CC BY
21
DOI 10.31588/2413-4201-1883-240-4-71-75
УДК 539-022.532:539.2:575.224.4
ОЦЕНКА БИОБЕЗОПАСНОСТИ ПОЛИФУНКЦИОНАЛЬНОГО ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ НАНОРАЗМЕРНОГО БЕНТОНИТА В БАКТЕРИАЛЬНЫХ ТЕСТАХ
Дегтярева И.А. - д.б.н., Ежкова А.М. - д.б.н., Прищепенко Е.А. - к.с/х.н., Яппаров И.А. - д.б.н., Мотина Т.Ю. - к.б.н., *Бабынин Э.В.- к.б.н.
Татарский НИИАХП - обособленное структурное подразделение ФИЦ КазНЦ РАН ФГАОУ ВО «Казанский (Приволжский) федеральный университет»
Ключевые слова: агроминералы, наноразмерный бентонит, биобезопасность, мутагенность, тест Эймса, SOS-lux тест
Keywords: agrominerals, nanoscale bentonite, biosafety, mutagenicity, Ames test, SOS-lux
test
Одними из перспективных для разработки безопасных материалов нового поколения являются природные агроминералы, в частности, бентонитовые глины, которые обладают уникальными каталитическими, ионообменными и сорбцион-ными свойствами. В их составе содержится широкий спектр макро- и микроэлементов в форме биологически активных природных соединений, свободно доступных для микроорганизмов, растений и животных. Поэтому бентониты можно использовать в качестве удобрений, мелиорантов, сорбентов. Запасы бентонитовых глин на территории России составляют 810 млрд т, в Республике Татарстан - 120 млн т.
Модификация бентонитов с применением методов нанотехнологий позволяет изменить или многократно усилить их известные свойства, что открывает большие возможности для разработки новых высокоэффективных материалов [4]. Несмотря на имеющиеся исследования показателей безопасности наноразмерных и нанострук-турных минералов, их мутагенные и антимутагенные свойства изучены недостаточно. Наиболее информативными, быстрыми и удобными в использовании для оценки мутагенных свойств соединений являются тесты с использованием микроорганизмов - тест Эймса, SOS-lux тест, umu тест и др. [1].
У многих бактерий, включая Salmonella и Escherichia coli, в ответ на повреждение ДНК или остановку репликации ДНК, активируется SOS-ответ, генетиче-
ская система, которая позволяет бактериям увеличивать толерантность к повреждениям ДНК и проводить репарацию [7]. Экспрессия SOS-генов достигается в результате авторазрезания LexA под действием активированного ДНК повреждениями RecA белка. Активация SOS-ответа сопровождается повышением мутагенеза, поскольку ДНК полимеразы DinB (Pol IV) и UmuD2C (Pol V), входящие в SOS-регу-лон, осуществляют репликацию с высокой частотой мутаций. Индукция SOS-ответа является ответом клетки на ДНК-повре-ждающую активность соединений, и потому может использоваться как показатель их мутагенной активности. Все это делает биосенсорные клетки удобным объектом для изучения механизмов индуцибельных процессов при действии ДНК-поврежда-ющих факторов различной природы.
Целью настоящей работы является тестирование наноразмерного бентонита на наличие или отсутствие у него мутагенной активности, а также выявление его антимутагенных свойств в отношении различных соединений.
