГ определяется перекисью водорода, образующейся в результате восстановления атмосферного кислорода. Показано, что активация /ыж-биосепсора Е. coli MG1655 (рА1кА-/ыж) наступает при появлении в среде продуктов неполного окисления НДМГ (в частности, нитрозодиметиламин), которые являются супермутагенами, схожими по степени генотоксичности с нитрозомочевиной, или .\-moi п. i-.V-mi i ро-.\-нитрозогуанидином.
Ключевые слова: биосенсор, плазмида, люцифераза, промотор, НДМГ.
1. Введение
Несимметричный диметилгидразии (НДМГ, (СНэ^^Щ) входит в группу широко используемых в ракетной технике гидразиновых горючих; в двигательных установках пилотируемых кораблей и автоматических спутников, орбитальных и межпланетных станций, многоразовых космических кораблей. НДМГ обладает сильным токсическим действием, опасен как при ингаляционном и пероральном поступлении, так и при резорбции через кожу.
В настоящей работе для исследования механизмов токсического действия НДМГ на бактериальную клетку используются 1иж-биосенсоры, специфически реагирующие на появление повреждений различных компонентов клетки. £ия:-биосенсор представляет из себя бактериальную клетку Escherichia coli, содержащую гибридную плазмиду, в состав которой встроены два основных элемента: регуляторный участок (промотор и оператор) и ген (гены) репортер. В качестве генов-репортеров используются гены ImiCDABE, изолированные из геномов, светящихся бактерий и кодирующие люциферазу и редуктазу [1]- в качестве регуляторных элементов используются различные индуцируемые промоторы, сформированные в процессе эволюции и специфически реагирующие на наличие в среде определенного вида химического вещества. У бактерий Е. coli можно выделить несколько крупных регулонов, гены которых экспрессируются в результате действия на клетку специфических токсических агентов: SOS — регулон (реакция на повреждение хромосомы (ДНК)), регулон
«теплового шока» (реакция на повреждение белков) и два регулона окислительного стресса (реакция на активные формы кислорода (АФК)) [2,3]. £иж-биосенсоры, сконструированные с применением индуцируемых промоторов, характеризуются как специфичностью, так и высокой чувствительностью, что определяется особенностью взаимодействия белка-рецептора (репрессора или активатора транскрипции) с химическим веществом. Подобные 1иж-биосенсоры широко используются в работах по генетической инженерии и биотехнологии, а также для детекции токсических агентов (мониторинг окружающей среды) [4-7].
Использование комплекса 1иж-биосенсоров, сконструированных на основе индуцируемых ПрОМОТОрОВ 'PkatG: PsoxS, РгесА И РдгрЕ ДЛЯ детвКЦИИ НДМГ В Среде [8], ПОЗВОЛИЛО установить, что генотоксическое действие НДМГ на бактериальную клетку в основном определяется АФК, возникающими при восстановлении атмосферного кислорода [9,10].
В настоящей работе проведено конструирование 1иж-биосенсора для детекции продуктов окисления НДМГ, способных к алкилирующим повреждениям клеточной ДНК (биосенсор основан на промоторе гена alkA). Для исследования механизмов токсического действия НДМГ на бактериальную клетку в настоящей работе применяется комплекс 1их-биосенсоров, основанных на промоторах генов katG, alkA, соЮ и ibpA. Промоторы генов colD и ibpA являются более чувствительными к специфическим токсикантам по сравнению с использованными ранее в работах промоторами РгесА и РдгрЕ [9-11].
2. Методы и материалы Бактериальные штаммы и плазмиды
В работе использовали штамм Escherichia coli К12 MG1655 F-ilvG rfb-50 rph-1.
Плазмиды: pRecA-te, рСоШ-1иж, р1ЬрА-1иж и pKatG-te сконструированы нами ранее [8-11].
Вектор pDW201 [12] получен от Т.К. Van Dvk (США).