Материал и методы исследований. Мутагенную активность наноразмер-ного бентонита исследовали с помощью теста Эймса [6] с использованием индикаторных штаммов Salmonella typhimurium TA100 (генотип hisG46 rfa uvrB/pKM101) и S. typhimurium TA1538 (генотип hisD3052 rfa uvrB). Ночную культуру S. Typhimurium (109 кл./мл) в 0,015 М фосфатном буфере (рН 7,4) инкубировали с тестируемым соединением в различных концентрациях (от
0,4 до 200,0 мкг/мл) при 37°С 90 мин без встряхивания. После инкубации в пробирки добавляли 2,5 мл расплавленного верхнего агара (0,6% агара, 0,6% NaCl, 0,05 мМ L-гистидина, 0,05 мМ биотина, рН 7,4 при 45°С), смесь наносили на минимальную агаризованную среду (1,5 % агара, среда Фогеля-Боннера, содержащая 2,0% глюкозы) и инкубировали при 37°С в течение 66 ч. После этого подсчитывали число колоний His+-ревертантов, выросших на поверхности агара. В качестве позитивного контроля использовали этил-ме-тансульфонат (ЭМС) для штамма TA100 и 2,4-динитрофенилгидразин - для штамма ТА1538. Согласно методике, мутагенной считается концентрация тестируемого вещества, при которой число ревертантов в опыте будет выше контрольных значений более чем в 2 раза. Эксперименты проводили в трех повторностях.
Для оценки антимутагенного эффекта в тесте Эймса наноразмерный бентонит и мутаген вносили в верхний агар одновременно. Позитивный и негативный контроли были включены в каждом анализе.
Антимутагенный эффект менее 25,0% считается слабыми и не рассматривается в качестве положительного результата. Антимутагенный эффект можно считать умеренным, когда ингибирующий эффект составляет 25,0-40,0 %, и сильным, когда он более 40,0% [5].
Индукцию SOS-ответа определяли в SOS-lux тесте [2] с использованием индикаторного штамма S. Typhimurium TA1535/pDEW238, способного к биолюминесценции, в ответ на ДНК-поврежда-ющие агенты. Штамм получен в результате трансформации штамма S. typhimurium ТА1535 плазмидой pDEW238, которая содержит luxCDABE - оперон под контролем recA промотора. Плазмида предоставлена Rachel Rozen (The Hebrew UniIersity of Jerusalem, Jerusalem 91904, Israel). Ночную культуру штамма, выращенную в питательном бульоне с ампициллином (100,0 мкг/мл), разделяли на пробирки и добавляли в каждую раствор наноразмерного бентонита в различных концентрациях. В качестве позитивного
контроля использовали митомицин C [3]. Через каждый час по 0,1 мл культуры переносили в микропланшеты и определяли интенсивность биолюминесценции с помощью микропланшетного ридера Infinite F200 Pro, Tecan (Австрия). Для каждой концентрации в каждой точке времени брали три пробы. Интенсивность биолюминесценции измеряли в относительных световых единицах (Relative Light Units, RLU), рассчитанных как число световых единиц в секунду, деленное на оптическую плотность клеточной культуры (OD) при 550 нм.
Результаты исследований. Изменение формы и размеров частиц бентонита Тарн-Варского месторождения Республики Татарстан в фазе нанодисперсии позволило предположить, что он изменяет физические свойства, а это настоятельно диктует необходимость изучения показателей безопасности применения, в частности, требует оценки их мутагенной активности.
Штаммы, используемые в тесте Эймса, имеют мутации в генах гистидино-вого оперона, в результате чего бактерии не могут расти на среде без гистидина. Присутствие мутагенного агента может вызвать обратные мутации и привести к появлению прототрофных ревертантов. Штамм TA100 содержит мутацию замены пары оснований в гене hisG, что ведет к аминокислотной замене лейцина на про-лин. Штамм TA1538 имеет делецию одной пары оснований в гене hisD, что вызывает мутацию типа сдвига рамки считывания. Это приводит к изменению двух аминокислот и появлению стоп-кодона внутри гена. Для реверсии к His+-фенотипу у этих штаммов необходимы различные молекулярные изменения в гене. Поскольку различные мутагены могут оказывать свое влияние на ДНК через различные механизмы, то использование штаммов, содержащих различные мутации, позволяет определить мутагены, которые имеют различное влияние на ДНК.