Плазмида рА1кА-1иж сконструирована в настоящей работе. ДНК-фрагменты, содержащие промотор PaikA, и соответствующий ему регуляторный участок, были получены при помощи ПЦР-амплификации нуклеотидной последовательности из генома Е. coli К12 MG1655. Создание конструкции pAlkA-lux, содержащей данный фрагмент ДНК, тран-скрипционно слитый с генами-репортерами luxCDABE Photorhabdus luminescens, было проведено в беспромоторном мультикопийном векторе pDW201 с oncoiE и геном-маркером Ыа (резистентность к ампициллину). Сконструированные гибридные плазмиды вводили в клетки штамма Е. coli MG1655. Выделение ДНК-плазмид, рестрикцию, лигирование фрагментов ДНК, трансформацию клеток проводили согласно [13].
Питательные среды и условия роста
Бактерии растили в бульоне Луриа—Бертани (LB), содержащем 100 мкг/мл ампициллина. Клетки растили с аэрацией при 30 °С до ранней экспоненциальной фазы.
Проведение измерений люминесценции
Культуру клеток, содержащих гибридную плазмиду с соответствующим промотором и !иж-кассетой, растили при 37 °С на качалке до ранней или средней логарифмической фазы (OD = 0, 2-0, 4). Аликвоты этой культуры (по 200 мкл) переносили в стерильные впалы и добавляли в них по 10 мкл тестируемого вещества требуемой концентрации. В контрольную пробирку добавляли 10 мкл дистиллированной воды. Затем пробы инкубировали без перемешивания и измеряли интенсивность биолюминесценции при комнатной температуре с использованием высокочувствительного люминометра «Биотокс-7» или планшетного LM-01A (Immunotech). Усиление сигнала фиксировалось уже через 15-20 мин — время, необходимое для синтеза люциферазы. Максимальный ответ биосенсора, как правило, наблюдался через 40-60 мин (в случае промотора РГесА максимальный сигнал фиксировался
через 90 мин) и при оптимальной концентрации токсиканта превышал начальный сигнал в 50-100 раз.
Оценка проводилась на трех параллельных образцах каждого биосенсора с пятикратным повторением опыта.
Ферменты и химические вещества
Все химические препараты были аналитической чистоты. Перекись водорода и этанол были получены из фирмы «Ferraine». Митомицин С, паракват получены от «Sigma Chemical Со». Ферменты для работы с ДНК получены от «Fermentas» (Литва). Все тест-растворы приготовляли непосредственно перед их использованием.
Хромато-масс- спектрометрический анализ
Хромато-масс-спектрометрический анализ продуктов окисления НДМГ проводили на масспектрометре Varian Saturn 2000 с газовой хроматографией на GC 3800 с использованием колонки cp-select 624 СВ. Газ-носитель — гелий. Температурный режим 50 °С, далее после получасовой инкубации нагрев линейно до 100 °С (в течение следующих 20 минут) для проверки чистоты колонки после разделения.
3. Результаты
Для исследования токсических свойств НДМГ была получена батарея 1иж-биосенсоров в результате трансформации бактерий Е. coli MG1655 гибридными плазмидами, содержащими репортёрные гены ImiCDABE Photorhabdus luminescens под контролем индуцируемых промоторов PkatG, pColD, PRecA и PIbpA.
Предполагалось, что использование вышеперечисленных промоторов, два из которых (PcolD и PibpA) не использовались ранее и являются более чувствительными к специфическим токсикантам, приведёт к повышению чувствительности специфических сенсоров к НДМГ. Данные сравнения биосенсоров с вышеприведёнными промоторами показывают, что новый биосенсор Е. coli MG1655 pCoYD-lux открывается с более высокой амплитудой и концентрациями НДМГ на порядок более низкими, чем Е. coli MG1655 pRecA-lux (рис. 1 и 2).
На рисунке 3 приведены данные двух независимых экспериментов по активации 1т-биосенсора Е. coli MG1655 (pKatG-lux) в присутствии свежеразведённого НДМГ и НДМГ, инкубированного в виде 10% раствора в аэробных условиях в течение 16 суток. Как видим, более эффективно происходит активация биосенсора при инкубации клеток с НДМГ, инкубированным в аэробных условиях. НДМГ при концентрации 50 мкг/мл и выше восстанавливает достаточное количество атмосферного кислорода до перекиси, чтобы открыть промотор PkatG уже через 15-25 минут инкубации.