Согласно полученным данным в тесте Эймса с использованием штамма S. typhimurium TA100, наноразмерный бентонит в исследуемом диапазоне концентраций не повышал частоту мутаций замены
пар оснований. При оценке влияния нано-размерного бентонита на частоту мутаций, индуцированных ЭМС, тестируемое вещество показало достоверное снижение числа индуцированных мутантов при концентрации 4,0 мкг/мл. Процент ингибирования мутагенной активности для ЭМС составил 31,0%.
Наноразмерный бентонит не вызывал повышения частоты мутаций типа сдвига рамки считывания у штамма S. typhimurium TA1538. Антимутагенный эффект наноразмерного бентонита в отношении 2,4-динитрофенилгидразина зависел от концентрации тестируемого соединения в среде и был более выраженным. Процент ингибирования мутагенной активности при концентрации 4,0 мкг/мл в этом случае составил 62,0 %. Полученные в тесте Эймса результаты показали, что нанораз-мерный бентонит не обладает мутагенными свойствами, а, напротив, оказывает антимутагенный эффект в отношении используемых мутагенов.
ДНК-повреждающую активность наноразмерного бентонита оценивали с помощью SOS-lux теста. Полученные результаты Данные о влиянии нанобенто-нита на интенсивность биолюминесценции штамма S. typhimurium TA1535/pDEW238 на пятый час указывают на то, что он не обладает ДНК-повреждающими свойствами, что согласуется с данными, полученными с помощью теста Эймса.
Для анализа антимутагенных свойств наноразмерного бентонита в качестве одного из индукторов SOS-ответа использован офлоксацин, который является антибиотиком группы фторхинолонов II поколения. Нанобентонит оказывал достоверное подавление действия офлоксацина только при высоких концентрациях 100,0 и 200,0 мкг/мл.
Установлено, что наноразмерный бентонит не оказывал влияния на мутагенез, вызванный окислительным стрессом под действием перекиси водорода. Полученные результаты позволяют предположить, что нанобентонит не влияет на механизм активации генов SOS-ответа напрямую, а, скорее, выступает в качестве сорбента токсичных веществ, снижая их
воздействие на клетки. Таким образом, наноразмерный бентонит показал наличие антимутагенных свойств, предположительно через механизм сорбции, для 2,4-динитрофенилгидразина, этилметансуль-фоната и митомицина С.
Заключение. У наноразмерного бентонита определена безопасность применения с использованием бактериальных тест-систем. В тесте Эймса и SOS-lux тесте у наноразмерного бентонита установлено отсутствие мутагенных и генотоксичных свойств. Воспроизводимость результатов подтверждается в обоих тестах. Необходимо особо отметить, что для мутагенов -2,4-динитрофенилгидразина, этилметан-сульфоната, митомицина С - наноразмер-ный бентонит показал наличие антимутагенных свойств.
Следовательно, отсутствие геноток-сичности и антимутагенный эффект нано-размерного бентонита позволяют рекомендовать его для широкого применения в различных областях народного хозяйства.
ЛИТЕРАТУРА:
1. МУ 1.2.2634-10. Микробиологическая и молекулярно-генетическая оценка воздействия наноматериалов на представителей микробиоценоза. М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспо-требнадзора, 2010.
2. Alhadrami, H.A. Validation of SOS-lux Microbial Biosensors for Mutagenicity Assessment: Mitomycin-C as a model compound / H.A. Alhadrami, G.I. Paton // Biosensors and Bioelectronics. - 2013. - № 4. - Р. 142.
3. Davidov, Y. Improved bacterial SOS promoter∷ lux fusions for genotoxicity detection / Davidov Y., Rozen R., Smulski
D.R., et al. // Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. - 2000. - V. 466 (1) . - Р. 97-107.