В результате инкубации клеток биосенсора Е. coli MG1655 (р1ЬрА-1иж) в присутствии НДМГ в среде увеличения биолюминесценции не происходит, что свидетельствует о невысоком уровне повреждения белков (данные не представлены).
Токсическое действие НДМГ на живую клетку не ограничивается действием активных форм кислорода, образующихся в процессе окисления НДМГ в аэробных условиях. В процессе окисления образуются также окисленные формы НДМГ, в том числе нитро-зодиметиламин, который является алкилирующим агентом для ДНК. Для исследования алкилирующей активности НДМГ и продуктов его окисления сконструирована гибридная плазмида рА1кА-1иж, в которой гены luxCDABE расположены под контролем индуцируемого промотора гена alkA. Штамм Е. coli MG1655, трансформированный плазмидой pAlkA-lux, является биосенсорным и позволяет тестировать токсические вещества, обладающие способностью к алкилированию ДНК.
3500
3000
? 2500 а
0 -!--------------------------------------------!---------------------!---------------------'----------------------
О 50 100 150 200 250
Время, мин
Рис. 1. Зависимость интенсивности люминесценции te-биосенсора Е. coli MG1655 (pColD-te) от времени инкубации в присутствии НДМГ. Пробы инкубировали без перемешивания при комнатной температуре (на рис. 2-6 условия инкубации клеток те же, что и на рис. 1) pcolk — контрольные клетки (добавлена вода)
cg-1----Ь НДМГ, 500 мкг/мл
cg-2----Ь НДМГ, 50 мкг/мл
cg-З----Ь НДМГ, 5 мкг/мл
+kat-----Ь НДМГ, 500 мкг/мл + каталаза 100 ед/мл
0 Л------------------!------------------!-----------------1------------------!-----------------
0 50 100 150 200 250
Время, мин
Рис. 2. Зависимость интенсивности люминесценции te-биосенсора Е. coli MG1655 (pRecA-lux) от времени инкубации в присутствии НДМГ различных концентраций, preck — контрольные клетки (добавлена вода)
pcolk — контрольные клетки (добавлена вода)
rg-1---Ь НДМГ, 500 мкг/мл
rg-2---Ь НДМГ, 50 мкг/мл
rg-З---Ь НДМГ, 5 мкг/мл
+kat---Ь НДМГ, 500 мкг/мл + каталаза 100 ед/мл
На рисунке 4 представлены данные по активации биосенсора Е. coli MG 1655 (рА1кА-/ш;) продуктами окисления НДМГ, образующимися при обработке НДМГ перекисью водорода. Как видно, при обработке НДМГ перекисью водорода непосредственно перед инкубацией с клетками биосенсора резко возрастает активация а/&Л-промотора, что свидетельствует о появлении генотоксичного продукта окисления НДМГ, алкилирующего ДНК.
На рисунке 5 приведены данные контрольного эксперимента, подтверждающего, что активные формы кислорода (индуцирующие, как показано ранее, РсоШ-промотор) не оказывают влияния на промотор alkA-гена, и не активируют в сходных концентрациях биосенсор Е. coli MG 1655 (рА1кА-/ш;). Как видно из рисунка, перекись водорода может оказать только ингибирующее действие на клетки биосенсора и при больших концентрациях (5 мМ
и выше) не специфически снижает биолюминесценцию.
а)
б)
Рис. 3. Зависимость интенсивности люминесценции /ш;-биосенсора Е. coli MG 1655 (pKatG-lux) от времени инкубации в присутствии НДМГ различных концентраций. Разведения НДМГ были приготовлены непосредственно перед измерениями (а) и после инкубации 10% НДМГ в аэробных условиях 16 суток (б)
pkatk — контрольные клетки (добавлена вода)
kg-І---Ь НДМГ, 500 мкг/мл
kg-2---Ь НДМГ, 50 мкг/мл
kg-3---Ь НДМГ, 5 мкг/мл
На рисунке б приведены данные действия свежеразведённого НДМГ на клетки lux-
биосенсорные Е. coli MG1655 (рА1кА-/ш;). Как видно, даже высокие концентрации НДМГ 50 и 500 мкг/мл не оказывают заметного воздействия на /m’-биосенсор. Максимальная концентрация НДМГ после часа инкубации начинает показывать определённый эффект, что можно связать, по-видимому, с появлением первых продуктов окисления НДМГ атмосферным кислородом. Из рисунка 5 видно, что перекись не индуцирует /m’-биосенсор Е. coli MG 1655 (рА1кА-/ш;) и, следовательно, не индуцирует в ДНК алкилирующих повреждений. Приведённые на рисунке б графики свидетельствуют в пользу того, что неокисленный НДМГ также не оказывает генотоксического действия, связанного со способностью к ал-килированию ДНК.