4. Degtyareva, I.A. Production of Nano-Bentonite and the Study of Its Effect on Mutagenesis in Bacteria Salmonella typhimurium / Degtyareva, I.A., Ezhkova A.M., Yapparov A.Kh., Yapparov I.A., Ezhkov V.O., Babynin
E.V., Davletshina A.Ya., Motina T.Yu., Yapparov D.A. // Nanotechnologies in Russia. -2016. - Vol. 11. - Issue 9-10. - Р. 663-670.
5. Evandri, M.G. The antimutagenic activity of Lavandula angustifolia (lavender) es-
sential oil in the bacterial reverse mutation assay / Degtyareva, I.A., Ezhkova A.M., Yapparov A.Kh., Yapparov I.A., Ezhkov V.O., Babynin E.V., Davletshina A.Ya., Motina T.Yu., Yapparov D.A. // Food Chem. Toxicol. - 2005. - V. 43(9) . - P. 1381-1387.
6. Mortelmans, K. The Ames Salmonella microsome mutagenicity assay / Mortelmans
K., Zeiger E. // Mutat. Res. 2000. - № 455(1-2) . - P. 29-60.
7. Sutton, M.D. The SOS response: recent insights into umuDC-dependent mutagenesis and DNA damage tolerance / Sutton M.D., Smith B.T., Godoy V.G., Walker G.C. // Annu Rev. Genet. - 2000. - № 34. - P. 479497.
ОЦЕНКА БИОБЕЗОПАСНОСТИ ПОЛИФУНКЦИОНАЛЬНОГО ПРЕПАРАТА НА
ОСНОВЕ НАНОРАЗМЕРНОГО БЕНТОНИТА В БАКТЕРИАЛЬНЫХ ТЕСТАХ
Дегтярева И.А., Ежкова А.М., Прищепенко Е.А., Яппаров И.А., Мотина Т.Ю., Бабынин Э.В.
Резюме
Представлен материал о получении наноразмерного бентонита и оценке эффектов, вызванных им на мутационный процесс у штаммов Salmonella typhimurium. Установлено, что по структуре, размерам и формам частиц наноразмерный бентонит существенно отличался от бентонита. Частицы бентонита имели конусовидную форму и размеры от 0,3 до 1,0 мкм, наноразмерного бентонита - овально-выпуклую форму и размеры частиц от 25 до 95 нм, единичные частицы (менее 10,0 %) имели размер 0,6 мкм и форму неправильных многогранников. Структура бентонита представлена отдельными фрагментами составляющих минералов, содержащих пакеты-ламелии размером 0,6 мкм, сцементированных аморфной массой. В структуре наноразмерного бентонита отмечали аморфную массу и единичные пакеты-ламелии микрометрового диапазона. Установлено, что наноразмерный бентонит не обладает мутагенной активностью в отношении микроорганизмов. Оценка антимутагенного потенциала наноразмерного бентонита показала, что он оказывает умеренное ингибирующее действие на мутагенез, вызванный митомицином С, 2,4-динитрофенилгидразином и этилметансульфонатом, на генотоксичный потенциал перекиси водорода эффекта не обнаружено. Полученные результаты демонстрируют отсутствие генотоксичности наноразмерного бентонита, который может быть использован для разработки безопасных материалов нового поколения на основе методов нанотехнологий.
BIOSAFETY ASSESSMENT OF MULTIFUNCTIONAL DRUG BASED ON NANO-BENTONITE IN THE BACTERIAL TESTS
Degtyareva I.A., Ezhkova A.M., Prishchepenko E.A., Yapparov I.A., Motina T.Yu., Babynin E.V.
Summary
The article presents the material on the preparation of nanoscale bentonite and evaluation of the effects caused by it on the mutation process in strains of Salmonella typhimurium. It was found that the structure, size and shape of the particles of nanoscale bentonite differed significantly from bentonite. Bentonite particles had a conical shape and sizes from 0.3 to 1.0 цт, nanoscale bentonite - oval-convex shape and particle sizes from 25 to 95 nm, single particles (less than 10.0 %) had a size of 0.6 цт and the shape of irregular polyhedra. The structure of bentonite is represented by individual fragments of the constituent minerals containing packages of lamelee 0.6 цт, cemented with an amorphous mass. In the structure of the nanoscale bentonite is noted amorphous mass and single packs of lamelee micrometer range. It is established that nanoscale bentonite does not have mutagenic activity against microorganisms. Evaluation of the antimutagenic potential of nanoscale
bentonite showed that it has a moderate inhibitory effect on mutagenesis caused by mitomycin C, 2,4-dinitrophenylhydrazine and ethylmethansulfonate, and no effect was found on the genotoxic potential of hydrogen peroxide. The obtained results demonstrate the absence of genotoxicity of nanoscale bentonite, which can be used to develop safe materials of a new generation based on nanotechnology methods.
DOI 10.31588/2413-4201-1883-240-4-75-80 УДК 619:616.9
КИШЕЧНЫЕ ГЕЛЬМИНТОЗЫ И ПРОТОЗООЗЫ У ВИЧ-ИНФИЦИРОВАННЫХ ПАЦИЕНТОВ
Долбин Д. А. - к.б.н., *Лутфуллин М.Х. - д.в.н., профессор, Тюрин Ю.А. - к.м.н.
ФГБОУ ВО «Казанский государственный медицинский университет» *ФГБОУ ВО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана»
Ключевые слова: Кишечные гельминтозы, протозоозы, антиретровирусная терапия,
ВИЧ
Keywords: Intestinal helminthiases, protozoa, antiretroviral therapy, HIV
Необходимо отметить, что инфекционные процессы желудочно-кишечного тракта представляют одну из существенных проблем при лечении ВИЧ-инфицированных пациентов. Как правило, ВИЧ-инфекция часто бывает ассоциирована с несколькими оппортунистическими кишечными паразитарными инвазиями, которые могут приводить к хронической диареи.
Как правило (но далеко не всегда), для диагностики паразитарной инвазии бывает достаточно проведение гельминто-овоскопических лабораторных исследований фекалий.
Необходимо отметить, что данных о инвазированности кишечными гельминтами ВИЧ-инфицированных пациентов, получающих АРВТ, недостаточны. Есть предположения, что инвазия кишечными паразитами снижается у пациентов с назначенной АРВТ. Основные механизмы этого эффекта не вполне ясны. Есть предположение исследователей, что эффект от АРВТ, так и профилактический курс назначения котримоксазола может снижать риск инвазированности кишечными гельминтозами и протозоозами у этой категории пациентов [1, 2, 3]. К сожалению, эти исследования не были хорошо разработаны для решения конкретного эффекта АРВТ на процессы инвазии кишечными гельминтами. Возможно этот эффект мо-
жет быть обусловлен общим побочным действие большинства антиретровирусных препаратов - митохондриальной токсичностью. Эти препараты, также как антигель-минтные препараты, воздействуют на митохондрии гельминтов [4]. Отмечено, что наибольшей митохондриальной токсичностью из антиретровирусных препаратов обладает ставудин [5]. Возможно, токсический эффект нуклеотидных аналогов, применяемых в качестве антиретровирусных препаратов опосредуется через множественные митохондриальные пути, инги-бирование гамма-ДНК-полимеразы [6].
Цель настоящего исследования состояла в выборочной оценке распространённости кишечных гельминтозов и про-тозоозов, характерных для ВИЧ-инфицированных пациентов и проверке предварительной гипотезы влияния АРВТ на распространённость кишечных гельминтов.
В качестве основной гипотезы, предположили, что АРВТ может быть ассоциирована с меньшим риском заражения кишечными гельминтами, в качестве альтернативной гипотезы, назначение АРВТ не влияет на распространённость кишечных гельминтозов и протозоозов у этих пациентов.
Материал и методы исследований. За период с 2012-2015 гг. годы совместно с ГАУЗ «Республиканский Центр