Как видно из данных, представленных на рисунке 7, максимальное содержание алки-
концентрация перекиси водорода ингибирует люминесценцию клеток биосенсора Е. coli МС1061 (рА1кА-/ш;) (кривая 20 ммоль на рис. 4), следовательно, для измерения алки-лирующего эффекта продуктов окисления НДМГ после подобной обработки необходимо предварительно удалить остаточную перекись водорода с помощью катал азы.
♦ Контроль
♦ 20м моль
♦ Юм моль
♦ 7,5мм оль
♦ 5м моль
♦ 2,5мм оль
♦ 1м моль —Ш— Q 5мм оль
♦ Оммоль
Время, мин.
Рис. 4. Зависимость интенсивности люминесценции te-биосенсора Е. coli MG1655 (pAlkA-lux) от времени инкубации в присутствии НДМГ и перекиси водорода. К клеткам Е. coli MG1655 (pAlkA-lux) добавляли НДМГ 7,5 мМ и различные концентрации окислителя — перекиси водорода (20; 10; 7,5; 5; 2,5; 1; 0,5 мМ). Измеряли люминесценцию образцов в течение 4 часов
Рис. 5. Зависимость интенсивности люминесценции te-биосенсора Е. coli MG1655 (pAlkA-lux) от 22
22
22
alkk — контрольные клетки (добавлена вода)
4. Обсуждение
Гидроперекись и супероксид-ион-радикал могут появляться в процессе окисления НДМГ в результате восстановления кислорода воздуха. О2 + Н^^СНз)2 = О2Н*• (супероксид-анион-радикал) + HNN(CHз)2*, причем супероксид-анион-радикал быстро
переходит в перекись водорода: 2О2Н*• = Н2О2 + О2. Превращение супероксид-анион-радикал а в перекись водорода происходит как спонтанно, так и в результате действия клеточного фермента супероксид-дисмутазы. Активация промоторов Р^^ Рсоїв в присутствии НДМГ определяется образующейся перекисью водорода в результате восстановления атмосферного кислорода, так как обработка суспензии клеток с НДМГ каталазой полностью снимает данный эффект.
Рис. 6. Зависимость интенсивности люминесценции биосенсора Е. coli MG1655 (pAlkA-te) от времени инкубации в присутствии различных концентраций НДМГ. alkk — контрольные клетки (добавлена Н20)
ag-1----b НДМГ, 500 мкг/мл
ag-2----Ь НДМГ, 50 мкг/мл
ag-З----Ь НДМГ, 5 мкг/мл
Рис. 7. Хроматомасс-спекторометрический анализ продуктов окисления НДМГ. ТМТ — тетраме-тилтетразен, НДМА — нитрозодиметиламин, ФДГ — формальдегид диметил гидразон
Однако токсическое действие НДМГ на живую клетку не ограничивается действием активных форм кислорода. В процессе окисления НДМГ образуются промежуточные формы
окисленного НДМГ, в том числе нитрозодиметиламин, который является алкилирующим агентом для ДНК. Восстановления атмосферного кислорода с помощью НДМГ с образованием перекиси водорода достаточно, чтобы возник БОБ-ответ клетки, в первые часы инкубации в растворе с НДМГ (рис 1). Если происходит более глубокое окисление НДМГ в присутствии добавленной перекиси водорода, образуются продукты окисления НДМГ, которые охарактеризованы как при помощи 1иж-биосенсора (рис. 4), так и с помощью хроматомасс-спектрометрии (рис. 7). Показано, что продукты окисления НДМГ перекисью водорода обладают высокой алкилирующей способностью и вызывают активацию Ра^-промотора (рис. 4).
Полученные данные свидетельствуют о том, что в случае неполного окисления НДМГ появляются промежуточные соединения (в частности, нитрозодиметиламин), которые являются супермутагенами аналогично нитрозомочевине или Х-мегил-Х'-ии гро-Х-нитрозогуанидину. Максимальная амплитуда ответа биосенсора наблюдается при эквимо-лярных концентрациях НДМГ и перекиси водорода. Перекись водорода не вызывает индукцию Ра^-промотора. При высоких концентрациях Н2О2 следует учитывать гибель клеток, которая приводит к уменьшению наблюдаемой индукции.
Использованные в данной работе биосенсорные штаммы, основанные на индуцируемых промоторах РкаЮ: РсоЮ и Ра1кА, применимы для детекции НДМГ в работах по экологии. В подобных работах для контроля общей токсичности при детекции НДМГ следует использовать биосенсор с 1иж-генами, расположенными под конститутивным промотором, например
ПОД Р1ас.
Исследования поддержаны ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» № 14.740.11.0626, № 14.U01.21.0845, № 14.А18.21.0186, № 14.А18.21.0209 и № 14.А18.21.2009.
Литература
1. Meighen Е.А. Molecular biology of bacterial bioluminescence // Microbiol. Rev. — 1991. _ у. 55. _ p. 123-142.
2. Gaudu P., Moon B., Weiss B. Regulation of the soxRS oxidative stress regulon. Reversible oxidation of the Fe-S centers of SoxR in vivo // J. Biol. Chem. — 1997. — V. 272. — P. 5082-5086.
3. Storz G., Imlay J. A. Oxidative stress // Curr. Opin. Microbiol. — 1999. — V. 2. — P. 188— 194.
4. Galluzzi L., Karp M. Whole cell strategies based on lux genes for high throughput applications toward new antimicrobials // Comb. Chem. High Throughput Screen. — 2006. V. 9. - P. 501-514.
5. Gu М. B., Mitchell R. J., Kim В. C. Whole cell-based biosensors for environmental biomonitoring and application // Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. — 2004. — V. 87. — P. 268-305.
6. Vollmer C. A., Van Dyk Т. K. Stress responsive bacteria: biosensors as environmental monitors // Adv. Microb. Physiol. - 2004. - V. 49. - P. 131-174.
7. Патент США № 5683868, C12Q1/68.
8. Завильгельский Г. В., Котова В. Ю., Манухов И. В., Кондратьев А. Д., Самброс В. В., Шатров Я. Т., Чалкин С. Ф. Комплекс lux-биосенсоров на основе бактерий Escherichia coli, используемый в качестве индикатора при биотестировании НДМГ: патент РФ № RU(ll) 2 297 450(13) C2.
9. Манухов И. В., Балабанов В. П., Котова В.Ю., Хрульнова С. А., Мелькина О.Е., Крайнов А. А., Пустовойт К. С., Кречетов П.П., Королёва Т. В., Шатров Т. Я.,
Чалкин С.Ф., Завильгельский Г. Б. Использование lux-биосенсоров для детекции НДМГ в почве // Двойные технологии. — 2008. — Т. 44(3). — С. 50-56.
10. Zavilgelsky G.B., Kotova V.Yu., Manukhov I. V. Action of asymmetric 1,1-dimethylhvdrazine on bacterial cells is determined by hydrogen peroxide // Mutation Research. - 2007. - V. 634(1-2). - P. 172-176.
11. Манухов И. В., Котова В. Ю., Завильгельский Г. Б. Lux-биосенсоры для детекции SOS-ответа, теплового шока и окислительного стресса // Биотехнология. — 2009. — № 6. —
С. 16-25.
12. Van Dyk Т.К., Majarian W.R., Konstantinov К. В., Young R.M., Dhurjati P.D., LaRossa E.A. Rapid and sensitive pollutant detection by induction of heat-shock gene -bioluminescence gene fusion // Appl. Environ. Microbiol. — 1994. — V. 60. — P. 14141420.
13. Maniatis Т., Fritsch F., Sambrook J. Molecular cloning: A laboratory Manual. — Cold Spring Harbor. N.Y.: Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989.
Поступим в редакцию 04-10.2012.
